シリンジポンプシステムを用いて、 体外 マウスの眼における流出施設と眼の遵守性を測定する

サマリー

既存の圧力制御灌流法からの分析手法を統合することで、マウスの目の流出施設および眼の遵守を評価するためのシンプルで低コストのシリンジポンプシステムを最適化しました。

要約

眼圧(IOP)を適切かつ安定したレベルに保つことは、眼の健康に不可欠です。小梁網目(TM)、シュレム管(SC)、および全角膜膜殻の生体力学的特性は、IOP恒常性において重要な役割を果たします。流出施設(C)は、TMおよびSCの房水排出効果を評価する重要なパラメータであり、眼のコンプライアンス(φ)は角膜の弾力性とTMおよびSCを通じた一時的な流出を反映しています。以前は、Cを評価するためにシンプルでコスト効率の良い注射器ポンプシステムが開発されていました。しかし、in vivo データ解析に単純な線形回帰を用いることは、TMおよびSC機能の特徴付けに限界があります。本研究では、シリンジポンプシステムは、確立された圧力制御眼圧灌流システムで開発された解析手法を適用して最適化されました。体 外 眼で測定されたCおよびφ値は、既に発表された灌流系値と比較され、報告範囲と整合しました。まとめると、このシンプルで低コストのシリンジポンプシステムは、TMおよびSCの生体力学的特性の評価を容易にします。

概要

眼圧(IOP)を適切かつ安定した水準に保つことは、眼の健康に不可欠です^。眼圧の持続的な上昇が緑内障の主なリスク因子^です。数か月または数年にわたる長期的な眼圧変動も^視力喪失に寄与します^。最近の研究では、日々の活動によって引き起こされる一時的な眼圧変動の別の形態が特定されており^、これも緑内^障の進行を加速させる^{可能性があります。}例えば、20年間まぶたをこすり続けてきた46歳の男性と、10年間こすり続けていた52歳の男性は、どちらも加速した視神経乳^{頭損傷を示しました。}これらの発見は、視力喪失のリスクを最小限に抑えるために、眼圧の変化に対して適時かつ適切な対応が重要であることを強調しています。

IOPは房水(AH)の産生と排水のバランスによって調節されます¹⁰。AHは主に従来の経路と口頭鎖経路を通って眼から出ます¹¹。正常眼と緑内障眼の両方において、従来の経路である小梁網(TM)とシュレム管(SC)が、IOP恒常性12,13,14に影響を与える流出抵抗の主な原因です。したがって、TMとSCの生体力学的特性は、眼がIOP^15、16、17の変化に適応するために不可欠です。

近年の技術進歩により、AH流出のより正確な評価が可能になりました。重力ベースの灌流やシリンジポンプシステムなどの侵襲的アプローチが開発され、TMとSCが定常状態の流出18,19,20,21,22,23,24を制御する流出施設(C)を計算しています。トノグラ^フィー25やフルオロフォトメ^トリー26などの非侵襲的手法が、緑内障患者のC判定に臨床的に用いられています。しかし、ほとんどのアプローチはTMおよびSCの機能を特有に評価することはできません。例えば、シリンジポンプシステムでは、定常状態の流量と圧力データを単純な線形回帰を用いて適用し、傾きを圧力依存のCとして解釈します。しかし、この生マウスでの計算されたCは、ゴールドマン方程式で記述されるAH分泌、羊ドレーベルの流出、強膜上静脈圧の影響を受けるため、従来の経路を通じたAHの流出能力を正確に反映することはできません。

この制限に対処するため、Millarらは、安楽死後のAH流入なし、強膜上層静脈圧なし、静脈流出が変化しないという仮定に基づき、同じマウスの目におけるAH流入、従来型流出、そして試管束強膜流出を複数の定流測定で計算^{しました。}2016年、Sherwoodらは、体 外 眼で0 mmHgの時点で胞子強膜の流出が0であると報告し、iPerfusion(以下パーフュージョンシステムと呼ばれる圧力制御灌流系)を用いたべき法則モデルを導入して同じ問題に取り組んだ²⁷。方法論の進歩により、TMとSCの異なる役割が明確になり、定常状態のAH流出を維持する生理的機能の理解が深まりました。

さらに、TMおよびSCの一時的なIOP変動への応答は、IOP恒常性を維持するために不可欠です。この動きを追跡するために、Xinらは位相感応光コヒーレンス断層撮影(OCT)を開発し、秒²⁸秒の時間スケールでの観察を可能にします。三次元のシリアルブロック面走査型電子顕微鏡は、この運動を超微^{細レベルで観察}できます。しかし、画像ベースの手法はTMおよびSCの生体力学的特性のみを推定し、一時的なAH排水の実際の値は得られません。2019年、iPerfusionを開発した後、Sherwoodらは眼のコンプライアンス(φ)を角膜の弾性およびTMおよびSCの過渡応答の重要な指標として算出^{しました。}この進展は、IOP変動に対するTMおよびSCの過渡的挙動を評価するための定量的パラメータを提供します。

