酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

サマリー

このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro 試験での直接使用を可能にする高収量・高純度の製剤を可能にします。

要約

膵島は臨床膵島移植および糖尿病のメカニズムと進行を理解するための前臨床研究の両方に不可欠です。しかし、これらの分野の進展は、高品質なアイレットの利用可能性によって制限されることが多いです。なぜなら、新興の治療戦略はより大きく、清潔で標準化された製剤を必要としているからです。本記事では、ルイスラットからの膵島の外科的収穫、酵素消化、密度勾配精製のための高スループットで標準化されたプロトコルを提示します。この方法は、導管内膵臓の灌流と定義された酵素混合物、複数の膵臓のプール消化、密度に基づく分離を組み合わせ、収量を最大化しつつ断片化を最小限に抑え、定期的な手摘みの必要性を排除します。アイレット収量は、臨床現場で一般的に用いられる伝統的なアリコットベースのカウント法と、半自動化の全調製画像法という2つの補完的な手法で定量化されます。12個の膵臓から代表的な分離をしたところ、手作業で数えると膵臓あたり約3,300個のアイレット換算(IEQ)と2,700個の絶対アイレット(合計約39,600個、合計約39,600個、合計約39,600個、合計約39,600個、サイズ分布は62%(50-100μm)、17%(100-150μm)、10%(150-200μm)、5%(200-250μm)、6%(>250μm)でした。比較すると、全調製の自動解析では16,350の総 IEQ(膵臓あたり1,362 IEQ)が報告され、アリコットに基づく定量の本質的なばらつきが浮き彫りになりました。ディチゾン染色による製剤の純度は98%で、分離後3日目と7日目にはアイレットの生存率が98%のin vitro で維持されました。静的グルコース刺激インスリン分泌による機能評価では、1時間刺激後のインスリン放出が10倍増加することが示されました。全体として、このプロトコルは、追加のクリーンアップなしで即座に使用できる、高純度で機能的に完全なアイレット製剤を生成する再現性と効率的なアプローチを提供します。アイレットは培養中で最大7日間強健な機能を保ち、大規模な in vitro アッセイや in vivo 移植研究の柔軟性を可能にします。

概要

膵島移植は、1型糖尿病(T1D^)の個人における内因性インスリン産生を回復するための有効な戦略です。T1Dを超えて、膵島生物学は進行性のβ細胞機能障害と喪失を特徴とする2型糖尿病(T2D)や、慢性膵炎、膵腫瘍、外傷性損傷のために部分的または全膵切除術を受ける患者にもますます関連しています。これらの文脈では、高品質なアイレットへのアクセスは、細胞療法の進展、β細胞機能不全のモデル化、アイレット免疫およびアイレット間質相互作用の研究、そして新たな再生的アプローチの開発に不可欠です^。したがって、堅牢な再現性のあるアイレット分離手順は、幅広い膵臓内分泌疾患における機構的研究とトランスレーショナル開発の両方を支援する上で極めて重要です。

膵島は膵臓の質量の2%未満を占めますが、グルコース恒常性において不釣り合いに重要な役割を果たします。低酸素、酵素による過剰消化、酸化ストレス、機械的せん断に対する本質的な脆弱性により、孤立関連の損傷に特に敏感^です。温度、酸素供給、組織取り扱いの微細な偏差でも、抗酸化防御力の制限と高い^{代謝要求のために}β細胞刺激-分泌結合を損なったり、アポトーシスを引き起こしたり^{する可能性があります。}その結果、ほとんどの従来プロトコルは、臨床および^実験の場面8,9,10,11,12において、収穫から24〜48時間以内の迅速な下流使用を重視しています。この「即時使用」フレームワークは劣化を最小限に抑える一方で、実験の柔軟性を制限し、縦断的研究を妨げ、大規模なin vitroアッセイやin vivo移植実験のために十分なアイレット数を蓄積する努力を複雑にします。

齧歯類モデルの中では、ルイスラットは近親交配の遺伝的背景、安定した免疫プロファイル、再現性のある生理的特徴により、アイレット研究に広く利用されています¹⁴。ひずみ依存的なアイレット収縮、応答性、回復力の違いはよく記録されています。De Grootらは、ルイスラットのアイレットが他の株と比較して優れたグルコース刺激インスリン分泌を示し、機能的、代謝的、移植研究に適していることを示しました¹⁵。追加の研究により、免疫学的および異種/異種移植研究における信頼性が確認されています14,15,16。しかし、各研究所では、アイレット収量、純度、機能のばらつきが依然として大きな障壁となっています。この変動の多くは、酵素ブレンド、管内灌流技術、膵臓の取り扱い、消化タイミング、精^製戦略の不一致に起因します。

これらの制限に対処するため、ルイスラットの膵島の外科的収穫、酵素消化、密度勾配精製のための再現可能で段階的なプロトコルを開発しました。このワークフローは、収量を最大化し、断片化を最小限に抑え、機能的な生存可能性を維持するために最適化されています。重要なのは、アイレット当量(IEQ)、時間経過の生存可能性、純度、グルコース刺激インスリン分泌など明確なベンチマークを設定し、研究者が成功した分離株と最適でない分離株を確実に区別できるようにしている点^{です(18,19,20})。収量と寿命の両方を向上させることで、このプロトコルは実験の柔軟性を高め、必要なドナー動物の数を減らし、より倫理的でスケーラブルな実験設計を支援する可能性があります。

多くの従来の手法とは異なり、本手法はルイスラットのアイレットが最大7日間培養中保存され、生存性と機能が維持できることを示し、長期 のin vitro 研究への有用性を拡大しています。さらに、このプロトコルは最大30個の膵臓を1回のバッチで処理できる効率的なプール処理戦略を取り入れており、均一な消化とサンプル間変動の低減を実現しています。内分泌純度が98%に達することで、手作業の手作業が不要となり、微生物汚染の機会も減らします。不純物や機械的に妥協されることが多い単一段階またはバルク消化法と比較して¹³、この高スループットワークフローは、 in vitro アッセイ、代謝プロファイリング、in vivo 移植研究に適したクリーンで移植品質のアイスレットを大量に確実に生成します。

プロトコル

すべての処置はヒューストン・メソジスト施設動物ケア・利用委員会(IACUC、プロトコル #IS00007362)によって承認され、国立衛生研究所の実験動物ケア・利用ガイドおよび動物福祉法に従って実施されました。
注:プロトコル全体で使用される材料や器具は「 材料表」で確認できます。

