方法論記事

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

143 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/70434

⸱

2026年5月15日

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

この記事について

サマリー

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。

要約

ショウジョウバエ の想像円板は、上皮の発達、パターン形成、再生のモデルとして長く研究されてきました。解剖された想像椎間板の抗体標識および画像診断は、発生過程や生理学的過程のマーカーとしてタンパク質発現パターンを可視化する上で重要です。この想像椎間板剥離と標識の方法は、トムリンソンとレディによって眼触角の想像椎間板の免疫電子顕微鏡法として開発されました。60マイクロウェルプレートを用い、溶液間で組織を移動させることで、組織サンプルへの個別化の注意をほとんど無駄にせずに実現します。単一の想像的な椎間板でも処理可能です。この方法は抗体やその他の試薬の少量のみを必要とします。この方法が他の小さな組織に応用されている例として、同じ方法で翼の想像円板を解剖しラベル付けする方法も示しています。同様の手法は、同サイズの小組織にも適用でき、抗体染色以外の組織化学的および標識処理にも応用可能です。

概要

ショウジョウバエの想像円板は胚発生時に分離され、幼虫内で分化せずに成長し、蛹期1で成虫の表皮構造に寄与する前駆組織です。彼らの研究は発達パターン形成メカニズムについて多くの洞察をもたらしており、特に眼と翼の想像円板がよく研究されています(2,3,4,5,6)。免疫組織化学は、想像中の円板における遺伝子発現の空間的・時間的パターンの調査や、細胞分裂や細胞死を含む細胞の挙動を特徴づけるのに特に有用です。

抗体標識された眼の想像円板の電子顕微鏡解析の追加要求を軽減するため、トムリンソンとレディは試薬使用に非常に経済的で、非常に高い信頼性とカスタマイズ性を提供する小規模なプロトコルを開発しました7。彼らの方法は印刷物で説明されていますが、動画は存在しません。この方法は他の想像円板(または他の組織)の標識にも容易に改良可能であり、眼触角の想像円板に加えて翼の想像円板にも適用可能です。

ショウジョウバエの想像中の円板に対する抗体標識は、任意の組織に適用される一般的な輪郭に従います(図1)。組織は培養前に、対象タンパク質に特異的な抗体で解離・固定されなければなりません。結合していない抗体が洗い流された後、標識された(多くは蛍光色の)二次抗体が追加され、一次抗体に結合し、一次抗体は固定組織内の目的タンパク質に結合します。未結合の二次抗体を除去するために洗浄した後、組織を顕微鏡で観察し、目的のタンパク質を可視化できます。この過程については多くの一般的な記述があり、想像中の椎間板や他のショウジョウバエ組織にも適用可能です11。ここでは、トムリンソン&レディ法のプロトコルが示されており、組織サンプルをマイクロウェルプレート上の小さなインキュベーションウェル間で個別に移し、各ステップで立体顕微鏡で観察します(図2)。この方法は、一度に少量の組織(数十サンプル)を染色するのに最適であり、大量のバッチ(数百個)には理想的ではありません。この方法は各ウェルに13μLの小さな溶液容量のみで済み、抗体が非常に少なく済みます。組織損失が最小限であるため、最小サンプル数は存在せず、単一の想像中の椎間板でも確実に処理可能です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 転写ツールの製作

  1. ペンチを使って直径0.005インチのタングステン線を約2.5cmほど切ります。鉗子を使ってワイヤーの一端をフックやループ状に成形します(図3)。もう一方の端を針ホルダーに差し込みます。これは液体の移動がほとんどない状態でディスクを移すために使用されます。ループは二つの中で使いやすいかもしれませんが、フックは溶液間で液体を移動させる量が少なくなります。

