フローサイトメトリーにおける異なるゲーティング戦略を使用した精子DNA分析結果の比較

Summary

ポリゴンゲーティング（PGG）と十字形ゲーティング（CFG）は、精子のDNA完全性を検出するためのフローサイトメトリー法です。PGGはDNA断片化指数（DFI）と高DNA染色指数（HDS）を測定します。CFGは重度のDFI、軽度のDFI、および全体的なDFIを報告します。この研究は、それらの結果と相関関係を比較することを目的としています。

Abstract

精子のDNAの完全性は、受精、胚の発達、および妊娠の継続を確保する上で重要な要素です。DNAの変性とアクリジンオレンジ染色後のフローサイトメトリーを用いた精子染色体構造評価（SCSA）は、精子DNAを評価するゴールドスタンダードな方法と考えられています。フローサイトメトリーベースの精子DNA断片化指数（DFI）の評価のための2つのゲーティング戦略：多角形ゲーティング（PGG）と十字形ゲーティング（CFG）が文献に報告されています。本研究の目的は、PGGとCFGの検査結果の関係を比較し、基本精液分析のパラメータとの相関関係を分析することでした。両方の方法で独立して得られたデータは、Bland-Altmanプロットと回帰分析を含む統計分析によって比較されました。当院の生殖センターで不妊症評価を受けている121名の男性外来患者が完全ランダムサンプリング法により選ばれました。精子のDFIと関連指標は、それぞれPGGとCFGを用いてフローサイトメトリーで検出されました。結果は、2つの方法で得られたDFI値が良好な一致を示したことを示しました。PGG法のDFIpとCFG法のDFIm、DFIs、DFIcの間の相関係数はそれぞれ0.6497、0.9404、0.9667でした（すべてp < 0.01）。高DNA染色指数（HDS）はDFIsとわずかな負の相関を示しました（r = -0.3042、p < 0.05）。進行性運動精子の割合は、DFIp、DFIs、DFIcと負の相関を示しました（r = -0.3824、-0.3794、-0.3574、すべてp < 0.05）。HDSと精液量、精子の濃度、総精子数、またはPR（%）の間には有意な相関は認められませんでした。これらの結果は、DFIsが男性の肥沃度とより密接に関連していることを示唆し、このパラメータを提供するCFG法が、精子DNA損傷の臨床評価により適している可能性があることを示しています。

Introduction

精子のDNA完全性とは、精子の核にあるDNA分子の構造の完全性と機能的安定性を指します。具体的には、正常なクロマチン構造、損傷や酸化ダメージのない完全な塩基配列、そして遺伝情報を正確に子孫に伝える能力によって特徴づけられます。精子形成過程で、酸化ストレスが増加¹、クロマチンの改変が異常²、または精子が環境毒素の影響を受ける³と、精子のDNAの完全性が損なわれ、塩基ミスマッチ、損失、修飾、DNAの追加と架橋、単鎖および二重鎖切断などが起こります。さらに、損傷した精子のDNAは男性の生殖能力を損ない、人工生殖技術（ART）での妊娠結果に悪影響を与え⁴、反復流産のリスクも高めます⁵。2021年、欧州泌尿器科学会（EAU）は男性の生殖能力評価システムにDFI検査の導入を推奨しました⁶。

現在、精子のDNA完全性は主に精子DNA断片化指数（DFI）の検出によって評価されています。フローサイトメトリによる精子クロマチン構造検査（SCSA）がDFIを評価する主要な方法です⁷。精子のDFI検出のためのフローサイトメトリのゲーティング方法は文献で2つ報告されています。一つは多角形ゲーティング法（PGG）で、精子のDFIとHDSなどの2つの主要指標を同時に報告できます⁸。PGGは検出係数の変動が小さく、優れた再現性を持つ古典的なSCSAアプローチです⁹。しかし、DNA損傷の程度を区別することはできません。もう一つは十字形ゲーティング法（CFG）で、精子DNAの重度損傷マーカー（DFIs）、軽度損傷マーカー（DFIm）、および十字形ゲーティング法の合計DFI（DFIc）を報告できます。DFIcはDFIsとDFImの合計です。現在の精子DNA完全性を評価する技術と比較して、CFG法は精子のDNA損傷の重症度を反映できます¹⁰。

精子の質を評価するのにどの方法がより適しているかを判断するため、この研究ではPGG法とCFG法の両方を用いて精子のDFIと関連パラメータを測定しました。これら2つの方法の結果と従来の精液分析パラメータとの相関を比較しました。我々の知る限り、この研究はPGGとCFGの2つの方法の検出結果の相関を分析した最初の研究です。

