本研究は、リウマチ性関節炎のラットモデルにおける莫シバストのマクロファージ分極および移動に対する調節効果を検証し、特にT細胞免疫グロブリンおよびムシンドメイン含有タンパク質3(TIM-3)の役割に焦点を当て、この疾患におけるモキシバストの治療メカニズムを解明します。
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本研究は、リウマチ性関節炎のラットモデルにおける莫シバストのマクロファージ分極および移動に対する調節効果を検証し、特にT細胞免疫グロブリンおよびムシンドメイン含有タンパク質3(TIM-3)の役割に焦点を当て、この疾患におけるモキシバストの治療メカニズムを解明します。
本研究は、リウマチ性関節炎のラットモデルにおけるマクロファージ分極および移動に対する莫希バストの調節効果、ならびにT細胞免疫グロブリンおよびムシン含有ドメイン3(TIM-3)の役割を調査することを目的としました。実験0日目に、スプラグ–ドーリー(SD)ラットは5つのグループに分けられました。完全フロイントアジュバント(CFA)を後脚の足パッドに注射し、リウマチ性関節炎モデルを確立しました。さらに、レンチウイルス媒介のHavcr2 RNA干渉(LV-Havcr2-RNAi)を後足肉に注入し、TIM-3の発現を阻害しました。7日目から、ラットは6日間の治療と1日の休息からなるサイクルで灸を浴び、合計3サイクルの完全な治療を受けました。灸治療終了後、炎症状態は組織学的解析および足の厚さ測定によって評価されました。M1およびM2マクロファージの表現型マーカーは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および免疫蛍光法で評価されました。TIM-3の発現は定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)およびウェスタンブロットによって検出されました。さらに、追加のSDラットから腹膜浸出物マクロファージ(PEM)を分離し、マクロファージの移動をTranswellアッセイを用いて調査しました。研究では、CFA注射後、ラットは足の赤みや腫れが顕著で、マクロファージ表現型の不均衡が見られました。さらに、Transwellの移動アッセイでは、CFA誘導モデルラットが対照標本に比べてマクロファージ移動が増加していることが明らかになりました。しかし、灸治療によってこれらの変化は緩和されました。また、モクシバストはTIM-3の発現を増加させ、レンチウイルス介入後にTIM-3レベルが著しく低下し、炎症症状やマクロファージの不均衡が悪化したことも示されました。これらの結果は、TIM-3がマクロファージの分極および移動の莫シバスト調節において重要な媒介剤として機能していることを示しています。
関節リウマチ(RA)は、臨床的に対称性炎症性関節炎を呈する広く見られる全身性自己免疫疾患です。炎症は主に滑膜、軟骨、骨を標的にし、組織破壊を引き起こし、最終的に不可逆的な関節変形を引き起こします。現在のRAの薬理学的管理は主に疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARDs)に依存しており、これらは生涯にわたる投与を必要とすることが多いです。しかし、これらの治療薬にはさまざまな副作用が伴っています。その結果、多くの患者が臨床症状を緩和し、従来の薬剤への依存を減らすために安全かつ効果的な補完療法を求めています。伝統中国医学の重要な要素として、灸はRAに対する有望な補完療法として機能する可能性があります。全身の抗炎症および免疫調節機構を通じて治療効果を発揮します。エビネシーは症状の緩和や関節構造の保護に効果があることを示しています。さらに、肝臓毒性、感染リスク、DMARDsに伴う高コストと比べて、莫灸は安全性と低コストで優れています。しかし、莫灸は万能薬ではなく、関節リウマチの管理においてDMARDsを完全に置き換えることはできません。莫灸は効果を得るために繰り返しの長期治療が必要です。急性のRA悪化時には、迅速な症状のコントロールができないことがあります。さらに、灸の治療効果は施術者の技術や経験に大きく依存するため、ばらつきが生じます。したがって、莫灸をDMARDsと組み合わせることは、相乗効果を高める「毒性低減」効果を得てRA5の長期管理に有効な戦略となると考えられます。
多くの研究でRA 6,7,8における灸の治療効果が確認されていますが、その正確な作用機序は依然として明確ではありません。本研究は、T細胞免疫グロブリンおよびムシンドメイン含有タンパク質3(TIM-3)を機構的エントリーとして用いて、RAにおけるマクロファージ分極および移動に対する莫シバストの影響を調査します。このアプローチは、莫希巴スティスが抗関節炎効果を発揮する可能性のある免疫調節経路を明らかにすることを目的としています。