1. 収穫および隔離日前の準備

1. 以下の溶液はバイオセーフティキャビネット内で無菌条件下で準備し(表 1参照)、すべての溶液は使用まで4°Cで保存してください。
   ペニシリン-ストレプトマイシン洗浄液(ペンストレプ菌)。
   洗うメディア。
   消火バッファー。
   アイレット文化メディア。
   クレブスバッファ。
2. 工具や機器はオートクレーブで滅菌します。
   1. オートクレーブ膵臓採取手術用パック:手術用カーテン、ガーゼ、ラットトゥース組織鉗子、平らな鉗子、細かい湾曲鉗子、皮膚はさみ1本、微小解離ハサミ1本、小型止血鉗子2本、曲面止血鉗子1本。
      注意:手術用パックを2つの膵臓で採取する場合は、オートクレーブしてください。
   2. オートクレーブ膵臓洗浄手術用パック:細かい湾曲型鉗子と微小解離用のハサミ。
   3. 30cm×30cmのアルミホイルを1枚オートクレーブします。
   4. 処理する膵臓の数に応じて、600mLのオートクレーブ1〜6枚とビーカー1枚(表 2参照)を用います。
   5. 500μmの篩を1つオートクレーブしてください。
   6. 14Gの脊椎針を2本のオートクレーブ消毒し、未消化の膵臓組織が詰まっている場合に備えてください。
   7. 50 mL注射器1本ごとに1本のシリンジチューブをオートクレーブしてください( 表3参照)。
3. 消化のために水浴を準備します。
   1. 軌道用シェーカーを備えた水浴槽に、オートクレーブされた超純水をプラットフォームの高さから3/4インチ上まで満たします。
   2. 抗菌液3mLを加え、蓋を閉じて汚染を最小限にします。

2. 収穫と隔離日の準備

1. グラデーションシリンジを用意してください。
   1. 4°Cの貯蔵から、次の工程および「アイレット浄化」ステップ5.2で使用した1.108 g/cm³、1.096 g/cm³、1.069 g/cm³のイレット勾配溶液を取り出し、室温(約1時間)に平衡させます。
      注意:必要な勾配量は処理される膵臓の数によって異なります。選定勾配の解凍体積を確保するために 表3 を参照してください。
   2. 50 mL注射器には1.096 g/cm³および1.069 g/cm³の勾配で予備装填しラベルを貼ります。
      1. 1.069 g/cm³ と 1.096 g/cm³ の密度勾配溶液を激しく混ぜます。
      2. 表3に応じて適切な量を、手術用チューブと16Gの針を装着した50 mLのシリンジに注入します。
      3. 充填後、針にキャップをして無菌性を維持し、注射器は「アイレット浄化」ステップ5.5で使用するために脇に置きます。
   3. 室温で1.108 g/cm、³ 勾配を後で使用するまで保管してください。
2. 作動解離培地(WDM)酵素溶液を作り、灌流用の注射器とオートクレーブビーカーに注入します。
   1. バイオセーフティキャビネットで無菌状態で作業し、すべての溶液を氷の上に保管してください。
   2. コラーゲナーゼ、サーモリシン、DNase Iのアリコートを氷で溶かします。
   3. 酵素試薬を無菌1リットルビーカーでWDMで希釈し、最終濃度を得ます:コラーゲン酵素0.15 mg/mL、サーモリシン5 μg/mL、DNase I 0.1 mg/mL(表2)。
   4. WDMを10回ほど優しく混味します。ピペットで混ぜないでください。酵素の活性を優しく渦巻かせて維持します。
   5. 16Gの針を使って10mLの10mLシリンジにWDM酵素溶液を1つずつ注入し、その後、後の膵臓灌流用にキャップ付きの25G X 1/2インチの針に交換します。
   6. 注入済みの注射器はオートクレーブアルミホイルで包み、氷の上に置いて使用します。
   7. 表2に従い、余剰WDMを均等に無菌600mLビーカーに分散し、採取した膵を保持します。各ビーカーを滅菌アルミホイルで覆い、氷の上に保管してください(表2)。
3. 細胞培養作業場を準備しろ。
   1. 軌道水浴シェーカーを130rpm、37°Cに設定して起動します。 膵臓摘出の間はそのままにしておきましょう。
   2. 以下のアイテムをバイオセーフティキャビネットのUVライトの下に1時間置き、さらなる滅菌を行います。
      滅菌500μmの篩。
      滅菌1リットルのビーカー。
      注射器ポンプ。
   3. 細胞培養インキュベーターは25°C、5%_{CO2に設定されていることを確認してください。}
   4. 遠心分離機を4°Cに設定し、加減速は9°Cに設定します。
4. 採取用の材料を集めて手術室へ向かえ。
   1. 指定された膵臓クリーナー:
      1. 必要な数の600 mL WDMビーカーと膵臓洗浄液を入れるための大きな氷バケツを1つ集めます( 表1 および 表2参照)。
      2. 膵臓6個ごとに無菌ペトリ皿1個を集めて処理してください。
      3. 滅菌マイクロハサミ1本と小さく曲がった繊細な鉗子2本を集めてください。
   2. 指定された膵臓収穫機:
      1. 無菌採取用の外科用パックを用意してください。
      2. 滅菌手術用手袋を用意してください。
      3. 10mLのWDMシリンジをあらかじめ装填し、オートクレーブしたアルミホイルで密封したアイストレイを集めます。
5. 手術室で膵臓採取ステーションを準備してください。
   1. ガラスビーズ滅菌器をオンにして、各動物の間に1分間殺菌器具を消毒します。器具は無菌1倍PBSに浸すことで急速に冷却できます。
   2. 顕微鏡の視野下に吸収パッドを置き、血液や漏れたWDM酵素溶液を検出してください。
   3. 顕微鏡のレンズと対物レンズの合計倍率を6.3倍に設定します。
   4. 手術用パックを開け、無菌技術で無菌手術用手袋を着用してください。
   5. 外科的採取を進めてください。
6. 手術室で膵臓洗浄ステーションを準備してください。
   1. 100mmのペトリ皿(約6mL)の半分を満たすほどのペンストレップ液を注ぎ、孤立した膵臓を水に浸して氷の上に置きます。
   2. 手術用パックを開け、無菌技術で無菌手術用手袋を着用してください。
7. 手術室で安楽死室を準備してください。
   1. 貯水槽トレイを空の清潔で再封可能なラットケージに入れてください。
   2. トレイにイソフルランを半分ほど詰めます。
   3. 穴あきトレイを貯水槽の上に置き、ネズミを中に置く際にこぼれないようにしてください。
   4. ケージの蓋でチャンバーの上部を密閉してください。
8. 膵臓採取に進みましょう。