これらのTMおよびSC機能評価の進展に基づき、本研究はC計算にべき乗則モデルを取り入れ、φ計算のための新しい手法を統合することでシリンジポンプシステムを改良しました。これらの測定値は、灌流システムを用いて得られた公開データと比較し、最適化されたシリンジポンプシステムが異 体外 マウスの眼における流出施設および眼のコンプライアンス評価に適しているかどうかを評価しました。

プロトコル

すべての実験は、眼科・視覚研究における動物利用に関するARVO声明および青島大学医療センターの実験動物ケア・使用ガイドライン(QDU-AEC-2022069)に従って実施されました。

1. 動物の選択と取り扱い

1. 5ヶ月齢のマウスで、遺伝的背景が50%C57BL/6、BALB/cが50%です。実験設計において性行為は考慮しないでください。
2. ネズミは23 ± 2°C、湿度50 ± 5%で、12時間/12時間の明暗サイクルで維持してください。

2. 眼圧測定

1. 密閉チャンバーで2.5%イソフルランと80%(vol/vol)酸素を投与して3.5分間マウスを麻酔します。
   注意:イソフルランは揮発性麻酔薬です。麻酔は換気の良い場所または適切な封じ込めシステムで行ってください。
2. マウスを操作プラットフォームに移します。マスクを着用してさらに30秒麻酔を維持してください。
3. すべての測定は9時から12時の間に行ってください。片目に3回測定を記録してください。各データポイントの平均値を計算します。

3. システム設定(図1)

1. 100μLの注射器を注射器ポンプに接続します。
2. 注射器をフロースルー圧力センサーに接続します。
3. センサーをデータ取得システムに接続します。
   注意:圧力センサーとアイホルダーが同じ高さに揃っているか確認し、圧力アーティファクトの発生を避けてください。
4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を1×充填します。すべての気泡を取り除いてください。
5. 目を円形の凹み(直径4〜6mm)のあるホルダーに入れます。カニュレーション中は眼が安定していることを確認してください。圧力センサーとアイホルダーを同じ高さに配置してください。
   注意:ずれは圧力測定誤差を引き起こすことがあります。カスタマイズされたアイホルダーのSTL設計ファイルは 補足ファイル1として提供されています。

4. ソフトウェア操作

1. 圧力センサーの校正
   1. データ取得ソフトウェアを開いてください。 キャリブレーションセットアップファイルを読み込みます。 キャリブレーション 関数を選択してください。
   2. システムを2つの指定された高さの貯水池に接続します。
   3. 換算を用いた入力圧力と実際の圧力:
      1 cm H₂O = 0.735 mmHg
2. ポンプのセットアップ
   1. モジュール設定を開きます。 レギュレーターの設定ファイルを読み込め。
   2. ポンプ装置を選択します。 最大流量 と 注射器の直径を入力します。
3. データ記録
   1. 録画を始めろ。
   2. 圧力の段階ごとに録画をやめてください。
   3. 次の圧力値を入力します。
   4. 録画を再開してください。

5. 針の準備

1. 定め^{られたプロトコルに従って}ガラスマイクロピペットを抽出します。
2. 先端を内径80〜100μmまで粉砕します。針先を磨きましょう。
   注意:ガラス針は怪我を避けるために注意して扱いましょう。
3. 針をマイクロマニピュレーターに取り付ける。針を圧力トランスデューサーに接続してください。
4. PBSで注射してください。
5. 針先を圧力センサーと同じ高さに配置してください。
6. 抵抗測定
   1. 圧力は1 mmHgをかけます。流量を記録してください。
   2. 針の抵抗を計算する:
      
   3. 抵抗値が0.01から0.5 mmHg/(μL/min)の針を使用します。

6. システム機能とコンプライアンス

1. 施設測定
   1. システムにPBSを注入してください。三方向バルブでシステムを密閉してください。
   2. 6、8、10、12、14、16 mmHgの圧力ステップをかけます。
   3. 各ステップでPとQを10分間記録します。直近5分の平均値を計算してください。
   4. 線形回帰を行います。この斜面をシステム施設として解釈してください。
2. 検証
   1. 測定を3回繰り返します。
   2. システム施設が0.2 nL/min/mmHg未満であることを確認してください。
3. コンプライアンス測定
   1. 35cmのシリコーンチューブをシステム内に挿入します。
   2. テフロンチューブの有無に適合性を測定してください。
   3. 離散体積法を用いて体積変化を計算します^。14。
   4. システムの適合性を4 nL/mmHgと測定します。
4. 感度チェック
   1. 検出可能なシステムコンプライアンスが9.9 nL/mmHgを超えていることを確認してください。