2. 眼触角の想像円板の解離と固定

  1. 幼虫は直径60mmのペトリ皿で~7.5mLの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)で洗浄し、ハエの媒体やその他のゴミを取り除きます。眼触角円盤ではなく翼の想像円板の解剖についてはステップ6を参照してください。これら両方の想像椎間板は体の前部に位置しています(図4)。
    注:PBSは2.1〜2.3のステップでリン酸バッファーの代わりに使用可能です。
  2. 幼虫を新鮮な緩衝剤を入れたペトリ皿に移します。
    注:一部の働き手は60mmペトリ皿の単一バッファード滴で個々の幼虫を解剖することを好みます。他のものは、うつり穴のスライドを使います。
  3. 解剖顕微鏡で観察する際は、幼虫を体の約50%の位置にピンセットで保持してください。もう一組細い鉗子を使って口のフックを掴み、引っ張ってください。眼触角の円板は口器に付着したまま取り出します。脳は眼球の板に付着したままになることもあります。
  4. ワイヤーツールを使って、剥離した組織を直径35mmの小さなペトリ皿に移し、そこに~3 mLの固定剤(例:3.7%ホルムアルデヒドを0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2)に浸し、37%ホルムアルデヒドを緩衝液で希釈して作ります。
    注意:ホルムアルデヒドの取り扱いは、現地で承認された安全手順に従ってください。3.7%ホルムアルデヒドは単純な固定剤で、多くの場合で満足のいくものですが、特定の抗原には他の固定剤が最適の場合もあります。PBSまたはPEM(0.1 M PIPES pH 7.0、2 mM MgSO4、 1 mM EGTA)は、0.1 Mリン酸ナトリウムの代わりに固定緩衝剤として使用されることがあり、ホルムアルデヒド溶液は濃縮液ではなく固体パラホルムアルデヒドを溶解して得ることもあります。固定系パラホルムアルデヒド-リジン-ピリオデート(PLP)は、より穏やかなタンパク質固定と炭水化物架橋を組み合わせ、膜構造をよりよく保存します12。例えば、 ショウジョウバエ の糖タンパク質であるスカブロスは、PLP固定後は抗原性を保持しますが、ホルムアルデヒド固定後は抗原性を持ちません。PLPは以下の通り新鮮に準備します:(1) 25mLの脱イオン水にパラホルマルデ粉末2gを加え、排気フード内の円錐形フラスコに入れて弱火でかき混ぜます。(2) ピペットを50%水酸化ナトリウムのストック溶液に浸し、微量の液体(1滴未満)を混合物に移します。パラホルムアルデヒドは数分以内に溶け、溶液が沸騰することはありません。8%ホルムアルデヒド溶液を冷却しながら、0.36gリジンを10 mLの脱イオン水、7.5 mL 0.1 M リン酸ナトリウム pH 7.2、2.5 mL 0.1 M Na2HPO4 に溶かし、氷で保管します。この冷温緩衝リジン溶液15 mLを、50 mLのスクリューキャップチューブで新鮮な8%ホルムアルデヒド5 mLおよび50 mgのナトリウム・ヘリデイレートと混ぜ、ボルテックスで混合して新鮮な状態で使用します。
  5. 室温で15〜20分後、剥離組織を0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)を含む別のペトリ皿に移します。
    注:PBSはリン酸バッファーの代わりに使用することも可能です。氷への固定は一部の抗原や、組織内で発現したGFPやRFPの内因性蛍光をイメージングしたい場合に好ましい場合があります。PLPの固執はいつも氷の上で45分間です。

3. 一次抗体によるブロッキングおよび培養

  1. 組織を35mmのペトリ皿に移し、3 mL NSG抗体洗浄バッファーを含み、ブロッキングを行います。ペトリ皿は氷で少なくとも15分間孵育してください。NSGは0.1Mリン酸ナトリウム緩衝剤(pH 7.2)、0.1%サポニン、5%の通常のヤギ血清です。洗浄バッファーストックは4°Cでろ過滅菌された状態で保管されます。
    注:特定の抗体に対して最適なウォッシュバッファーは異なる場合があります。例えば、サポニンは特に細胞膜を溶けやすく、イオン性でない軽度洗剤である一方で、核内の抗原検出には他の洗剤が適している場合があります。さらに、Jarmanらによって核無調タンパク質に対して開発された抗体は、NP40を洗剤として含むバッファーで最も免疫反応性が高いです 。代替ウォッシュバッファー(PDT、PBT、NSG)のレシピについては、 材料表 を参照してください。正常な血清をブロッキングタンパク質として使用する場合、理想的には二次抗体が産生される種からであるべきです。例えば、ヤギの二次抗体を使う場合は正常なヤギ血清、またはロバ二次抗体を使用する場合は正常なロバ血清です。実際には、これはほとんど影響を生みません。
  2. 細かい鉗子を用いてブロッキング中、マウスフックを除く眼触角の想像円板から不要な組織を取り除きます。今はマウスパーツを付けたままにして、移動を容易にしてください。
    注意:脳などの余分な組織も、染色や視認性に支障がなければスライドマウント(ステップ5.4)まで放置しても構いません。
  3. ブロッキング中にNSG中にmAb40-1a抗体溶液を1:100希釈して準備します。例:100 μL NSGに抗体1 μLを投与します。ピペッティングで混ぜて、渦巻きで混ぜないでください。
    注:mAb40-1aはベータガラクトシダーゼに対して作製されたモノクローナル抗体です。最適な抗体希釈および洗浄バッファーは使用する抗体によって異なります。
  4. 60ウェルのマイクロウェルミニトレイの第1カラムに最大6つのウェルにそれぞれ13μLの抗体溶液を加えます。直線的な側面を持つ円錐形マイクロウェルは、光学的明瞭さに重要です。6本以上の井戸が必要な場合は、2つ目のミニトレイを設置してください。
  5. できれば口器にまだ付着したままの眼触角の想像円板をワイヤーループまたはフックを使って一次抗体溶液に一つずつ移します。
    注:各ウェルに追加できる想像円板の数は抗体によって異なります。組織が多すぎると、一部の抗体が枯渇し、標識が低下することがあります。1井戸あたり5ペアで通常は満足のいくものです。したがって、60ウェルマイクロタイタープレートの6列を用いて~60枚のディスクを簡単にラベル付けできます。各行ごとに異なる抗体を使用できます。抗体溶液が再利用可能かどうかは、各症例に対する実証的な検証が必要です。私たちの研究室では日常的なことではありません。
  6. 板を蓋で閉じ、蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封してください。氷の上または4°Cで4時間から一晩孵化します。揺らす必要はありません。
    注:抗体培養の最適な時間と温度は抗体によって異なります。多くの場合、室温で1〜2時間で十分ですが、抗体によっては4°Cでの培養後により良い結果が得られることがあり、4°Cで一晩培養するのが便利な場合もあります。ごく稀なケースでは、2〜3日間の一次抗体培養が最適となることがあります。マイクロウェル蓋の密封は、4~時間を超える孵化時のみ必要です。