マクロファージは重要な免疫細胞として、RA 9,10の病因と進行において中心的な役割を果たします。炎症の開始時に、組織内に居住するマクロファージはさまざまなサイトカインやケモカインを放出します。これらのシグナル分子は血管内皮細胞に作用し、循環中の単球がマクロファージに分化し、炎症組織へのリクルートを促進します11,12。これらの浸潤マクロファージは追加のメディエーターを産生し、さらに炎症反応を増幅させ、その結果マクロファージを増幅させて組織浸潤を悪化させ、炎症と組織浸潤の悪循環を形成します。
環境刺激に応じて、マクロファージは主にM1(古典的に活性化)とM2(代替活性化)状態に分極することで顕著な可塑性を示します13。生理学的条件下では、マクロファージ分極はM1とM2の表現型間で動的な平衡を維持します。しかし、RAではこの平衡が崩れ、M1分極が強化され、インターフェロン(IFN)-γや誘導性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)などの炎症促進メディエーターの放出が増加し、炎症反応を悪化させます。同時に、M2の分極が弱まり、インターロイキン(IL)-4やCD206などの抗炎症因子の放出が減少し、T細胞の活性化や増殖を阻害する能力が低下し、病変進行を悪化させます14。多くの研究により、M1/M2マクロファージバランスの調節がRAの進行を緩和する可能性があることが明らかになっています15,16。
TIM-3はT細胞表面糖タンパク質として同定され、T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞を含む免疫細胞のスペクトル上で広く発現し、特定のリガンドに結合して免疫調節機能を発揮します17。TIM-3シグナルはマクロファージ炎症性サイトカインの発現と分極に決定的な影響を与えます。特に、TIM-3はM2マクロファージ上で高発現し、M2表現型を促進しつつM1表現型を抑制します。逆に、研究ではTIM-3阻害は逆の効果を生み出し、M1の偏極を促進しM2の分極を減衰させることが示されています18,19,20。さらに、証拠はTIM-3がマクロファージの移動行動の主要な調節因子であることを強調しています(21,22)。したがって、マクロファージの分極と移動動態を制御するためにTIM-3を標的とした治療介入は、RA治療戦略として大きな可能性を示しています。
前述の理論に基づき、本研究はRAにおける灸効力のメカニズムに関する知見の拡大に貢献するために実施されました。
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倫理的声明と安全上の注意事項
すべての動物実験は成都中医薬大学(2024029)倫理委員会の承認を受けています。CFAやレンチウイルスの投与を含むすべての注射手順中、オペレーターは使い捨て手袋、ゴーグル、実験用コートなどの個人用防護具(PPE)を着用しなければなりません。これらの手順は、バイオセーフティキャビネット内または換気の良い環境内で行われなければなりません。試薬に接触したすべてのシャープは、直ちに指定されたシャープ容器に捨てなければなりません。灸治療中、オペレーターは動物の反応を注意深く監視しました。皮膚への熱損傷を防ぐために、モキサコーンはすぐに交換されました。さらに、可燃性物質は燃えている灸から離して保管し、火災の危険を排除する必要があります。
1. RAモデルの確立
6週齢の30頭のオスのSDラット(体重:200 ± 20 g)、生後6週(ライセンス番号:SCXK 2020-030)は、ランダムに5つのグループ(n=6)に分けられました:対照群、RAモデル群(RA群)、RA+莫シブ活性化処理群(Mox群)、RA + TIM-3レンチウイルス干渉群(RA + TIM-3–グループ)、およびRA + TIM-3レンチウイルス干渉+莫シバスト処理群(RA + TIM-3– + Mox群)。実験前に、ラットは22〜24°Cの温度、湿度20%、自然の明暗サイクルで7日間、食物と水を自由に利用できる環境で順応させられました。実験23日目には、同じ会社から3週間齢のオスのSDラットをさらに5頭購入しました。これらのラットは、PEM採取に使用される前に、同じ飼育環境で5日間の順応が行われました。実験手順をまとめた回路図と代表的な手順写真は図1に示されています。
実験0日目には、対照群を除くすべてのラットの後ろ足の肉球に0.5 mL/kgのCFAを注射し、RAを誘発しました。同じ部位で同じ量の生理食塩水を対照群ラットで投与しました。PAWの厚さはRAモデル23の確立に成功したかどうかを評価する基準として用いられました。