3. 膵臓の収穫

1. ラットを1匹ずつ、トレイの上の安楽死チャンバーに入れて、急速なイソフルラン過剰投与を行います。
   注意:ラットの安楽死に必要な時間は変動します。特にイソフルランが蒸発するにつれて。
2. 各ラットの脈拍と呼吸の欠如を確認してください。
3. 腹腔を乱さない二次的な方法(例:心臓穿刺)で安楽死を確定してください。
   注:他の一次安楽死方法は許容されます。しかし、迅速な安楽死は島の低酸素症を最小限に抑えるため、イソフルラン過剰投与が望ましいです。
4. ラットの腹部の毛に70%エタノールをスプレーして毛を毛にし、手術現場での毛の緩みを防ぎます。
5. 安楽死したラットを顕微鏡の下に仰向けに置き、頭部を操作者の遠位に置きます。上腹部が顕微鏡の視野に入るようにしてください。

図1:ラット膵臓の外科的曝露および管内灌流。 膵臓の曝露およびオッディ括約筋を通じた灌流の主要なステップの図解。 (A) ルイスラットの腹腔を開けて安楽死させた。(Aa)総胆管と肝静脈のクランプ配置。 (B) オッディ括約筋領域を示す止血器を示す十二指腸の拡大図。(Bb)灌流針は膵管内に位置しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 膵臓の収穫(膵臓収穫者の役割):
   1. 恥骨結合から各側肋骨にかけて腹部にアクセスするために、皮膚ハサミを使って「V字型」の切開を行います( 図1A参照)。
   2. 平らな鉗子を使って小腸と大腸を動物の左側に引き戻し、腹腔の「作業スペース」をクリアにします。
   3. 平らな鉗子と湾曲した止血鉗を使って十二指腸を広げます。総胆管と肝門脈が顕微鏡の視野に入るようにしてください。
   4. 肝頭を引っ込み、曲がった止血器で総胆管と肝静脈を挟みます。肝臓から1〜2mmの距離でクランプします( 図1Aa参照)。
      注:ステップ3.6.1-3.6.4および3.6.8は直接可視化で行うことができます。他のすべての工程は顕微鏡を使用して、繊細な組織操作を確実にしてください。
   5. 顕微鏡の観察のもと、平らな鉗子と平らな止血器を使い、十二指腸内の内容物を優しく動員してオッディ括約筋をクリアにします。
      注意:十二指腸の内容物が針の挿入部位からずれていることを確認してください。
   6. オッディ括約筋周辺の領域を、平らな止血器で十二指腸を優しく挟み、括約筋の両側から約5 mm離れた位置で隔離します。組織の完全性を保つために圧迫を最小限に抑えてください( 図1B参照)。
   7. 滅菌WDMシリンジを使い、針を十二指腸壁に慎重に挿入し、オッディ括約筋を通して主膵管に進めて灌流します( 図1Bb参照)。
      1. 針がオッディ括約筋を通過し、一定圧力を維持しながら、膵臓が完全に膨張するまで約500 μL/sの速度で7〜10 mLのWDMを灌流します。
         注意:ベベルが上向きで、針が膵管と平行になっていることを確認してください。そうすることで外傷を最小限に抑えましょう。挿入後すぐに注射を開始してください。これにより括約筋と管が拡張され、針の進行が促進されます。膵臓の尾部(脾臓近く)が目に見えて灌流するとき、膵臓は完全に膨張しているとみなされます。
   8. 膵臓を、脾臓、胃、大腸、十二指腸、腸間膜の順に周囲の構造から優しく切り離して切除します。
      注意:組織損傷を最小限に抑えるために鈍的解離を用いてください。解剖学的な姿勢を維持し、血管や管の接続部への緊張を軽減するために順次進めてください。
      1. 十二指腸から両方の平らな止血栓を取り外してください。
      2. 平らな鉗子を使って脾膵靭帯(膵臓と脾臓をつなぐ部分)をクランプし、優しく牽引します。
      3. 細かい湾曲した剥離鉗子を使い、膵臓を隣接する脾臓の付着部から慎重に動員し分離します。
      4. 膵臓を胃から切り離すには、細かく湾曲した鉗子で膵組織を持ち上げ、平らな鉗子で優しく逆牽引します。
      5. その後、平らな鉗子を使ってしっかりと牽引し、大腸を膵臓から切り離します。
      6. 平らな鉗子で小腸を持ち上げ、細かい湾曲鉗子で腸間膜と膵臓を剥離します。
      7. 平らな鉗子で灌流した膵臓を優しく持ち上げ、細かい解離ハサミで結合組織への残った付着部分を切断します。
   9. 切除した膵臓をすぐに氷で冷たいすすぎ液を入れたペトリ皿に移し、次の膵臓の採取を始めます。膵臓洗浄剤は膵臓洗浄を始めます。
7. 膵臓を洗浄する(膵臓の清掃役):

図2:灌流ラット膵臓の洗浄。非必須組織の摘出前後の膵臓の連続可視化。 (A) 解離直後に膵臓が灌流し、隣接する脂肪組織、リンパ節、結合構造が確認されること。(B)主要な解剖学的ランドマークがラベル付けされた灌流された膵臓。(C) 余分な組織を除去した後に洗浄された膵臓で、消化前の最終的な外観を示す。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. 細かい湾曲型鉗子と細かい解離用ハサミを使い、灌流膵臓からリンパ節、脂肪組織、腸間膜、大きな血管を慎重に切除します( 図2参照)。
2. 洗浄した膵臓を、25mLの冷温WDMを含む滅菌600 mLビーカーに移します。手術室から細胞培養室への移送間を清潔に保つために、ビーカーを滅菌アルミホイルで覆います。
   1. 汚染を防ぐために、ペトリ皿のうすぐ液を6回の膵臓ごとに交換してください。
   2. 最初の膵臓が氷に置かれた時間を記録してください。これは冷性缺血の時間記録に使われます。