7. エヌクラエーション

1. CO2を0.7L/minの流量で3分間安楽死させます。
   注意:_CO2安楽死は人道的な終末を確実にするために機関のガイドラインに従う必要があります。
2. 無菌器具を使って眼外筋と視神経を解剖します。眼球を核を摘出してください。
3. すぐに片目を35.5°Cのホルダーに装着します。
4. 対側の眼は4°Cで保存します。
5. 同じ方法で両目を測定してください。

8. カニュレーション

1. 針の挿入
   1. 針を中央角膜に45°の角度で貫通します。
   2. 針を前腔に0.3〜0.5mmの深さまで差し込みます。
2. 検証
   1. システムを安定させろ。最後の5分間で圧力変動≤0.4 mmHgを確認してください。

9. 眼 球 C_r

1. 眼を8 mmHgで30分間安定させます。
2. 6、8、10、12、14、16 mmHgの圧力ステップをかけます。
3. 最後のステップは8 mmHgで適用します。
4. データ収集
   1. 最大流量を4 μL/minに設定してください。
   2. 各ステップでPとQを10分間記録します。
5. 分析
   1. P–T曲線とQ–T曲線をプロットします。直近5分の平均値を計算してください。
   2. べき乗則モデルへのフィットデータ²⁷:
      
6. _Cr(システム施設を差し引いた後)を眼の流出施設と定義します。
7. P _r = 8 mmHg をセットします。
8. βを非線形係数として定義します。

10. 眼 Φ_r

1. 圧力増分時にP–TおよびQ–T曲線を解析します。流量がQ_最大値に増加し、その後の減速を特定します。
2. 離散体積法³⁰_を用いて_tpとt最大値の体積変化を計算します。
3. 修正フリーデンヴァルト方程式³⁰へのフィットデータ:
   
4. 集合P_r = 13 mmHg。Φ_r(システムコンプライアンスを差し引いた後)を眼のコンプライアンスΦ_r、_目と定義し、γを材料パラメータとして定義します。

結果

最適化されたシリンジポンプシステムの性能は、5か月齢マウスのCおよびφと、圧力制御眼灌流研究の既存値を比較することで評価されました。 図2F のデータセットの正規性はShapiro–Wilk検定を用いて評価され、統計比較は両側対Student氏t検定を用いて行われました。

図2A–Cに示すように、眼圧(IOP)、眼球C(_C)、眼(_Φr)はそれぞれ14.0 mmHg(95%信頼区間:13.2–14.8 mmHg)、5.2 nL/min/mmHg(95%信頼区間:4.1–6.4 nL/min/mmHg)、46.0 nL/mmHg(95%信頼区間:40.6–51.3 nL/mmHg)でした。シリンジポンプシステムは、灌流システムを用いたものと同等の流出施設値を生み出しました(

ディスカッション

本研究は、マウスの目の流出施設および眼の遵守率を推定するための最適化されたシリンジポンプシステムを提示し、圧力制御眼圧灌流システムを用いた報告値と一致する値を得ています。本手法は、注射器を用いた測定の精度を向上させつつ、シンプルでアクセスしやすい実験環境を維持しています。この方法論的洗練とアクセスのしやすさの組み合わせは、より高度なシステムが容易に利用できない研究室でのより広範な採用を促進する可能性があります。

このシステムの主な利点は、データ精度の向上であり、AHの流出や眼の生体力学に関与する主要な遺伝子や分子経路の同定を可能にします。この改善により、緑内障に対する薬理学的介入や遺伝子操作が促進され、また微細な加年変化、早期の病変、短期間での治療反応のモニタリングも支援できます。例えば、Cの正確な評価は、TRPV4介在のカルシウム流入がTM力学の調節やAHの流出に影響を与える機械的感受性標的の発見を促進し^{ました。また}、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬	1×PBSバッファ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	10010023
イソフルラン	深圳リウッド生命科学有限公司、中国	R640
素材	100 & mu;L高精度シリンジ	ハミルトン	1710
ホウケイ酸ガラス	サター、ノバト、カリフォルニア州	BF100-50-10
使い捨て滅菌注射器	風林医療機器有限公司、中国江西	10ml
圧力センサー	ICUメディカル	PX26-015G
シリコーンチューブ	ルンゼ流体株式会社(中国・南京)および	該当なし
透明PTFE管	ルンゼ流体株式会社(中国・南京)および	該当なし
装備	フレーミング/ブラウンピペットプラー	サター、ノバト、カリフォルニア州	P-97
手動マイクロマニピュレーター	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)	M3301
金属浴	ビーバー生物学、中国蘇州	2016C
マイクロフォージ	成重科学機器研究所、東京、日本	MF830
マイクロピペットグラインダー	MPInstrument Co., Ltd., 武漢、中国	KDG-02
PZMIII ステレオズーム双眼鏡顕微鏡	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)	PZMIIIとnbsp;
シリンジポンプ	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)	AL-1000