2. レンチウイルス注入
RA + TIM-3- およびRA + TIM-3- + Mox群のラットは、実験初日に後ろ足の肉球にLV-Havcr2-RNAi(94435-1)を注射しました(3.5 ×10 7 TU/mL; 1枚あたり10 μL)。他のすべてのラットは同じ解剖部位に同じ自然生理食塩水注射を受けました。
3. 莫灸
実験7日目には、Mox群およびRA群+TIM-3- +Mox群のラットに莫希布置スティン処理が行われました。この処置を容易にするため、BL23およびST36の経腔周辺の約1×1cmの範囲内の毛髪が剃られました(この処置は残りのグループのラットにも実施されました)。莫希バスト中は、各ラットを体よりやや大きい木製ブロックに優しく固定し、2本のゴムバンドで処理部位を完全に露出させました(他のグループのラットも同様に拘束されました)。その後、両経位に穀物状の灸錐が施されました。個人間の熱刺激の一貫性を確保するため、各モクサコーン(直径:2mm、高さ:5mm、モクサウール含有量:60%)は標準化された5mgのモクサウールから調製されました。毎日、体の片側にある2つの経穴に5つの円錐を塗布し、翌日は反対側に交互に治療が行われました。この交互治療プロトコルは3週間維持され、7日ごとに1日の休養期間が設けられました。
3サイクルの灸治療後、ラットはイソフルラン(4%誘導、2%維持、吸入)で麻酔され、腹大動脈から5mLの動脈血を採取しました。遠心分離(2,000 × g、15分、4°C)後、上清液はマイクロ遠心分離機チューブに移され、−20°Cで保存されました。 血液採取の結果、ラットは子宮頸部脱臼により安楽死させられました。足首の関節は慎重に解剖され、4%のパラホルマルデヒドで固定されました。滑膜組織と脾臓は液体窒素を用いて急速凍結され、−80°Cで保存されました。
4. ラットの足の厚さの測定
ネズミの後ろ足の中央点には防水マーカーでマーキングされ、測定位置が一貫しています。足の厚さは、モデリング前、モデリング成功後、および各治療コース間(実験の0日目、7日目、14日目、21日目、28日目)にバーニアキャリパーを用いて測定しました。
5. 組織学的分析
4%パラホルムアルデヒドに固定した後、ラットの足首関節は十分な量の脱石溶液(10%蟻酸)を含む遠心分離機管に入れられました。チューブはシェーカーに取り付けられ、室温で30時間ほど穏やかに攪拌されました。この期間中、脱石灰液は定期的に交換され、過剰脱石灰を防ぐために組織の状態が監視されました。その後、組織を5%チオ硫酸ナトリウム溶液に6時間中和し、その後流水で4時間徹底的に洗浄しました。その後、組織を脱水させてパラフィンブロックに埋め込みました。断片は厚さ5μmで横切りにされました。脱パラフィン化と水和後、切片はヘマトキシリンで3分間染色し、水で洗い流し、短時間(5秒)分化し、再度すすいで5秒青みを帯び、その後流水道水で丁寧にすすいできました。その後、切片を95%エタノールで1分間脱水し、エオシンで15秒間カウンターステインしました。最後に、断片を脱水・クリアし、光学顕微鏡で観察するためにカバースリップを装着しました。この染色により核は青く見え、細胞質、コラーゲン繊維、赤血球はさまざまなピンク色で見えました。角化した層は通常鮮やかな赤色に染まります。
6. エリサ
製造元のプロトコルに従い、各血清サンプル(希釈済み1:2)の100μLアリコートが指定されたウェルに追加されました。ブランク井戸と標準井戸が並行して含まれていました。密封後、プレートは37°Cで90分間インキュベートされました。洗浄後、検出抗体を追加し、37°Cで60分間インキュベートしました。さらに洗浄後、ストレプタビジン–HRP共役が加えられました。徹底的な洗浄の後、色現のために基質溶液を加え、ストップ溶液を加えることで色現が止まりました。吸収は450nm(OD₄₅₀)で測定されました。IL-4およびIFN-γのサンプル濃度は標準曲線からの補間によって決定され、最終濃度はそれぞれの希釈係数を掛けて算出されました。
7. qRT-PCR
TRIzol試薬を用いて、修正プロトコルに従い血清サンプルから総RNAを抽出しました。簡単に、100μLの血清を1mLのTRIzol試薬と激しくピペッティングして均質化しました。その後、クロロホルム100μLを加え、混合物を15秒激しく振った後、室温で3分間培養しました。その後、試料は12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離され、相分離を実現しました。上部の水相は慎重に新しいチューブに移され、0.5 mLのイソプロパノールと混合され、室温で10分間培養されました。その後、12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離して総RNAをペレット化しました。 得られたRNAペレットは75%エタノール1mLで1回洗浄され(4°Cで8,000× g で5分間遠心分離)、最終的に溶け出される前に自然乾燥されました。得られたRNAはcDNA合成キットを用いて逆転写されました。遺伝子発現解析はqRT-PCRでリアルタイム定量PCRシステムソフトウェアを用いて実施されました。βアクチンは正常化の管理遺伝子として使われました。TIM-3 mRNAの相対発現は2−ΔΔCt 法を用いて計算されました。プライマーの詳細は 表1に追加されています。
