デング熱ウイルス2型に感染した哺乳類細胞からエクソソーム濃縮細胞外小胞の単離および特徴付け

サマリー

ここでは、デング熱ウイルス2型感染細胞培養上清からエクソソーム濃縮細胞外小胞の分離方法を記述し、その後、小胞の完全性とサイズ分布の特徴付け、そして確定された実験条件下でのプラークアッセイによる感染ウイルスの有無評価を行います。

要約

エクソソーム濃縮EVは、さまざまな細胞タイプから放出され、血漿、尿、唾液、細胞培養培地、その他の体液などの細胞外液体に放出される小胞です。直径は30 nmから150 nmの範囲です。これらは感染時の細胞コミュニケーションや免疫調節など、さまざまな細胞プロセスに関与していることが示唆されています。これらの効果に基づき、いくつかのウイルスの病因を研究するために用いられてきました。現在の精製技術を用いて、ウイルス感染細胞上清液からエクソソーム濃縮EVを分離することは困難です。これは主に、特定のウイルスとエクソソーム濃縮型EVの大きさが重なっているためです。ここでは、デング熱2型感染細胞培養上清液からエクソソーム濃縮EVを精製することを目指しています。エクソソーム濃縮EVは市販のエクソソーム分離キットを用いて分離されました。このプロトコルで分離されたエクソソーム濃縮EVでは、試験条件下でプラークアッセイにより感染性ウイルスは検出されませんでした。精製されたエクソソーム濃縮EVは、テトラスパニンのためのウェスタンブロッティング、ナノ粒子追跡解析、サイズ確認のための透過電子顕微鏡を用いて特徴付けました。私たちは、エクソソーム濃縮EVが完全な状態であり、通常のエクソソーム直径範囲である30〜150nm内であることを実証しました。全体として、本プロトコルはウイルス感染細胞培養上清液からエクソソーム濃縮EVを精製する低コストな方法を提供し、下流の機能的アッセイに利用可能です。

概要

エクソソーム強化EVは、体内のすべての細胞から放出されるナノサイズの小胞です。これらはエンドサイトーシス起源の細胞外小胞(EV)の亜型です。エクソソーム濃縮EVは網様細胞^培養培地で初めて発見されました。過去数十年で、エクソソーム強化EVは血液、尿、唾液、母乳、精液、羊水(^2,3,4,5)など複数の体液から精製されています。直径は30nmから150nmの範囲^です。これらの細胞外への放出は、多胞体(MVB)と細胞の細胞膜の融合によって行われます。感染や免疫応答の文脈では、エクソソーム強化EVは哺乳類細胞で特異的な反応を引き起こすことが知られています。これらの反応にはサイトカインの放出や感染感受性の変化が含まれます ^7,8,9。

エクソソーム濃縮EVの含有量は複数の要因に影響されます。最も重要な^{のは、それら}を生成する細胞の種類と状態^です。さらに、その内容は未生物の受容細胞に与える影響も決定します。現在、エクソソーム濃縮EVを生体液から分離するためにいくつかの方法が用いられています。一般的な方法には、差動超遠心分離、沈殿、免疫親和性捕捉、サイズ排除クロマトグラフィー、磁気ベースの分離、マイクロ流体ベースの分離などがあります。

差動超遠心法は最も利用されている技術の一つと考えられています 12,13,14。超遠心分離機の精製法は高価で高度な技術力が求められます。この方法はまた、複数回の超遠心分離によるEVの大幅な損失も生じます。最後に、その結果得られるエクソソーム濃縮EVは、表現型が似ているため活性ウイルス粒子が全くないわけではありません。これにより、ウイルス感染細胞上清液からのエクソソーム濃縮EVの精製が困難になっています。したがって、エクソソーム濃縮されたEV溶液でデングウイルス(DENV)レベルを検出不能レベルに効果的に低減する最適化プロトコルの開発が重要です。なぜなら、ウイルスはエクソソームと類似したサイズと密度を共有しているからです。^15,16。

他の一般的に使われる技術と比べて、このプロトコルは精製時間の短縮、安価で広く入手可能な実験機器への依存、そして検出可能なウイルス汚染のないエクソソーム濃縮EVを分離できるなど、いくつかの利点があります。さらに、密度勾配遠心分離や磁気絶縁などの方法は収量増加や純度の向上などの利点を提供しますが、これらの方法は初期の超遠心分離工程を必要とします。本記事の目的は、感染性ウイルスを検出できない感染上清液から、テスト条件下でプラークアッセイを用いてエクソソーム濃縮EVを分離する方法を提示することです。

プロトコル

1. エクソソームフリー培地の調製

1. クラスIIバイオセーフティキャビネット(BSC)内の受信台に0.1μmフィルターを取り付けます。
2. 無菌的に加熱で不活化した胎児用牛血清(FBS)をフィルターに注ぎ、BSC内の真空ポンプに接続します。
3. フロースルーを使いながらステップ1.2をさらに2回繰り返します。
4. トリプルフィルターFBSを10%、ペニシリン/ストレプトマイシン1%、L-グルタミン1%を含む完全な培地を準備します。
   注:三重ろ過法は超遠心分離機などの機器を不要にするために用いられています。

2. 哺乳類細胞のデング熱ウイルス感染

1. 組織培養インキュベーター内のT75 cm² 培養フラスコで、5%_CO2で37°Cで一晩ベロ細胞を培養します。
2. 翌日、細胞が70%から80%の合流率の間であることを確認し、DENV-2を0.1感染多重度(MOI)で5mLの完全培地で感染させ、37°Cで5%の_CO2 と共に2時間インキュベートします。
3. 2時間後に上清液を取り出し、フラスコを無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗います。
4. フラスコに50mLの完全な培地を加え、37°Cで5%_CO2 を含んで4日間(細胞療法効果が観察される直前)インキュベートします。

