このプロトコルは、ラズベリーパイによって制御されるDIY(DIY)低コストの三次元(3D)タイムラプスイメージングプラットフォームを説明しており、標準的なインキュベーター内で使用するために作られています。プログラム可能な発光ダイオード(LED)照明を用いて明視野または斜めのイメージングを実現し、オープンソースのPythonソフトウェアを自動タイムラプスワークフローで動作させます。
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方法論記事
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このプロトコルは、ラズベリーパイによって制御されるDIY(DIY)低コストの三次元(3D)タイムラプスイメージングプラットフォームを説明しており、標準的なインキュベーター内で使用するために作られています。プログラム可能な発光ダイオード(LED)照明を用いて明視野または斜めのイメージングを実現し、オープンソースのPythonソフトウェアを自動タイムラプスワークフローで動作させます。
統合型インキュベーター顕微鏡システムやオールインワンのタイムラプス培養インキュベーターは、高価で独自仕様であるため、アクセスやカスタマイズ性が制限されます。オープンソースの代替手段は存在しますが、イメージング性能、照明制御、適応性のトレードオフを伴うことが多いです。ここでは、標準的な細胞培養インキュベーター内で使用するために設計されたDIY(DIY)低コストの3Dプリントタイムラプスイメージングプラットフォームについて説明します。このデバイスは、ステッパーモーター駆動のラズベリーパイベースのコントローラーと、明視野照明モードと斜め照明モードの両方を可能にするプログラム可能な発光ダイオード(LED)バックライトを採用しています。システムは、オープンソースのPythonソフトウェアによる自動マルチウェルイメージング、スケジュールされたタイムラプス取得、リアルタイムプレビューをサポートしています。性能検証により、培養細胞および初期胚の長期イメージングが安定し、インキュベーター条件下で安定した動作が可能であることが示されました。アメリカ空軍(USAF)1951年製のターゲットを用いた光学分解能試験では、約1.55μmの最小解読可能な特徴が確認されました。運動評価では、ドリフトが低く、高い再現性が示され、位置決め精度は指令された変位とほぼ一致していました。このシステムは複数のプレートフォーマットに対応しており、特殊な培養セットアップにも適応可能です。全体として、このプラットフォームは実験室環境での長期的な生細胞および胚イメージングにおいて、コスト効率が高く再現可能かつカスタマイズ可能なソリューションを提供します。
生細胞イメージングは、細胞増殖1,2、分化3、移動4、そして特にIVF実験室での胚質評価のための初期胚発生を含む動的な細胞プロセスの調査に広く応用されています。既存のソリューションは主にチャンバー式顕微鏡システム7と統合タイムラプスインキュベーター8です。これらのプラットフォームは制御された環境条件下での長時間のタイムラプスイメージングを可能にしますが、依然として高価でほぼクローズドソースです9。これらの制限は小規模な研究室でのアクセスを制限し、カスタマイズされた実験ワークフローや専門的な研究シナリオの柔軟性を制限しています(10,11)。
近年、多くのカスタマイズされた画像システムが導入されています。マーセスら。 3Dプリンターの機械的枠組みから構成され、インキュベーター7内で操作された経済的な顕微鏡が、柔軟でアクセスしやすいアプローチを示しました。バドンら Incabascope15は、低コストで操作が容易で強力なイメージング性能を実現するコンパクトなカスタム顕微鏡を開発しました。Zehrerらは、高分解能蛍光イメージングを組み込むことで画像能力をさらに強化したオープンソースの自動蛍光顕微鏡16を記述しました。追加のインキュベーター型システムも提案されています。EmSightは Kimらによって設計され、フーリエ顕微鏡を用いて多角度観察をサポートします。17、Picroscope(Lyら)は複数のサンプルにわたる縦断イメージングを可能にします。これらのシステムはインキュベーターベースのイメージングの異なる側面に対応していますが、それぞれ特定の用途やプレートフォーマットに合わせてカスタマイズされており、より広範な互換性や大規模なイメージングの機会を残しています。設計によってはコストが高いものもあれば、完全なオープンソースでないため、複製や改変が困難になることもあります。
ここでは、3Dプリント部品、カスタム設計のプリント基板(PCB)、そして一般的に入手可能な標準部品から作られたインインキュベーターイメージングシステムを紹介します。このシステムは簡単な手順で組み立て可能で、交換可能なプレートホルダーを使用することで、6、12、24、96ウェルのプレートのフルカバーに対応します。また、12ウェル胚培養皿など、特殊な培養形式にも適応可能です。このシステムは、プログラム可能なバックライトを組み合わせ、巧妙で効率的な照明ソリューションを提供し、低コストで高解像度カメラを搭載し、優れた撮影性能を維持しています。この組み合わせにより、長期のライブセルイメージングにおいて安定した照明と信頼性の高い画像品質が保証されます。
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腫瘍細胞株および動物胚は、四川大学のNHC時系列生物学重点研究所から取得され、地方の機関審査委員会および倫理委員会が承認したプロトコル、ならびに関連する国家規則に従って取り扱われました。この方法は、十分な実験的検証なしに臨床現場に直接適用したり、ヒト胚培養に使用したりしてはなりません。