8. ウエスタン・ブロット
摘出された脾臓は、予冷のリン酸塩緩衝生塩水(PBS)で3回洗浄され、小さな塊に切断され、組織の10倍の容量で溶解緩衝剤を加えて溶解しました。均質化はホモジナイザーチューブを用いて行われました。ホモジネートは溶解のために30分間氷に置かれ、完全な組織破壊のために5〜6回の渦巻きが行われました。サンプルは12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清液を総タンパク質抽出物として採取しました。標的タンパク質濃度はキットプロトコルに従い、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて測定されました。
10%のドデシル硫酸ナトリウム–ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS–PAGE)による分離後、抽出されたタンパク質サンプルはポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜に移されました。膜は室温で1時間、トリスバッファード生理食塩水(Tween 20、TBST)に5%脱脂乳を添加し、その後4°Cで一次抗体を用いて一晩培養しました。徹底的に洗浄した後、膜はホースラディッシュ過酸化酵素(HRP)結合した二次抗体と共に37°Cで2時間培養されました。最後に、化学発光イメージングシステムで画像を撮影し、ケミスコープ解析ソフトウェアでグレースケール強度を分析しました。一次抗体および二次抗体の詳細は 表1に記載されています。
9. 免疫蛍光検出
抽出された滑膜組織は4%パラホルムアルデヒドに浸され、脱水され、パラフィンに埋め込まれた後、厚さ5μmのスライスに切片されました。セクションは、キレンI、キシレンII、キシレンIIIで順次脱ワックスされ(それぞれ10分)、その後絶対エタノールで3回洗われ(各5分)、最後に蒸留水で洗浄されました。
抗原回収後、エチレンジアミネテトラアセティック酸(EDTA)でスライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に3回(各5分)洗浄し、穏やかな攪拌を加えました。切片は室温で30分間、3%牛血清アルブミン(BSA)で培養されてブロッキングされました。ブロッキング後、抗誘導性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)(1:500)および抗CD206抗体(1:400)を含む一次抗体を適用し、4°Cで24時間培養しました。
3回の5分間のPBS洗浄後、切片は暗闇で37°Cの環境で50分間インキュベートされ、二次抗体(Cy3結合ヤギ抗ウサギIgG、1:300)を用いました。核染色は、スライドをPBSで3回(1回5分)洗浄し、その後4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染色液で処理し、室温暗室で10分間培養することで行われました。画像は蛍光顕微鏡で検査されました。
10. PEMsの孤立
子宮頸部脱臼による安楽死後、ラットは75%エタノールで10分間消毒され、無菌のバイオセーフティキャビネットに移されました。腹部の皮膚は無菌ハサミで切開され、その後注射器を用いて15 mLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を腹腔内に注射しました。腹部を優しくマッサージした後、腹膜液を再び注射器に吸引し、遠心分離機管に移してマクロファージ懸浮液を採取しました。
細胞懸濁液はPBSで3回洗浄された後、10%胎児用牛血清(FBS)を含むDulbecco改良Eagle培地(DMEM)に播種されました。細胞は、5%CO₂の湿度で37°Cの湿度で24時間培養されました。 この潜伏期間後に得られた接着細胞はマクロファージとして同定されました。
11. トランスウェル