Protocol

この研究は、南京医科大学付属淮安市第一人民病院の医療倫理委員会によって承認されました（承認番号：KY-2024-181-01）。この研究で使用されたサンプルを提供した患者からインフォームドコンセントを取得しました。ワークフローの全体的な概略図は図1に示されています。使用した試薬と機器の詳細は材料表に記載されています。

フローサイトメーターのためのCFGの設定
酸処理後、損傷したDNAを持つ精子の核クロマチンは単一鎖DNAを示し、損傷していないDNAを持つ精子の核クロマチンは完全な二重鎖構造を保持します。蛍光染料のアクリジンオレンジ（AO）は単一鎖DNAに結合し、488 nmのレーザーで励起されると赤色蛍光を発します。二重鎖DNAに結合すると、488 nmのレーザーで励起されると緑色蛍光を発します。フローサイトメーターで捕捉された赤色と緑色の蛍光信号の数に基づいて、赤色蛍光と赤色と緑色の蛍光の合計の比率を計算し、これが精子のDFIを表します。

CFGの設定は、Yangらによって提供された概要に従って実施されました¹⁰。フローサイトメーターは、AO染色された正常な精子で測定された最低の緑色蛍光と最高の赤色蛍光を境界参照として設定する必要があります（図2）。以下はCFGの各象限における細胞の特性のリストです：
象限Q1は正常な精子を示します。精子のDNAは完全で、AOの結合量が最小で、結果として緑色蛍光が得られます。
象限Q2の精子は部分的に断片化したDNAを持ち、蛍光顕微鏡下でオレンジ色に見えます。このようなDNAは修復可能であり、これらの精子は軽度のDNA断片化（DFIm）¹⁰として分類されます。
象限Q3は、減算後に生じた非特異的蛍光と定義されます。
象限Q4の精子は断片化したDNAを持ち、蛍光顕微鏡下で赤色に見えます。これは重度のDNA断片化（DFIs）を示します。

象限Q2とQ4の精子は、断片化したDNAを含むと提案され、その合計はDFIcと定義されます。

フローサイトメーターのためのPGGの設定
フローサイトメトリー分析のための多角形ゲートは、Evensonらによって記述された方法に従って確立されました⁸。図3に示すように図3、各ゲートに関連する細胞の特性は以下の通りです：
P3は変性DNAを持つ細胞の割合を示します。
P4は高いDNA染色性（HDS）を持つ精子を表します。この精子のグループは通常のヒストンからプロタミンへの交換が欠如しています。
P3とP4ゲート外に位置する主要な細胞集団は、正常な精子であり、赤色蛍光が減少し、主に緑色蛍光を放出します。

精液サンプルの収集と分析
すべての121の精液サンプルは、南京医科大学付属淮安第一病院の生殖センターを訪れた男性からのものです。2〜7日間の禁欲期間後の自慰行為によって精液サンプルを収集しました。精液の定期的な分析は、WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semenの要件に厳密に従って行われました^11,12。精子の濃度と運動能の分析は、コンピューター支援精子分析システム（CASA）を使用して行われました。各サンプルは2回分析されました。2回の結果の差が95%の信頼区間内にある場合にのみ、平均値として結果が報告されました。そうでない場合は、再サンプリングと分析が行われました。

DFI分析
フローサイトメトリーキットの試薬A中の精子の最終濃度が2〜3 x 10⁶/mLになるように、精液サンプルの必要なサンプル量を計算します。計算方法：元のサンプルの精子の濃度がM x 10⁶/mLと仮定すると、必要な精液の量（μL）= 150/M。計算された精液量をフローサイトメーターチューブに加えます。次に、試薬A 50 μLを加え、優しく混合します。試薬B 100 μLを加え、優しく混合し、室温で30秒間インキュベートします。直ちに試薬C 300 μLを加え、優しく混合します。フローサイトメーター上のCFGとPGGを使用してサンプルを検出し、少なくとも5000個の精子を分析します。

統計分析
データはGraphPad Prism 6.0を使用して統計分析されました。Bland-Altmanプロットが構築され、平均値と差を計算して、PGGとCFGの間の合意レベルを評価しました。2つの方法の差は、それらの平均値に対してプロットされました。さらに、Pearsonの方法を使用してPGGとCFGの相関関係を分析しました。p値が0.05未満であることが統計的に有意であると判断されました。

Results

121人の研究参加者（平均年齢：32.5 ± 4.9歳、範囲：26–44歳）のうち、28人が無力精子症と診断され、4人が少精子症と診断されました。基礎的な人口統計学的特性と精液分析のパラメータは、表1にまとめられています。