注:ハードウェア(PCB設計ファイルおよび3Dモデル/STLファイル)はCERNオープンハードウェアライセンスバージョン2 – Strongly Reciprocal(CERN-OHL-S-2.0)でリリースされ、ソフトウェア(コントローラーデスクトップGUIおよびRaspberry Piバックエンド)はMITライセンスの下でリリースされています。すべての設計ファイルとソースコードはプロジェクトのGitHubリポジトリを通じて公開されています。
1. 3D印刷
2. Z軸およびイメージングモジュールの組み立て(図1)

図1:Z軸フォーカス機構およびイメージングモジュールの組み立て。 Z軸フォーカシングシステムおよびイメージングモジュールの組み立てプロセスのステップバイステップのイラスト。(A) 部品取り付け用のナットを埋め込んだZ軸ブラケットの準備。(B) CSIケーブルホルダーやフランジナットを含む補助部品の取り付け。(C)対物レンズ、チューブレンズ、アダプターを含む光学モジュールの組み立て、その後支持ブラケットへの統合。(D) 光モジュールをZ軸ブラケットに取り付け、光軸をCMOSセンサー開口部に合わせること。(E) Z軸ブラケットにリニアベアリングを取り付けること。(F) ガイドロッド、フランジ部品、リニアベアリング、ステッピングモーターを統合して運動系を形成すること。(G) ガイドロッドによるZ軸ブラケットの結合と、リードスクリューとナットの噛み合い。(H) CMOSイメージングモジュール(Raspberry Pi Camera V2)をシステムに取り付けること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
3. 中間フレームの動作プラットフォームの組み立て(図2)

図2:中間フレームとXYモーション機構の組み立て。 中間フレームの組み立て過程とXY並進運動系の段階的な図解。(A) 中央フレームにX軸ガイドレールと取り付けブラケットを取り付けること。(B) Y軸ブラケットをX軸ガイドレールに組み込み、リードスクリューナットの統合。(C) X軸ステッピングモーターの取り付けとリードスクリューとの連結。(D) Y軸リードスクリュー、モーター、ガイドロッド、ベアリング部品の統合により、動作システムを完成させる。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
4. バックライトと筐体の組み立て(図3)

図3:エンクロージャーとバックライトモジュールの組み立て図。 エンクロージャーと統合バックライトシステムの組み立てプロセスのステップバイステップのイラスト。(A) モーターケーブルの中央フレーム下を通し、ドライバーボードに接続すること。(B) Raspberry Pi Zeroやドライバーボードを含む制御部品を下部エンクロージャーに取り付けること。(C) 電源およびバックライト接続を外部コネクタと統合すること。(D) 中央フレームを下部囲いに配置・整列し、電気接続が完了すること。(E) 透明板の設置および上下の囲いの組み立て。(F)環境隔離を改善するための囲いの密閉。(G)ウェルプレートホルダーを観測窓に設置すること。(H) バックライトモジュールの組み立てと筐体への統合。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
5. 電子機器と配線(図4)

図4:主要な電子部品とシステム統合。 システムで使用される主要な電子部品とその組み立て構成の概要。上部の列には、Raspberry Pi Zero 2 W、TMC2209ドライバーモジュール、コントローラーボード、Raspberry Pi Camera V2、イルミネーションアレイボードなどの個別コンポーネントが示されています。下段には組み立てられた制御回路とドライバー回路が示されており、ラズベリーパイはコントローラーボードやモータードライバーと統合されており、マルチウェルプレート照明用に設定されたバックライトLEDアレイも含まれています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
注:図4は本プロジェクトで使用された最も重要な電子部品を示しており、残りの項目は材料表に記載されています。コントローラーボードと照明アレイボードは大量生産されていません。PCB設計ファイルはGitHubリポジトリまたは補足ファイル(補足ファイル1)の「PCB」ディレクトリで公開されています。このリポジトリには、回路図、Gerber製造ファイル、材料表(BOM)が含まれています。ユーザーはこれらのファイルをダウンロードし、PCBメーカーに提出してカスタム製造を行うことができます。部品は手動でハンダ付けすることもあれば、SMT組立サービスを利用して直接完全に組み立てられた基板を入手することも可能です。
6. ソフトウェアのインストールと設定(図5)

図5:制御ソフトウェアのユーザーインターフェース。 システム制御、画像取得、自動ウェルプレートスキャンに使用されるグラフィカルユーザーインターフェースの概要。(A) プレビューインターフェース:リアルタイム画像取得を表示し、照明設定、画像キャプチャ、手動ステージ移動のコントロールを含みます。(B) キャプチャタスクインターフェース:自動スキャン用のマルチウェルプレートレイアウト、ウェル選択、取得パラメータ、タスク実行制御を表示。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
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解像度試験
イメージングモジュールの光学分解能を評価するため、米空軍の1951年解像度ターゲットを明視野照射下で10×対物レンズを用いて撮影しました。RAW画像は3840ピクセル×2160ピクセルで撮影されました。 図6Aに示すように、拡大した中央領域では線対パターンが明確に分解されました。目視検査に基づき、最も小さく解読可能な特徴は1951年の米空軍標的のグループ8、エレメント3で、ラインペアは識別可能でしたがコントラストは低下していました。より細かい要素(例:グループ8、要素4)は解消できませんでした。標準的な米空軍1951年のチャートによると、これは空間周波数322.5ラインペア/mmに相当し、約1.55μmの線幅に相当します。