移動分析は24ウェルプレートを用いて実施されました。24時間の血清餓死後、4×10個のマクロ ファージを300μLのDMEMに1%の胎児用牛血清(FBS)と1%の抗生物質(50 U/mLペニシリン、50 μg/mLのストレプトマイシン)を補足し、10% FBSと1%抗生物質を含む700 μLのDMEMを下部チャンバーに追加しました。細胞は異なるラット群の血清で24時間前処理されました。その後、プレートは37°Cの5%CO₂環境で24時間インキュベートされました。クリスタルバイオレット染色後、上部チャンバーを綿棒で除去し、移動していない細胞を除去しました。移動する細胞は、光学顕微鏡下で4つのランダムに選ばれた視野で手動でカウントすることで定量化されました。
12. 統計分析
統計解析はSPSSバージョン25.0を用いて実施されました。まずデータセットは分散の正規性と均質性を検証しました。これらのパラメトリック仮定が満たされた後、グループ間比較は分散の一方向解析(ANOVA)を用い、その後に最低有意差(LSD)の事後分析を行いました。これらの仮定に反するデータについては、ノンパラメトリックなKruskal–Wallis検定を適用し、その後、複数比較に対して適切な補正を加えたMann–Whitney U検定が適用されました。すべての値は平均±標準偏差として表され、 P <0.05は統計的に有意とされました。
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データの利用可能性
本研究で生成された生データはFigshareリポジトリ(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197)で利用可能です。
モギバスト処理後のラットの関節病変と足の厚さ
CFAを注射したラットでは明らかな足の腫れと赤みが出ました。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、対照群は関節構造が完全なもので、滑らかでよく組織された滑膜組織を示し、炎症細胞の浸潤も見られませんでした。対照的に、RA群は著しい滑液うっ血、浮腫、広範な炎症細胞浸潤、血管拡張を示した。Mox群では滑膜のうっ血と浮腫が減少し、炎症細胞浸潤と血管拡張の減少が伴いました(図2A)。
これらの組織学的結果と...
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現在のRAの管理は主にDMARDに依存しています。しかし、これらの薬理学的薬剤は高価であり、肝腎障害や重篤な感染症などの無視できない副作用を伴い、個人や医療システムに大きな負担をかけます。対照的に、外用治療としての莫希バストは良好な安全性プロファイルを示し、全身毒性のリスク報告が最小限です。その技術は比較的シンプルで、適切なトレーニングを経て患者が自己投与を行う可能性があります。この側面は患者の関与や自己効力感を高め、慢性疾患管理において非常に重要です。さらに、低コストかつインフラ要件が最小限であるため、資源が限られた環境や長期的な生物学的使用で経済的困難を抱える患者に特に適しています。さらに、灸は複数の研究でRA症状の緩和に有効性が示されており、有望な補完療法としての地位を確立しています。
牛灸の治療効果の正確なメカニズムは完全には解明されていません。これまでの研究では、関節保護を調節するTGF-β126の調節によるRA関連心機能障害の緩和、Wnt/β-カテニンシ<...
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著者たちは何も明かすことはありません。
この研究は中国国家自然科学基金(助成金番号82374587)および四川省自然科学基金(助成金番号2024NSFSC2113)の支援を受けました。成都中医薬大学の検査施設と技術支援に感謝いたします。鍼灸とトゥイナスクールの灸指導に特別な感謝を申し上げます。また、ラットモデルの維持に協力してくださった動物ケアチームにも感謝します。最後に、組織学的および分子分析に貢献してくださったすべての同僚に感謝の意を表します。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 完全な友よs Adjuvant(CFA) | シグマ・オルドリッチ | F5881 | ラットにおける関節リウマチ(RA)モデルの誘発に使用されます |
| レンチウイルス(TIM-3 RNAi) | GenChem Biotechnology、上海 | 3.5×10 7 TU/mL | TIM-3遺伝子発現をサイレンスするために使用 |
| モクサコーン(小麦サイズ) | 伝統中国医学の供給者 | 該当なし | BL23およびST36の経穴での灸に使用されます |
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