図4に示すように、Bland-Altmanプロットでは、PGG法とCFG法で得られた精子DFIの結果は優れた一貫性を示しました（r = 0.9667、p = 0.0000）。2サンプルのみが+10％を超える差異を示し、3サンプルが-10％未満の差異を示し、その割合はそれぞれ1.7％と2.5％でした。

表2は、PGG法で得られたDFIpとCFG法で得られた3つのパラメータ（DFIm、DFIs、DFIc）の間に強い正の相関があることを示しています。相関係数は0.6497、0.9404、0.9667で、p値はすべて0.05未満でした。PGG法で検出されたHDSは、CFG法で検出されたDFIsとDFIcとの間に有意な負の相関がありました。相関係数はそれぞれ-0.3042と-0.2120で、p値はすべて0.05未満でした。調査により、HDSとDFImの間には相関が認められませんでした（p値は0.05を超えました）。

表3に示すように、精子の運動能は、DFIp、DFIm、DFIs、DFIc（すべてのp値は0.05未満）と有意な負の相関を示しましたが、HDS（p値は0.05を超えました）とは相関しませんでした。精液量は、DFIp、DFIs、DFIc（すべてのp値は0.05未満）と有意な正の相関を示しましたが、HDS（p値は0.05を超えました）とは相関しませんでした。精子濃度と総精子数は、PGGとCFGの分析結果との間に相関が認められませんでした（p値は0.05を超えました）。

CFG法はDFI評価においてPGGと優れた一貫性を示します。CFGはDNA損傷の程度を区別でき、そのDFIパラメータは精子の運動能と有意な相関があります。重度の精子DNA損傷を示す指標であるDFIsは、臨床実践での広範な使用に適しています。

データの利用可能性：
この研究を通じて生成および/または分析されたデータセットには、患者レベルの臨床データが含まれており、機関のプライバシーおよび倫理的考慮から公開されていません。南京医科大学付属淮安第一人民病院の倫理委員会の承認を得た上で合理的な要求を提出した場合、対応する著者は匿名化されたデータと分析結果を提供する権限を持っています。この研究では、カスタムコードの開発は含まれていません。

図1: ワークフローの全体的な概略図。 こちらをクリックして、この図の大きなバージョンをご覧ください。

図2: DFI検出のためのフローサイトメトリーの十字形ゲーティング（CFG）。Q1 – 正常精子。Q2 – 軽度のDNA断片化（DFIm）。Q3 – 差し引かれた非特異的な蛍光。Q4 – 重度のDNA断片化（DFIs）。DNA損傷のある精子はQ2とQ4の両方に分類されます。これらを合計すると、総DNA断片化精子群（DFIc）になります。 こちらをクリックして、この図の大きなバージョンをご覧ください。

図3: DFI検出のためのフローサイトメトリーの多角形ゲーティング（PGG）。P3：変性DNAを持つ精子。P4：高DNA染色性（HDS） こちらをクリックして、この図の大きなバージョンをご覧ください。

図4: PGGおよびCFGアッセイによるDFIの結果のBland-Altmanプロット。X - 軸：PGG法とCFG法で得られた測定結果の平均値。Y - 軸：PGG法とCFG法の測定結果の差 こちらをクリックして、この図の大きなバージョンをご覧ください。

項目	平均±SD	範囲
年齢（歳）	32.5±4.9	26-44
禁欲日数（日）	4.1±1.3	3-7
精液量（mL）	3.8±1.6	0.5-6.8
精子濃度（×106/mL）	52.0±35.5	10.3-185.1
進行運動能（％）	42.8±14.9	5.2-66.3
総運動能（％）	52.8±15.9	9.6-78.6

Discussion

WHOのヒト精液検査および処理のための検査室マニュアル第6版¹²は、精子のDNA完全性を評価するための4つの方法を推奨しています：末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（dUTP）ニックエンドラベリング（TUNEL）、シングルセルゲル電気泳動（コメット）アッセイ、SCSA、精子クロマチン分散（SCD）検査。これらの中で、SCSAは解析にフローサイトメトリーを使用するため、高いスループット、効率、客観性を提供し、DFIやHDS⁷などのパラメータを同時に報告できる能力により、男性科検査室で広く採用されています。世界的な調査⁷によると、世界中の生殖医療医のほぼ4分の1（24.1%）がSCSAを精子のDNA完全性を評価する方法として選択しています。