図6B は明視野で撮影されたBV2セルを示しており、角と中央の領域は同じ解像度で表示されます。中央部は鮮明に見えますが、視野...
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このDIYプラットフォーム(図10)は、コンパクトな光学レイアウト、プログラム可能な照明、オープンソース制御ソフトウェアを統合し、標準的なインキュベーター内での長期画像撮影のためのアクセス可能なソリューションを提供します。市販のタイムラプスインキュベーターや統合イメージングシステム7,8と比較して、この3Dプリントプラットフォームは、培養細胞や初期胚の日常的観察に必要な解像度を維持しつつ、コストを大幅に削減します。このシステムは、追加の光学的または機械的部品なしで明視野と斜めの両方の照明をサポートし、異なる試料タイプや撮影条件に応じてコントラストを調整できるプログラム可能なLEDバックライトの実用的な利点を示しています。
いくつかの制限点が指摘されました。解像度試験実験では、視野の端に向かってわずかなピントの合いと明るさの低下が観察されまし...
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著者は本原稿で記述された製品に金銭的利害関係を持たず、他に開示する情報もありません。
この研究は、四川大学国立衛生委員会時間生物学重点研究所開設基金(NHCC-2023-02)、四川省医学研究プロジェクト(S22014)、成都医学科学研究プロジェクト(2024112)、成都科学技術プロジェクト(2024-YF05-00877-SN)、四川母子保健協会科学研究プロジェクト(2024FX01)、および成都の星林学者学科人材科学研究促進プログラムの支援を受けました中医大学(ZYTS2024012年)。著者らは、NHCクロノバイオロジーキーラボラトリーに重要な支援を提供してくださったこと、そしてプロジェクトを通じて貴重な支援をしてくださった陳邦珠氏に心から感謝申し上げます。グラフィカルアブストラクトはBioRenderを使用して作成されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10回以上;LWDインフィニティ・オブジェクティブ | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=750667327346 | 無限修正長距離目標、10倍; |
| 2 & 倍;20ピン オスヘッダー | 標準部品 | – | 2.54 mmピッチ GPIOヘッダー;数量:1 |
| 5mm内径ボールベアリング | 標準部品 | – | φ5 & times;10 & times;5mmボールベアリング;数量:1 |
| 航空コネクター | 標準部品 | – | 2ピンおよび3ピンの航空プラグ、数量:2 |
| カメラモジュール(IMX219) | ラズベリーパイ | IMX219 | ラズベリーパイカメラV2;数量:1 |
| CSIケーブルホルダーA | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - csi_cable_holder_A.STL |
| CSIケーブルホルダーB | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - csi_cable_holder_B.STL |
| 拡散アクリルプレート | 標準部品 | – | 72回以上;厚さ107mm、厚さ1mm;数量:1 |
| 囲いの下部 | 習慣 | 習慣 | 3Dプリント部品:3Dプリント - enclosure_lower。STL |
| 囲いの上部 | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - enclosure_upper。STL |
| 一般的なウェルプレートホルダー | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - general_well-plate_holder。STL |
| 高透過性アクリル板 | 標準部品 | – | 116回と時間;厚さ194mm、厚さ2mm;数量:1 |
| 軽弾A | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - light_shell_A.STL |
| 軽弾B | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - light_shell_B.STL |
| リニアベアリング LM5UU | 標準部品 | LM5UU | φ5 & times;10 & times;15mmリニアベアリング;数量:4 |
| M2 沈み込みセルフタップスクリュー | 標準部品 | – | M2 & times;8mm;数量:4 |
| M2 セルフタップ式ボタンヘッドスクリュー | 標準部品 | – | M2 & times;10mm;数量:8 |
| M2.5 六角ソケットネジ(10 mm) | 標準部品 | – | M2.5 & times;10mm;数量:12 |
| M2.5 六角ソケットネジ(8 mm) | 標準部品 | – | M2.5 & times;8mm;数量:12 |
| M3ボタンヘッドスクリュー | 標準部品 | – | M3 & 時間;20mm;数量:4 |
| M3ボタンヘッドスクリュー+M3ナットセット(10mm) | 標準部品 | – | M3 & 時間;10mmネジ+M3ナット;数量:20セット |