4. 二次抗体を用いた洗浄および培養

  1. 各抗体ウェルの後、次の3カラムに13μLのNSGバッファーを加え、サンプルは3回洗浄されます。サンプルを各井戸で順に5分間洗浄します。
  2. 洗浄中に、NSGバッファー中に蛍光共役の二次抗体を1:200–400希釈し、例:100 μL NSGに0.5 μLの抗体を準備します。ピペッティングで混ぜて、渦巻きで混ぜないでください。希釈前に二次抗体のストック溶液を最大速度で60秒遠心分離してください。抗体凝集体が組織表面に非特異的に結合する可能性があるためです。
    注意:最適な二次抗体希釈はメーカーによって異なる場合があります。アレクサまたはシアニン結合抗体は、複数の標識を容易にするために他の種のために差し引かれることもあります。
  3. 次の(5番目の)カラムに二次抗体溶液13 μLを加えます。
  4. ループまたはフックを使って二次抗体にサンプルを移します。
  5. 板を蓋で閉じ、蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封してください。氷で4時間、一晩孵卵します。
    注:抗体培養の最適な時間と温度は抗体によって異なります。多くの場合、室温で1〜2時間で十分ですが、抗体によっては4°Cでの培養後により良い結果が得られることがあり、4°Cで一晩培養するのが便利な場合もあります。マイクロウェル蓋の密封は、4~時間を超える孵化時のみ必要です。

5. 顕微鏡観察のための組織洗浄および固定

  1. 二次抗体ウェルの後、次の3カラムのウェルを13μL NSGで準備します。サンプルを各井戸に5分間移します。
  2. 試料を9番目の 井戸で最終洗浄液に移し、13μLの0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.2)を使用します。このバッファウォッシュは、ウォッシュバッファーに取り付け媒体中に沈殿する成分が含まれている場合に必要です。
  3. .最終(10番目の)柱に13μLのマウンティングメディウムを加えます。このマウンティングメディウムは、2%のN-プロピルガレートを75%グリセロールおよび25%0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2)に溶かして作られます。毎週、回転する台上で材料を混ぜて新しいマウント媒体を準備します。使用前に気泡が消えるまで待ちましょう。
    注:マウンティングメディアは市販されています。
  4. ピペットで20μLのマウンティングメディウムをクリーンな顕微鏡スライドに置きます。スライド上の培地にサンプルを転写します。これは不要な組織を取り除く最後の機会です。眼触角の口器は触角の円板から取り除かなければなりません。
  5. カバーガラスを重ねた際にサンプルが漂わないように配置するには、ワイヤーツールを使ってマウントのメインドロップからサンプルを引き出します。ピンセットで、気泡を発生させずに、きれいな#1.5厚の22mm x 40mmのカバーガラスを鉗子でスライドに優しく下ろします。
  6. スライドを段ボールのスライドホルダーに1時間置いて、マウンティングメディアが落ち着くまで待ちます。スライドを動かさないようにしてください。カバーガラスが動くと壊れやすいサンプルが損傷する恐れがあります。
  7. カバーガラスが沈殿したら、ネイルポリッシュで縁をシールします。この作業中はカバーガラスを動かしたり押したりしないでください。画像撮影前にネイルポリッシュを少なくとも1時間乾かしてください。
    注意:残念ながら、現在ほとんどの化粧用ネイルポリッシュはガラススライドに均一に広がらず有用でないため、科学的なネイルポリッシュを入手する必要があります。
  8. スライドは4°Cで保管してください。 サンプルは通常、数か月にわたって画像化と再画像化が可能です。
    注:スライドは-20°Cでも保存可能です。