SCSA手順で最も重要なステップは、適切なフローサイトメトリゲーティングを確立することです。従来のPGG法では、DNA鎖の破壊片（DFI）とDNA染色の高異常（HDS）の精子を検出でき、正常なヒストンとプロタミンの交換の欠如によって特徴づけられます¹³。しかし、精子のDNAの単鎖切断と二重鎖切断を区別することはできません。近年、Yangら¹⁰はフローサイトメトリーを使用してDFIを分析するためのCFG法を確立し、精子のDNA損傷の重症度を区別できます。この方法の重要なステップは、フローサイトメーター用の十字形ゲートの設定です。CFG法は優れた重複性（変動係数は5％未満）とDFI検出の線形範囲（8.93％から53.90％）を示します。この方法は3つの指標—DFIm、DFIs、およびDFIc—を報告しますが、HDSの結果は提供しません¹⁰。

この研究では、CFG法の総DFI（DFIc）がPGG法（DFIp）のそれと良好な一致を示しました。相関分析により、DFIsとDFIpの相関係数がDFImよりも有意に高いことが明らかになりました。精子濃度または総精子数は、CFG法またはPGG法の結果と相関していません。PR（％）および4種類のDFI（DFIm、DFIs、DFIc、DFIp）はすべて相関して負の相関を示しました。PR（％）はDFIの4種類（DFIm、DFIs、DFIc、DFIp）とすべて相関して負の相関を示しました。DFIm（r = -0.1975）との相関は、DFIs、DFIc、およびDFIp（r = -0.3794、-0.3574、-0.3824、それぞれ）と比べて有意に弱かったです。これらの発見は、Yangら¹⁰によって報告されたものと一致しています。さらに、DFIsとDFIcは精液量と良好な相関を示しましたが、DFImは示しませんでした。基本的な精液パラメータと密接に一致する指標の臨床的有用性は限られている可能性がありますが、この発見は、重度の精子DNA損傷指標（DFIs）が精子形成の異なる病理学的側面を反映する可能性があることを示唆しています。さらに重要なのは、相関分析で示されているように、DFIsはDFImと比較して、進行的に運動する精子の割合と有意に強い関連を示し、従来の精液分析を超えた男性の生殖能力評価における補完的な指標としての潜在的をさらに支持しています。

HDSは、正常なヒストンとプロタミンの交換を欠く未熟精子の割合を表します。HDSの精子におけるプロタミン1前駆体は、通常切断される末端アミノ酸を保持します⁸、これにより適切なクロマチン凝縮が妨げられ、dsDNAのアクリジンオレンジ染色の増加をもたらす可能性があります。以前の研究では、精子のクロマチン欠陥を記述する上でHDSの重要性が強調されています。Linらの研究¹⁴およびVirroらの研究¹⁵は、HDS > 15％の男性における体外受精（IVF）の流産率が有意に高いことを示しています。しかし、最近の発見は、HDSがCMA3、AB、TB染色結果との弱い相関関係のため、核の未熟を信頼して示す可能性が低いことを示唆しています¹⁶。したがって、HDSは男性の生殖能力の指標として適していない可能性があります¹⁷。この研究では、HDSと精液量、精子濃度、運動性などの基本的な精液パラメータの間に有意な相関がないこともあります。したがって、HDSは精子のDNA完全性のマーカーとして推奨されません¹⁸。

DFI検出プロセス中、蛍光境界の不一致が生じる可能性があります。この現象は主に異なる検体の間で精子の濃度と運動性に大きな変動があることによります。この問題に対処するために、死んだ精子、破片、および他の非特異的シグナルを除外するために適切なゲーティングを使用することを推奨します。このアプローチはデータの正確性を高め、不一致の蛍光境界の問題を軽減します。

当社の知る限り、これはPGGとCFG法の分析結果を比較した最初の研究です。この研究の制限は、単一センターの小規模サンプル設計であり、その結論は多センター、大規模サンプルの研究を通じてさらなる検証が必要です。将来の研究方向には、異なるフローサイトメーター間での精子DFI検査結果の一貫性を確保することと、精子DFIsが生殖補助医療の結果を予測できるかどうかを判断することが含まれます。

結論として、CFG法は精子のDNA完全性についてより多くのパラメータを提供します。具体的には、DFImとDFIsは、軽度および重度のDNA損傷を持つ精子の割合を反映しています。DFIcとDFIpの結果は良好な一貫性を示します。CFG法は臨床応用と推進に適しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
コンピュータ支援精子分析システム	北京瑞佳ソフトウェア株式会社	SA-II
フローサイトメーター	深圳Mindray生物医学電子株式会社	Cyto E6
フローサイトメトリーキット	深圳BREDバイオテクノロジー株式会社
マックラー計数チャンバー	Sefi医療機器
精子核DNA完全性キット	深圳BREDバイオテクノロジー株式会社	-