8. 膵臓をすべて採取・洗浄したら、すぐに細胞培養作業場での消化段階に進みます。

4. 膵臓の消化

1. 軌道のシェーカーの回転を止め、膵臓を含む覆われたビーカーを水浴の指定されたホルダーに固定します。
2. すぐに軌道シェーカーを130rpmで再始動し、消化時間のために10分タイマーを起動します( 図3A参照)。
   注意:この時点を冷性虚血期の終わりと記録してください。各島の収穫と、それに対応する総冷性虚血時間を記録して実験室記録に残します。
3. 5分経過したら、ビーカーを手動で時計回りに回し、次に反時計回りに回して組織解離を助けます。
4. 8分経過時に冷却液を冷蔵庫から回収し、バイオセーフティキャビネットに移して後で即時使用します( 表1参照)。
5. 10分経過時に、ビーカーを素早く移して氷に浸し、酵素の活性を遅らせます( 図3B参照)。
   注意:ここからは、室温密度勾配を使用する際、すべての組織、細胞、溶液を氷で保管し、ステップ4.20まで保存してください。
6. ビーカーの外側とトレイをバイオセーフティキャビネットに移してください。
7. 消化を止めるために、溶液と1:1の比率でクエンチングバッファーを加えます(ビーカーあたり約75〜100 mL)。
8. 50 mLの注射器に14Gの脊椎針を装着し、組織懸濁液を優しく繰り返し吸引し、大きな組織断片を解離します( 図3C参照)。
9. 懸濁液を200 mLの円錐形チューブに移します。
10. ビーカーを5mLの洗浄液で洗い流し、アイレットダイジェストを含む200mLの円錐形チューブに移して残りの消化物を回収します。
11. 遠心分離機は200× g で4°Cで5分間消化します。 安全のために適切な遠心分離機ボトルアダプターやクッションの使用を必ず確認してください。
12. 上澄液を慎重にデカントし、前回と同じ14Gの脊椎針を使って100mLの洗浄液に再懸浮させます。
13. 懸濁液を無菌の500μmふるいにかけ、無菌の600mLビーカーの上に置き、大きな未消化組織を除去します。
    注:膵臓の灌流と洗浄が最適に行われた場合、篩の上には最小限の脂肪組織と灌流されていない膵臓が残りません。
14. 10mLの洗浄液で篩をすすぎて、閉じ込めた組織を回収します。
15. ろ過液を新しい200 mLの円錐形チューブに移します。
16. 遠心分離機で200× g 、4°Cで5分間。
17. 上清液をデカントし、10mLの血清学ピペットを使って100 mLの洗浄培地に再懸濁させます。
    注意:アイレットに曝露する前に、FBS含有バッファーでピペットチップを事前に湿らせて細胞損失を最小限に抑えてください。
18. 遠心分離機で600×g、4° Cで5分間。
19. 上清液を慎重に吸引して乾燥したペレットを得ます。
20. 勾配分離の準備として遠心分離機の温度を22°Cに設定します。
    注意:これは、サンプルなしで2000 x g で22°Cで15分間遠心分離機を運転することで短縮できます。

5. 島の浄化

1. 必要な50 mL円錐管の数は 表3 を参照してください。
   注意:総ペレット容積を均等に分配するために 表3 を参照し、各勾配チューブに約2〜3 mLのペレット消化液を分割してください。後で弱いアイレットバンド分離が見られた場合は、分離分解能を高めるために追加の勾配管を使用します。
2. 10 mLの血清学用ピペット先端に1.108 g/cm³の密度勾配溶液をあらかじめ湿らせ、アイレットが先端の内側表面に付着するのを防ぎます。
3. 各組織ペレットを、事前に湿らせた10 mL血清学ピペットを用いて、1.108 g/cm³勾配溶液15 mLに再懸浮させます。総容量が10 mLを超えているにもかかわらず、ピペット幅が小さいため、より制御された混合と効率的なペレット解離が可能となります。均一になるまで優しく混ぜます。
4. 各50 mL円錐形チューブの底部に15 mLの細胞懸濁液を慎重に注ぎ、チューブ壁との接触を避けてきれいな勾配レベルを確保します。
5. あらかじめ装填された勾配シリンジを使い、1.096 g/cm³勾配の10 mLを順次重ね、続いて1.069 g/cm³の勾配を10 mL重ねます。
6. 各勾配をシリンジポンプで毎分5 mLの速度で抽出し、16 Gの針先をチューブの内壁に当てて勾配混ざりを防ぎます。
7. チューブを700 × g で22°Cで15分間遠心分離し、遠心分離機の加速度は3、減速は0に設定して勾配混合を防ぎます。
   注:減速時間が長いため、遠心分離サイクル全体は約45分かかります。時間の経過を注意深く監視し、勾配の混合や細胞損傷を防ぐために速やかに採取する必要があります。必要に応じて、密度の違いを考慮して、体積ではなく重量でカウンターバランスチューブを準備してください。チューブを外した後、遠心分離機を4°Cにリセットし、加速と減速を9°Cに設定し、今後のステップに備えます。
8. 遠心分離後、1.069-1.096 g/cm³と1.096-1.108 g/cm³勾配層の界面に位置するアイレット層を特定します( 図3D参照)。
9. 最上層で採取した組織は、洗剤で湿らせたパスツールピペットで慎重に吸引し、廃棄します。
10. 別のパスツールピペットを湿らせ、アイレット層を回収して、5mLの洗浄液を含む200mLの円錐形チューブに移します。
11. 事前に冷やした200 mLの円錐形チューブの容量を洗剤で200 mLに上げます。
12. 600 × g で遠心分離機で5分間過ごし、上清液をデカントします。
13. ペレットを30mLの洗浄液に再懸浮させ、事前に湿らせた10mLの血清学的チップを使用します。
14. 懸浮液を新しい50 mL円錐形チューブに移し、事前に湿らせた10 mL血清学的チップを使ってより良いアイレットペレットを得ます。
15. 同じ200mL円錐管を20mLの洗浄液ですすいで、残りのアイレットを含む50mL円錐管に移します。
16. 50 mLの円錐形をアイレットと洗浄液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
17. 上清液をデカントし、アイレットペレットを50mLのアイレット培養培地に再懸濁させます( 表1参照)。
    注意:手動定量法でアイレットをカウントする場合は、このステップで100μLのアリコートを除去してください。
18. 組織培養処理されていない100mmペトリ皿に均等に小島を盛り付け、処理したルイスラットの膵臓5個につき1枚を使用します。
    1. 膵島の総容積を公式(膵蓋数÷5 × 10 mL)で計算します。
    2. 計算された媒体の半分でアイレットペレットを再懸浮させ、決められたプレート数に均等に懸濁液を分散させます。
    3. 残留アイスレットを含む50 mLの円錐形チューブを計算された培地の残りの半分で洗い流し、同じプレート上でピペットで洗浄して、最終的な1皿あたり10 mLの体積にします( 図3E参照)。
19. 25°Cで5%のCO₂で一晩培養します。24時間ごとに3mLのアイレット培養培地を各ペトリ皿の側面に加え、優しく攪拌して培地を補充します。
20. アイレットカウント(ステップ6)に進みます。