6. 翼の想像円板の解剖と固定

  1. 眼触角の想像円板ではなく翼の想像円板を解剖するには、上記のステップ2.3–2.5の代わりに以下の手順に従ってください。
  2. 解剖顕微鏡の下で、幼虫の口器を細かい鉗子で握ります。顕微解剖ハサミを使い、幼虫を前方から30〜40%下の位置で二分します。
  3. 幼虫の前半部を逆さにします。幼虫の開いた切断された端を、もう一対の鉗子で広げ、頭部と口器を押し込むことで、靴下を逆さにするのと同じ方法です
  4. 鉗子を使って逆さまの前方幼虫を固定液に移し、直径35mmの小さなペトリ皿に~2.5 mLの固定液(例:3.7%ホルムアルデヒドを0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.2)に浸し、37%ホルムアルデヒドをPBSに希釈して作ります。
    注:必要に応じて、逆さまのキャスをマイクロフージチューブ内の400μL固定剤に移すことも可能で、これによりフームフードでの固定が容易になります。眼の想像椎間板固定に利用可能な固定剤は、翼椎間板固定にも適用されます(ステップ2.4の注意参照)。眼触角の想像円板の最適な固定方法およびラベル付けは、翼の椎間板でも通常同じです。
  5. 室温で15〜20分後、剥離組織を0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)を含む別のペトリ皿に移します。
    注意:眼の想像椎間板固定に利用可能なウォッシュバッファーは、翼椎間板固定にも適用されます(ステップ2.4の注意参照)。眼触角の想像円板をラベル付けする最適な洗浄バッファーは通常、翼の円板でも同じです。
  6. 幼虫から翅の椎間盤を細かい鉗子で取り除きます。まだ残っている場合は、小さなハルタールの円板と脚の椎間板を今すぐ取り外すか、翼の椎間板に付けたまま移動を容易にすることができます。
    注意:脂肪体や他の組織が取り除かれない限り、翼の椎間板は死骸の中でははっきり見えない場合があります(必ず組織を特定してから取り除いてください)。翼の円板は想像上最大の椎間板で、体壁に付着し、気管と密接に結びついています。彼らは涙滴型の形状をしており、南アメリカ1 号の輪郭(図4)に似ています。
  7. 上記のステップ3〜5を続けてください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

figure-results-1
図1:想像椎間板の抗体標識に関わる手順の概要。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

トムリンソン&レディ法を用いた60ウェル円錐孔プレートを用いた ショウジョウバエ 組織の抗体染色は、各操作時に各想像円板を解剖顕微鏡で追跡するため、優れた結果と高い信頼性を得られます。この方法は少量の抗体試薬で済み、サンプルをほとんど含まない液体で移動するため、各工程で溶液の交換がより完全に行われます。特に、サンプルを個別に観察しない場合、大量に失われたり損傷したりしやすい少量のサンプルを扱うのに適しています。この方法は特に有用です。(1) 採取可能なサンプル数がごく限られている場合、例えば (i) 対象遺伝子型の取得が困難、または (ii) 幼虫が実験処理を受けて個体数が制限されている場合;(2) サンプルは個別に処理されなければなりません。例えば、同一個体の左右の椎間板に異なる抗体を付けたり、同じ個体の眼触角や翼の椎間板にラベルを付けたりする。(3) 複数のサンプルを並行して処理すること。例えば、各プレートは最大6つの遺伝子型を並行処理したり、1つの遺伝子型を6通りの異なる方法でラベル付けしたりすることができます。(4) 洗浄は正確に管理されなけれ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