3. キットベースのエクソソーム精製

1. フラスコから細胞培養培地を50mLの円錐形チューブに移し、室温で200× g で15分間遠心分離機に入れます。
2. 培地を新しい円錐形チューブに移してください。EV沈殿試薬125μLを加え、その後樹脂600μLを加えます。10秒間ボルテックスし、室温のBSC内で10分間放置します。
3. さらに10秒の渦を流し、室温で約450 × g で2分間遠心分離機にします。BSCに移し、上澄液を廃棄し、ペレットに600μLの懸濁バッファーを塗布します。
4. 10秒間ボルテックスし、室温で15分間孵育します。
5. さらに10秒の渦を使い、室温で約25× g の遠心分離機で2分間過ごします。
6. 上清液をフィルタースピンカラムに移し、室温で約4,500× g で1分間遠心分離機に移します。フロースルーに無傷のエクソソーム濃縮EVを回収し、使用準備が整うまで-80°Cで保存します。
7. エクソソーム強化EVに生ウイルスがいないことを確認し、プラークアッセイ¹⁷を実施します。
8. エクソソーム濃縮EVを電子顕微鏡で評価し、サイズ分布と濃度をナノ粒子追跡分析で評価する¹⁸。

4. ウェスタンブロットによるエクソソーム濃縮EVの特徴付け

1. BCAなどのアッセイを用いてエクソソーム強化EVのタンパク質濃度を測定します。
2. エクソソーム強化EV溶液とRIPAバッファを同量混ぜ、4倍のLDSローディングバッファ(4:1)を加えます。
3. 4-12%のBis-Trisゲルを用いてエクソソームリッチEVタンパク質を分離します。
4. タンパク質をニトロセルロース膜に移します。
5. 室温で5%無脂肪乳をTBS-Tweenバッファー1個に溶かして1時間ブロックします。
6. 一次抗体を5%無脂肪のドライミルクで1:1,1000の希釈に薄め、膜を4°Cで一晩かけてCD63やCD9などのエクソソームタンパク質を探査します。
7. 一次抗体を除去し、TBS-Tweenバッファー1個をロッカーで5分×5分洗浄します。
8. 二次抗体(抗ウサギIgG HRP)を無脂肪のドライミルクで1:5,000希釈し、この溶液で膜を室温で1時間培養します。
9. 二次抗体を除去し、TBS-Tweenバッファー1個をロッカーに付けて5分×5分洗浄します。
10. ECL検出試薬を用いて膜を現像し、化学発光イメージング装置でタンパク質信号を検出します。

5. 透過電子顕微鏡によるエクソソーム濃縮EVの特徴付け

1. 200メッシュの銅グリッドに5μLのエクソソームサンプルを加え、フォルムバーとカーボンコーティングを施し、室温で自然乾燥させます。
2. グリッドに1%の水性酢酸ウラニルで60秒染めてから自然乾燥させます。
3. 80 kV¹⁸でTEMを使って画像をキャプチャしてください。

結果

プロトコルで記述されたエクソソーム濃縮EVをプラークアッセイを用いて解析し、混合物中の活性DENV-2粒子を検出できるかどうかを調べました。 図1に示すように、陽性対照と比較して検査条件下でプラークは検出されませんでした。これらの結果は、感染性ウイルスがプラークアッセイの検出閾値を下回っていたことを示しています。プラークアッセイは生物学的三重化と技術的複製で行われました。分離されたエクソソーム濃縮EVのタンパク質濃度はBCAアッセイを用いて決定されました。その結果、タンパク質濃度は989 μg/mLから1,300 μg/mLであることを示しました(表1)。さらに、エクソソーム濃縮EVのウェスタンブロット解析では、一般的なエクソソームマーカーであるCD63およびCD9テトラスパニンの存在が示されました(図2)。さらに、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いてエク...

ディスカッション

感染症研究の最近の進展により、ウイルス感染したナイーブ細胞から放出されるエクソソーム濃縮EVが宿主^{免疫応答の}調節に重要な役割を果たすことが示されています^7,8,9。エクソソーム濃縮型EVは、適切な抗ウイルス応答を促進することで免疫防御を強化するか、逆に宿主の防御機構を抑制してウイルスの免疫回避を促進することができます。

これらの相反する効果を明らかにするためには、汚染ウイルス粒子のない完全なエクソソーム濃縮EVを分離することが不可欠です。現在、エクソソーム濃縮EV精製にはいくつかの方法が用いられています 12,13,14;しかし、これらの手法には...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗ウサギIgG-HRP連合抗体	細胞シグナル伝達	7074S	二次抗体
CD63	細胞シグナル伝達	52090S	一次抗体
CD9	細胞シグナル伝達	13174S	一次抗体
細胞培養培地エクソソーム精製キット	ノルゲン	60600	エクソソーム精製キット
デング熱ウイルス2	ATCC	VR-1584	ウイルス
DMEM	フィッシャー・サイエンティフィック	11-995-073	文化メディア
EMEM	ATCC	30-2003	文化メディア
FEI タロス F200X 透過電子顕微鏡	サーモフィッシャー・サイエンティフィック
胎児ウシイールム	神経学	FBS002	メディアサプリメント
ナノ粒子追跡アナライザー	粒子メトリクス
ベロセル	ATCC	CCL-81	哺乳類細胞株