図3:膵臓の消化と孤立島の精製。 膵臓の消化が溜まる段階から膵島の浄化までの連続したステップの代表画像。(A) 酵素消化前に灌流された膵臓をプールすること。(B) 酵素消化後の膵臓の断片化。(C) 均一な組織懸浮、機械的分離。(D) 遠心分離前(左)および遠心分離後(右)の密度勾配管で、勾配界面の目に見えるアイレットバンドが丸で囲まれています。(E) 採集直後のDay 0島の明視野画像。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 島の計数

1. 手動でアイレットの定量を収集してください。
   1. ステップ5.16では、200μLピペットと通常の200μLチップを使って、アイレット懸浮液の100μLアリコートを3回抽出します。
      注意:測定のためにアリコートを取る際、ピペット混合でアイレットが均等に媒体中に懸浮していることを確認してください。
   2. 各アリコートをそれぞれ2mm×2mmのグリッド状ペトリ皿に移し、1×PBSを1mL入ります。
   3. 倒立顕微鏡でアイピースレティクルレンズインサートで島を数え、直径ごとにカタログ化します。
      注:すべての島が円形とは限りません。カウント中は水平または垂直の測定値を守りましょう。
   4. 標準化された換算表( 表4参照)を用いて150μmアイレットの等価数を計算します。
      注意:各サンプルのIEQを比較してください。アリコートのIEQが30%以上異なる場合は、最も類似したアリコットの平均を取る。

7. 安全対策

1. 適切な場合は、すべての手術および組織取り扱いをバイオセーフティキャビネット内で無菌状態で行ってください。試薬や組織の取り扱いの際は、安全ゴーグル、白衣、手袋、外科用マスクなどの個人用防護具(PPE)を必ず着用してください。
2. 適切な手術器具とPPEを用いて、無菌環境下で膵臓摘出を行います。吸入曝露を防ぐため、機関のガイドラインに従ってイソフルランやその他の麻酔薬を取り扱いましょう。
3. 動物組織、鋭利品、バイオハザード廃棄物は、機関のバイオセーフティプロトコルに準拠して処分すること。酵素試薬や生物材料は、特に指定がない限り氷上に保管し、活性と生存可能性を保つこと。

結果

以下の結果は、記載された方法を用いた典型的なアイレット分離を示し、12個のルイスラット膵臓を並行処理したものです。

収量とサイズ分布

手動のアリコートカウントとIEQ変換

「アイレットカウント」ステップ6.1で説明されているように、混合アイレット懸濁液から2つの独立した100μLアリコートが得られ、直径ビン(50-100μm、100-150μm、150-200μm、200-250μm、250-300μm、250-300μm)でカウントされました。カウントは標準当量表を用いてアイレット当量(IEQ;150μm参照)に換算し、総懸濁体積に外挿しました( 図4A参照)。検査分離(n=12)では、膵臓あたり3330 IEQの収量が、50-100μmビン内に中央値の膵島径がありました。複製アリコットはビンあたり18.8%(変動係数)で一致し、手作業計数方法を用いると予想される中程度の変動を示しています。過去14回のアイレット分離では、この方法で平均1353(標準差607)のIEQ/膵臓が生成されました。

自動全プレート定量化

手動IEQのベンチマークとして、顕微鏡でD1で明視野画像を取得し、全皿合成画像(4×対物レンズ;露光1/100秒)を合成しました。フィジーと符号化を用いて、50〜600μmの定義されたサイズ閾値で自動サイズ測定と対象の定量化が行われました。画像はまず背景の変動を減らしコントラストの均一性を高めるために前処理されました。島の構造は周囲組織との強度差に基づいて同定され、二元物体マスクを生成しました。隣接または部分的に接触する島は、物体数の過小評価を避けるために分離されました。指定されたサイズ範囲外の物体は、破片や非島組織を除去するために除外されました。保持対象ごとに、面積やx軸およびy軸径を含む形態計測パラメータが抽出されました。その後、アイレットは直径でビン分けされ、IEQは各サイズビン内のアイレット数に対応する換算係数を掛けて計算されました。自動サイズ測定により、合計98,832個の物体が得られ、平均x軸径はそれぞれ117μm、y軸直径は116μm、推定IEQは16,350個で、これはD0で測定された手動IEQと強く相関していました(Spearman r = 0.937, p = 0.0048;図4A-C参照)。

アイレット細胞の脱落

全プレート画像は、精製後2時間後および1日目(D1)に取得され、同じ手法を用いた「自動全プレート定量化」を用いて早期のアイレット安定化(「脱落」)を評価しました。2時間からD1まで、オブジェクト数は0.9%、IEQは-6.11%変化しました( 図4D参照)。D0とD1の島径のペア比較では、統計的に有意な中央値減少が2μmであった(Wilcoxon符号付きランク検定、 p = 0.0136、n = 2820)。しかし、この変化の小さな規模は生物学的にも臨床的にも意味があるとは考えにくいです。

図4:アイレットのサイズ分布、相関、早期脱落の定量的評価。 手動および自動解析によって得られた島の測定値の図示的要略。(A) Day 0 (D0) 標準化されたアイレット相当のIEQサイズビン間で手動定量化に基づくアイレットサイズ分布。(B) 1日目(D1)アイレットサイズ分布は、同じ標準化されたIEQサイズビン間で画像ベースの自動測定によって決定されます。(C) IEQサイズビン間で手動D0と自動D1定量化の相関。(D) 同一プレートの自動測定のためのD0からD1までのアイレット直径分布のボックスプロット。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

純度(内分泌と外分泌成分)

ジチゾン(DTZ)染色

D1では、多数のアイレット(n = 451)を室温で30秒間DTZ染色し、直ちに明視野顕微鏡(対物レンズ4×、露光1/20秒)で画像化しました。フィジーでは、背景のピクセルが除去され、残りのピクセル領域がアイレット全体の面積に対応するようにされました。暗い色コントラストで識別されるDTZ陰性外分泌組織領域は、投げ縄ツールで手動で選択され、各関心領域の領域はピクセル単位で自動的に記録されました。内分泌純度は、DTZ陽性ピクセルの割合を全アイレットピクセルに対する割合として算出し、純度は98.56±0.38%でした(図5A)。

実用性と機能性能

グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)

各時点(D1、D3、D7)で、サイズに合った15個のアイレットが手作業で選ばれ、24ウェルのプレートの個別の井戸に設置され、4倍で準備されました。アイレットはクレブスバッファー内の37°Cで5%_CO2 で低・高・低グルコース刺激プロトコルのもとで培養されました。まず低グルコース(2.8 mM、60分)、その後高グルコース(16.7 mM、60分、 表1参照)で培養されました。各潜伏期間終了時に排出物分画を収集し、ラットインスリンELISAアッセイを用いてインスリン濃度を定量化しました。刺激指数は、高血糖状態と低血糖条件下でのインスリン分泌比率として計算されました。刺激指数はそれぞれ1日目、3日目、7日目に9.37、8.34、6.7で、有意差はありませんでした(図5B)。