NEBは方法を共有してくれたアンドリュー・トムリンソンと、改良を担当したルーシー・ファースに感謝します。図 5Aをご提供いただいたアビシェーク・バタチャリヤ氏に感謝いたします。ジョイナー・クルーズ、ジョナサン・ゴンザレス、チェルシー・グエン、ジェンセン・ノースラップに感謝します。著者の研究室での研究はNIH(GM120451年およびCA284362 111年)からの助成金によって資金提供されています。 図2 と 図4 はBiorenderで作成されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸二ナトリウムフィッシャー7558-79-4Na2HPO4 - リン酸二塩基ナトリウム 無水。他の水和状態も使用できますが、分子量を変えます
鉗子:Dumont #5 Biologie 鉗子精密科学ツール11252-20スタイル:#5
       先端形状:まっすぐ
         全長:11cm
       オートクレーブセーフ:はい
       ヒント:生物学
       チップ寸法:
      0.05 x 0.02mm
       合金/素材:イノックス
ホルムアルデヒドフィッシャーBP531-500分子生物学グレード、ホルムアルデヒド37%。500ml
ホルムアルデヒド固定剤フィッシャーBP531-50037%のストックから希釈して作られた0.1Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2に3.7%ホルムアルデヒド。
グリセロールフィッシャー・バイオリエージェントBP229-1
氷ユーザー設定
L-リジン、98%熱科学的J62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-s抗ベータガラクトシダーゼ
マイクロ遠心分離機チューブアメリカのサイエンティフィック1615-5520サンプルを保持するための1.5mLチューブ。
マイクロディスセプション シザーズファインサイエンスツール15003-085mmの切断刃、直線先端、8.5cm
リン酸一ナトリウムフィッシャー7558-80-7NaH2PO4 - リン酸ナトリウム 一塩基無水。水和型を使うと、0.1M溶液を作るのに必要な重量が変わります。
マウントメディア0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに75%グリセロール溶液を、pH7.2に2.5%のN-プロピルガレートを含んでいます。泡を最小限に抑えるために逆さまに混ぜます。
NSG0.1Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2、0.1%サポニン、5% NGS
N-プロピルガレートMPバイオメディカル210274780
ネイルポリッシュテッド・ペラ、フィッシャーから購入NC0381432シーリングスライド用
ニードルホルダーフィッシャーNC0099380針の微細解剖用です。中空のステンレス鋼;柄長:4 3/4インチ
Nuncマイクロウェルミニトレイサーモ・サイエンティフィック12565155血清学的応用のためのMicroWell MiniTray。ウェルカウント60
パラフィルム統計研究所PM996StatLab ParaFilm M セルフシールフレキシブルフィルム
パラホルムアルデヒドポリサイエンス社00380-250
10倍PBSユーザー設定適切な容器に蒸留水800mLを準備します。
       溶液に塩化ナトリウム1.37Mを加えます。
        溶液に塩化カリウム26.8mMを加えます。
        溶液に101mMのリン酸二塩基ナトリウムを加えます。
      溶液に18.0mMのリン酸カリウム一塩基を加えます。
      溶液を希望のpH(通常はpHと漸近7.4)に調整します。
       蒸留水を1リットルまで加えます。
PBTユーザー設定0.1Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2、0.1%牛血清アルブミン、0.2%トリトンX-100。
PDTユーザー設定0.1Mリン酸ナトリウム緩衝剤(pH=7.2)、0.3%デオキシコール酸塩、0.3%トライトンx-100
ペトリ皿ファルコンコーニング351007ペトリ皿;60mm;未処理
ペトリ皿ファルコンコーニング351008ペトリ皿;35mm;未処理
ペンチユーザー設定
PLP該当なし2%パラホルムアルデヒド、1.35%リジン、0.05Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2
二次抗体ジャクソン免疫研究715-545-1510.5mg Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG。
スライドカバーVWR48393-172VWR カバーガラス #1.5 22x40(ケース)
スライドフィッシャー125442フィッシャー・グラススライド 10bx/CS
デオキシコール酸ナトリウムサーモフィッシャーサイ89904デオキシコール酸ナトリウム洗剤;5mg
ナトリウム・ヘビゲートシグマ・オルドリッチ71859-25Gナトリウム・ピリオテおよびndash;25グラム
リン酸ナトリウムバッファー0.1M NaPO4バッファーpH 7.2。0.1Mの任意の一リン酸ナトリウムストック28ml(蒸留水11.998g NaH2PO4 to 1L)と0.1Mの任意水素リン酸二ナトリウムストック72ml(蒸留水14.196g Na2HPO4 to 1L)を混ぜて、0.1MのNaPO4バッファー100mlを生成します。あるいはPBSの使用も可能です。
タングステン線テッド・ペラ27-11.005インチディア。
トリトン x-100サーモフィッシャーサイA16046AE
渦ユーザー設定

参考文献

  1. Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
  2. Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
  3. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  4. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
  5. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  6. Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
  7. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
  8. Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
  9. Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
  10. Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
  11. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  12. Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
  13. Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
  14. Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
  15. Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
  16. Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
  17. Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
  18. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
  19. Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
  20. Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
  21. Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
  22. Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
  23. Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

60

関連記事