| M3ボタンヘッドスクリュー+M3ナットセット(12mm) | 標準部品 | – | M3 & 時間;12mmネジ+M3ナット;数量:20セット |
| M3ボタンヘッドスクリュー+M3ナットセット(15mm) | 標準部品 | – | M3 & 時間;15mmネジ+M3ナット;数量:20セット |
| メインボードブラケット | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - mainboard_bracket。STL |
| microSDカード | 標準部品 | – | 最低8GB;推奨32GB以上) |
| 中間フレーム | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - middle_frame。STL |
| OpenLapseコントローラーボード | 習慣 | 習慣 | 補足ファイルで利用可能なPCBファイル |
| OpenLapse イルミネーションアレイボード | 習慣 | 習慣 | 補足ファイルで利用可能なPCBファイル |
| ラズベリーパイカメラFPCケーブル | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=774536454547 | 22ピンから15ピン、40mm CSIケーブル |
| ラズベリーパイ ゼロ 2 W | ラズベリーパイ | – | 主制御コンピュータ;数量:1 |
| RMSからSMLへのアダプターリング | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=711654577589 | RMSからSMLへの変換リング |
| SML括弧 | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - SML_bracket。STL |
| SML05 チューブホルダー | 標準部品 | SML05(https://detail.tmall.com/item.htm?id=613460973426 年) | 光学ホルダー |
| SMLRR保持リング | 標準部品 | SMLRR(https://detail.tmall.com/item.htm?id=613460973426) | 保持リング |
| T5カットフランジリードスクリューナット(2mmピッチ) | 標準部品 | – | T5 & times;2 mmピッチのリードスクリューナット;数量:2 |
| T5リードスクリューナット(2mmピッチ) | 標準部品 | – | T5 & times;2 mmピッチのリードスクリューナット;数量:1 |
| TMC2209 ドライバーモジュール | MKS | TMC2209(https://item.taobao.com/item.htm?id=782341270726 年) | ステッピングモータードライバー |
| チューブレンズ | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=590466758183 | φ25.4 mm、焦点距離 50 mm |
| X軸ブラケット | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - x-axis_bracket。STL |
| X軸リードスクリューステッピングモーター | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=922508067421 | T5および時間を持つ28シリーズモーター;リードスクリュー200mm、ピッチ2mmです |
| 客車付きX軸リニアレール | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=837345295063 | MGW9-200mmレール、MGW9H砲架 |
| XH 2.54mm 3ピンケーブル | 標準部品 | – | オス対オス接続ケーブル、400 mm;数量:1 |
| Y軸括弧A | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - y-axis_bracket_A.STL |
| Y軸括弧B | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3D-Print - y-axis_bracket_B.STL |
| Y軸ガイドロッド | 標準部品 | – | φ5 & times;170mmの精密軸;数量:1 |
| Y軸リードスクリューステッピングモーター | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=788375595753 | T5および時間を持つ28シリーズモーター;リードスクリュー150mm、ピッチ2mmです |
| Z軸括弧A | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3Dプリント - z-axis_bracket_A.STL |
| Z軸括弧B | 習慣 | 習慣 | 3Dプリントコンポーネント:3D-Print - z-axis_bracket_B.STL |
| Z軸ガイドロッド | 標準部品 | – | φ5 & times;80mmの精密軸;数量:1 |
| Z軸リードスクリューステッピングモーター | 標準部品 | https://item.taobao.com/item.htm?id=922508067421 | T5および時間を持つ28シリーズモーター;50mmリードスクリュー、2mmピッチ |
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