ライブ/デッドステイン

D1、D3、D7では、15個のアイレットが製造元の指示に従ってLive/Deadの実用性キットで手作業で選ばれ、染色されました。簡単に、アイレットは生死染色液で25°Cで30分間培養され、その後、時間差(4倍対物レンズ、1/30秒露光、テキサスレッドおよびGFPフィルター)を比較可能にするために、一貫した顕微鏡設定で画像化されました。生存可能性は、scikit画像を用いたアイレットセグメンテーションと蛍光測定を用いるPythonスクリプトを用いて定量化されました。緑色と赤色の蛍光チャネルを組み合わせ、Liの閾値法を適用して二値マスクを作成し、流域分割を用いて接点を持つ島を分離することで島が特定されました。物体は面積ごとにフィルターされ、破片や遺物は除外されました。各島ごとに、生存可能性は、緑色のピクセルを組み込んだ総統合密度(緑と赤色ピクセル)に対する割合として計算されました。結果はD1で68±9%、D3で98.2±0.6%、D7で100%の生存率を示しました。70%エタノールで10分間処理した陽性対照サンプルは、生存率が2.7±7.2%を示しました(図5C-F参照)。

図5:島の純度、生存可能性、機能的応答性の評価。時間経過による孤立した島の特徴の代表的な画像と定量的要約。(A) 代表的な10×ジチゾン(DTZ)で染色された島の明視野画像で、赤色に染まった内分泌小島と染色されていない外分泌組織が示されています。(B) 1日目、3日目、7日目における高グルコース/低グルコース(HG/LG)刺激指数のグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)値。(C-E)1日目(C)、3日目(D)、7日目(E)の島の生死蛍光画像。(F) エタノール処理された陽性対照群の生死蛍光画像。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

(a) メディアの洗浄
構成要素	最終集中	量(mL)
RPMI 1640	-	500 mL
胎児用牛血清	10%	50 mL
ペン溶連菌(10,000 U/mL)	1%	5.5 mL
ヘペス	25 mM	12.5mL、1M在庫より
L-グルタミン	2 mM	200 mMのストックから5 mL
(B) アイレット・カルチャー・メディア
構成要素	最終集中	量(mLまたはg)
RPMI 1640、グルコースなし	-	500 mL
胎児用牛血清	10%	50 mL
ペン溶連菌(10,000 U/mL)	1%	5.5 mL
ヘペス	20 mM	11mLの在庫から11mL
ピルビン酸ナトリウム	1 mM	100 mMストックから5.5 mL
グルコース	5.5 mM	200 g/Lのストックから2.75 mL
(c) ペニシリン・ストレプトマイシン洗浄液
構成要素	最終集中	量(mLまたはg)
生理食塩水溶液、0.9%	-	500 mL
ペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	2%	10 mL
(D) 焼入れバッファー
構成要素	最終集中	量(mLまたはg)
HBSS	-	500 mL
胎児用牛血清	20%	100 mL
HEPES(1 M)	2.50%	2.5 mL
(E) クレブスバッファー
構成要素	最終集中	量(mLまたはg)
dH2O	-	975 mL
NaCl	115 mM	6.72 g
NaHCO3	24 mM	2.02 g
KCl	5 mM	0.3728 g
HEPES(1 M)	25 mM	25 mL
MgCl2	1 mM	0.0952 g
BSA	0.10%	1 g
CaCl2	2.5 mM	0.2775 g

表1:解決策一覧。 アイレット分離および精製プロトコル全体で使用されるすべての溶液の組成および調製の詳細。各小節には、成分、最終濃度、調製量、カタログ番号が記載されています。(A) 洗浄用メディアは、消化や浄化の際に組織をすすぎたり洗浄したりするために使われます。(B) アイレット培養培地は、分離後のアイレットの維持と生存性に使用されます。(C) ペニシリン・ストレプトマイシン洗浄液は、摘出した膵臓を滅菌・すすいでいます。(D) 焼光バッファー:酵素的消化を終わらせ、細胞の生存能力を維持するために使用されます。(E) グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイで使用されるクレブスバッファー。

膵臓の数	コラーゲナーゼ(15.38 mg/mL)	サーモリシン(1 mg/mL)	DNAase(100 mg/mL)	動作バッファ	使用用の600 mLビーカー	体積/ビーカー
30	4.5 mL	2.25 mL	450μL	450 mL	5	25 mL
24	3.6 mL	1.8 mL	360μL	360 mL	4	25 mL
20	3 mL	1.5 mL	300 μL	300 mL	3	25 mL
16	2.4 mL	1.2 mL	240 μL	240 mL	2	25 mL
12	1.8 mL	0.9 mL	180μL	180 mL	2	25 mL
10	1.5 mL	0.75 mL	150 μL	150 mL	2	25 mL
最終コンセント。	0.15 mg/mL	5 mg/mL	0.1 mg/mL

表2:膵臓量別の消化酵素溶液。 異なる数のラット膵臓に対応する作業解離培地(WDM)を準備するために必要量のコラーゲナーゼ、熱分解物、DNase I。各酵素の最終濃度は表の下部に記載されています。

膵臓の数	50mLチューブ	ボリューム/注射器	1.096本の注射器の数	1.068本の注射器の数
30	10本の管	50 mL	2	2
24	8本の真空管	40 mL	2	2
20	6本の真空管	30 mL	2	2
16	4本の管	40 mL	1	1
12	4本の管	40 mL	1	1
10	2本の管	20 mL	1	1

表3:膵臓量による勾配負荷。 膵管数に応じて、膵島浄化に必要な50mL円錐管の数とそれに対応する勾配容量。

島径範囲(μm)	アイレット粒子番号(AI)	IEQ変換係数	範囲ごとのIEQ
50-100	a	* 0.167	a * 0.167
101-150	b	* 0.648	b * 0.648
151-200	c	* 1.685	c * 1.685
201-250	d	* 3.500	d * 3.500
251-300	e	* 6.315	e * 6.315
301-350	f	* 10.352	f * 10.352
> 350	g	* 15.833	g * 15.833

表4:島の等価変換。 アイレット直径の範囲を標準化されたアイレット相当物(IEQ)に変換する。表には観測されたアイレット直径ビン、各レンジごとのアイレット粒子数、対応するサイズ範囲ごとのIEQ換算係数、および範囲ごとのIEQ寄与が一覧化されています。

ディスカッション

このプロトコルは、ルイスラットから膵島を分離・精製するための高スループットアプローチを示しています。この方法の成功は、島の完全性と機能を維持するいくつかの重要なステップにかかっています。その中には、膵臓への正確かつ完全な管内灌流、灌流された膵臓の慎重な洗浄、そして正確な酵素的消化時間が含まれます。膵臓の均一な膨張と、細胞外マトリックスを消化し、酵素の浸透を促進し、DNA介在粘度を低減するコラーゲン酵素-熱溶菌-DNase混合体の均等な分布を確保するために、一貫した全臓器灌流が不可欠です(^21,22)。灌流不足は組織の消化不全を引き起こし、消化不足の組織がふるいで除去されるため、かなりの割合の膵島を失うことがあります。同様に、消化前に脂肪組織や血管組織を不十分に除去すると、非内分泌不純物が入り込み純度を下げることがあります。最後に、消化が長期間続くと細胞外マトリックスの過剰な破壊による膵島の分離が解消され、最適でない消化では脊髄針による機械的消化に抵抗性を持つ未消化組織が生まれます。これらのステップは最も頻繁に見られる技術的落とし穴であり、トレーニングや最適化の際には注意深く監視されるべきです。

この方法はルイスラット専用に設計されましたが、消化時間や酵素比^{23、24、25、26}の微調整によって他の株や種にも応用可能である可能性が高いです。一部の検査室では、特定の酵素ロットや組織特性に応じた収量を最適化するために、作業解離培地(WDM)中のコラーゲナーゼ、サーモリシン、DNase Iの比率を調整することを選ぶことがあります。そのために、検査室は製造元の酵素および組織最適化のステップバイステップガイドに厳重に従い、0.1 M EDTA、システイン、メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤、血清、アルブミンなどの成分の添加を避ける^{必要があります。これらは}コラーゲナーゼ、サーモリシン、DNase1酵素活性を阻害する可能性があるためです。解離前の酵素ブレンドの決定的な有効期間は発表されていませんが、過去のデータでは膵臓の長期の冷保存が膵島の収量^と機能に悪影響を及ぼすことが示されています。実証的に、私たちのプロトコルでは、最初の膵臓を氷で洗浄して洗浄し、37°Cの水浴に移すまでの全冷性虚血時間が1.5時間未満に保たれた場合に、成功した分離が一貫して達成されました。このパラメータのさらなる最適化は、エンドユーザーの用途によっては必要となる場合があります。

堅牢性があるにもかかわらず、このプロトコルにはいくつかの実用的および技術的制約があります。まず、酵素ブレンド(コラーゲナーゼ、サーモリシン、DNase I)と密度勾配は効率的な組織解離とアイレット分離に不可欠ですが、その代償はかなり大きいです。酵素の組み合わせの選択は、膵臓細胞外マトリックスの構造的特性と、効果的な組織解離と膵島の完全性の維持のバランスを取る必要性に基づいています。各酵素成分は異なる役割を担います。コラーゲン酵素は線維性および基底膜コラーゲンを標的としてアイレットを解放し、中性プロテアーゼであるサーモリシンは、非コラーゲンマトリックスタンパク質や細胞間接着分子を切断し、必要なコラーゲン酵素曝露を減少させます。DNase Iは溶解細胞から放出されるDNAによる粘度を最小化します ^29,30,31。低コストの消化酵素製剤は市販されていますが、その純度は変動し、酵素効果を損なう可能性があります^13,23。コラーゲナーゼは細菌培養から単離されるため、追加の精製工程はエンドトキシン汚染を減らしますが、コストは大幅に増加します^13,23。

コラーゲナーゼについては、1本あたり約2,000〜4,000ウンシュ単位の活性を持つ製剤を推奨し、適度な投与で効率的な解離を促進しつつ、長期的な消化を避けます。特に、このブレンドにはコラーゲン酵素クラスIとクラスIIのバランスの取れた比率が含まれており、コラーゲン酵素IIと総コラーゲン酵素の割合はおよそ0.3〜0.5に相当します。この比率は強力なコラーゲン溶解活性を提供しつつ、非コラーゲン性細胞外マトリックスの過度な分解を抑制します。さらに、コラーゲン酵素混合物には中性プロテアーゼ活性(約150,000〜250,000単位)とDNaseが補完されるべきです(理由はすでに述べています)。

品質管理の観点からは、各ロットには低エンドトキシン負荷(≤50 EU/mgタンパク質)、高酵素純度(HPLCによる≥85%)、およびロット間活性の検証が含まれるべきです。酵素の純度や組成はメーカーによって大きく異なる場合があります。最後に、ロット組成の変動は消化の整合性やアイレット収量に影響を与えるため、ロットごとの内部検証の実施が必要です。この検証は、本プロトコルで記述された標準化された消化条件に従い、その後消化効率やアイレット形態を評価することで実現できます。酵素の性能が最適でない指標には、組織解離の不完全、境界が不規則または粗いアイレット、分離を達成するために過剰な機械的せん断が必要であり、その場合は消化時間の滴定が必要となることがあります。

同様の考慮事項は密度勾配にも当てはまります。我々はポリショ糖系勾配を選びました。これは非イオン性で高親水性のショ糖-エピクロロヒドリン共重合体で、最大1.2 g/mLまで安定した勾配を形成し、アイレット分離^32,33で長い実績があります。イオジキサノールはよく検証された代替薬であり、ヒトアイレットでの研究では、イオジキサノールベースの勾配がアイレットの回復を改善しつつ、生存性と機能を維持することが示されています34,35,36,37。しかし、齧歯類データは決定的ではなく、一部の研究ではヨオジキサノールを用いた治療の効果が報告され、他はポリショ糖ベースの勾配でより良い生存率と機能を示すものもあります(^32,35)。特に、市販の品質管理された勾配ソリューションの使用が、実験室間の再現性を高めるために推奨されています。ポリショ糖ベースの勾配は最適な密度でアイレット分離に広く利用可能ですが、ヨオジキサノール勾配は通常社内で希釈することで調製されるため、さらなる変動が生じます。第二の制約は、特にオディ括約筋を通じた管内灌流や迅速な膵臓切除において、外科的収穫に高度な技術力が求められることです。わずかな遅延やずれでも組織損傷、漏れ、不均一な灌流、または長引く温間虚血を引き起こし、膵島の収率や生存能力を損なう可能性があります。この制約を緩和するため、プロトコルには詳細な手順説明や、色分けされた解剖学的ランドマークを含むオリジナルのグラフィカルエイドが含まれており、理解を容易にしています。新規操作者は完全な隔離を行う前に灌流技術に慣れることが推奨されており、生きた収穫を試みる前に死骸での練習が推奨されます。

第三に、最大効率のためには、このプロトコルには協調したチームワークが必要です。膵臓の採取や酵素による消化の際、通常3人の訓練を受けたオペレーターが必要です。1人は無菌手術を行い、1人は無菌状態で膵臓を洗浄し、もう1人は非無菌条件下で循環および安楽死を行います。消化後、熟練度を達成すれば、通常はより少ないオペレーターで下流の精製工程を行うことができます。この調整は初期の物流要求を伴いますが、比較的短時間で複数の動物から多くの島を隔離し、より調整の緩やかなワークフローに比べて全体のスループットを向上させます。このプロトコルは技術的には要求が高く資源を多く消費しますが、これらの制限はすべてのアイレット隔離方法に共通しています。標準化された消化条件、構造化されたトレーニング、協調的な実行を重視することで、このハイスループットアプローチは分離ごとの時間と労力を削減し、訓練を受けたチームによって実施されれば一貫性のある再現性の高い結果をもたらします。

従来の齧歯類アイレット隔離プロトコルと比較して、この方法はスループット、再現性、一貫性において大きな利点を提供します。従来の単一臓器消化は手作業で選ぶことが大きく依存し、純度が変動することが多い¹³。対照的に、当社のプロトコルはプール消化と密度勾配精製を用い、調製時間とサンプル間変動を大幅に削減しつつ、高いアイレット生存率と機能的応答性を維持しています。分離されたアイレットは形態(ジチゾン染色)、生存可能性(生死アッセイ)、機能(グルコース刺激インスリン分泌)に関して包括的に特徴づけられ、この手法の堅牢性が確認されました。この標準化されたワークフローにより、カプセル化、移植、微小生理学的モ^{デリングなどの}下流応用に適した豊富で清潔かつ機能的なアイレット製剤の生成が可能^{となります。}重要なのは、この技術で分離されたルイスラットのアイレットが前臨床モデルで糖尿病を逆転させたことであり、この再現可能かつ拡張可能なアプローチの翻訳的意義を強調しています⁴¹。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
21 G x 2インチ。BD プレシジョングライドニードル	BD	305129
500 & micro;m真鍮フレームと304ステンレススクリーン、直径3インチ×深さ1インチ(ふるい番号35)	マクマスター・カー	34735K525
エアタイト滅菌注射器、ルアーロック	フィッシャー・サイエンティフィック	14-817-178
バイオゲルPI UltraTouch M	M&Moonl;インリッケ	42665
ボン・シザーズ;ストレート;鋭いポイント;刃長15mm;全長3 1/2インチ	ロボズ	RS-5840
ブレイントリーサイエンティフィック GERMINATOR 500 ドライステリル	フィッシャー・サイエンティフィック	NC9956482
Cell-IQシリーズ 5.8立方フィートCO2実験室インキュベーター	PHCBI	MCO-170AICUVHL-PA
コーニング 100mm TC処理されていない培養皿	コーニング	430591
コーニング胎児用牛血清、500mL、通常、USDA安全性試験済み(加熱不活化)	コーニング	35011CV
コーニング島勾配1.069(密度1.069 g/cm3)	コーニング	99-815-CIS	会社からの特別な要望が必要です
コーニング島勾配1.096(密度1.096 g/cm3)	コーニング	99-691-CIS	会社からの特別な要望が必要です
コーニング島勾配1.108(密度1.108 g/cm3)	コーニング	99-692-CIS	会社からの特別な要望が必要です
Covidien Tendersorb アンダーパッド	フィッシャー・サイエンティフィック	22-225-102
DNase I グレードII	ロッシュ	10104159001
ファルコン 50 mL 高透明度円錐遠心分離機チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	14-432-22
フィッシャーブランド・アルミホイル、標準軌のロール	フィッシャー・サイエンティフィック	01-213-100
フィッシャーブランド 不織布ガーゼスポンジ	フィッシャー・サイエンティフィック	22-028-559
フィッシャーブランド再利用可能な重厚型低型ビーカー	フィッシャー・サイエンティフィック	FB101600
蛍光ミルコスコープ BZ-X810	キーエンス	BZ-X810
グルコース溶液	ギブコ	A2494001
ハルジー・マイクロニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12500-12
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	ギブコ	14025092
HEPES(1 M)	ギブコ	15630080
止血鉗子 クラシック Crile 5 1/2インチ長	マッケソン	1231217
ハドソン(エワルド)鉗子	ロボズ	RS-5238
注射針モノジェクト 長さ1-1/2インチ 16ゲージ 通常壁 安全装置なし	マッケソン	43481
L-グルタミン(200 mM)	ギブコ	25030081
リベラーゼT-フレックス、研究用グレード	ロッシュ	5989132001
哺乳類細胞用のLIVE/DEAD生存可能性/細胞毒性キット	インビトロジェン	L3224
MATLABソフトウェアパッケージ	マスワークス	https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 2チャンネルプログラム型シリンジポンプ	シリンジポンプ	NE-4000-US
針、筋力下 27GX1/2インチ(100/BX) エクスリント	マッケソン	408877
Nunc細胞培養/ペトリ皿	サーモサイエンティエンティエンス	174926
オリンパスCKX41逆位相差顕微鏡	オリンポス	CKX41-B
PBS、pH 7.4	ギブコ	10010023
ペニシリンストレプトマイシン(10,000 U/mL)	ギブコ	15140122
RPMI 1640	ギブコ	11875093
RPMI 1640、グルコースなし	ギブコ	11879020
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)	ギブコ	11360070
ピルビン酸ナトリウム(100 mMストック)	ギブコ	11360070
ソーバルST 16R	サーモサイエンティエンティエンス	75004381
ステンレススチール製304シリンジ針	ミリポール・シグマ	Z117013-1EA
外科用ドレープ、使い捨て、36インチ×100ヤード	コヴェトルス	10408
サージカルシザーズ - ToughCut	ファインサイエンスツール	14054-13
親指包紮鉗子 4.5インチ ギザギザの繊細な先端幅1.3mm	ロボズ	RS-8120
サーモサイエンティフィック Nunc 200mL遠心分離機チューブ	サーモサイエンティエンティエンス	14-962-17
サーモサイエンティフィック NUNC遠心分離機ボトルアダプターとクッション	サーモサイエンティエンティエンス	12-565-283B
TSDUB15 15L ダブノフ シェイキングウォーターバス	フィッシャー・サイエンティフィック	300610298
TX-400 4×400 mL スイングバケットローター	サーモサイエンティエンティエンス	75003181
タイゴン S-50-HL	タイゴン	AAXoooo3
超感度ラットインスリンELISAキット	クリスタルケム	90060