高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

サマリー

このプロトコルは、老化マウスの涙腺を解離し、単一細胞RNAシーケンスのための生存可能な単一細胞を得る最適化方法を説明しています。逐次酵素的消化と穏やかな取り扱いにより細胞の完全性が保たれ、細胞型特異的分離や加成に伴う涙腺集団の変化のトランスクリプトミック解析に適した高品質な懸濁液が得られます。

要約

涙腺(LG)の老化は涙液分泌の減少と慢性炎症と関連し、ドライアイの発症に寄与します。加齢に伴うLGの変化には、免疫細胞浸潤、細胞損傷、腺皮細胞内の脂質蓄積、細胞外マトリックス沈着、乳管拡張が含まれます。単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は、加成中の細胞異質性や転写変化をプロファイリングする強力な手法を提供します。しかし、高齢のLG組織から有効な単細胞懸濁液を生成することは、線維化の増加、細胞の脆弱性、脂質蓄積の増加により技術的に困難です。本研究は、老化マウスLGの効率的な解離と複数の細胞タイプの分離のための最適化され再現性のあるプロトコルを提示し、下流のscRNA-seq解析に適しています。重要なのは、このプロトコルが若い涙腺、結膜、その他の外分泌組織にも適用可能である点です。ワークフローは、初期組織消化にコラゲナーゼIV、ディスパーゼII、DNase Iを用いた段階的な酵素解離戦略を採用し、その後アキュターゼで残りの細胞クラスターを解離し、最後にDNase I処理を用いてクリーンな単細胞懸浮液を得る。細胞損傷を最小限に抑えるため、すべてのプラスチック製品はPBS含有の牛血清アルブミンでコーティングされ、組織処理は制御された温度と攪拌条件下で行われる。赤血球溶解と複数のストレーナーによる逐次ろ過は、細胞純度をさらに高める。細胞型特異的分離は、リポーターマウスラインと蛍光活性化細胞選別(FACS)を組み合わせることで達成されている。 Acta2^GFP マウスと Pdgfra^EGFPマウスを用いて、EpCAM抗体による免疫染色後にそれぞれ筋上皮細胞と線維芽細胞を単離することに成功しました。FACSによりEpCAM⁺/αSMA⁺筋上皮集団の分離が可能となり、一方でPdgfra^EGFPマウスのEGFP⁺細胞が線維芽細胞集団を代表しました。このプロトコルは、老化LGから高品質で生存可能な単一細胞懸濁液を生み出し、穏やかな解離と標的細胞分離を必要とする他の線維化性または老化外分泌組織にも容易に適応可能です。

概要

涙腺(LG)は、涙膜の水層を分泌する外分泌管状の小管腺です。生涯を通じて角膜表面とLGは細菌やウイルス感染にさらされ、上皮細胞の全身的な乱、慢性炎症反応の誘導、免疫細胞のLGへの浸透、再生の欠如を引き起こすことがあります。加成は慢性炎症性疾患の発症率増加を伴います^1.その中で、ドライアイ病(DED)は世界で最も多い視力障害の原因10位の一つであり、高齢者の自立、移動能力、日常生活機能の低下に大きく寄与^{しています2。}DEDの主な原因はLG^機能障害です。

加齢に伴い、マウスおよびヒトのLGは、腺皮萎縮、管郭拡張、免疫細胞浸潤、線維症、脂^質沈着など、顕著な構造的・機能的変化を遂げ^{ます。これらの}変性変化は、LGの慢性炎症や組織線維化3,5,8,9も伴います。加成とLGの病理の明確な関連があるにもかかわらず、これらの変化を駆動する分子および細胞のメカニズムは依然として十分に解明されていません。

単一細胞RNAシーケンシングにより、¹⁰歳の老化中の細胞集団とその転写変化の包括的なプロファイリングが可能になります。このアプローチにより、涙腺内の異なる細胞タイプや状態を偏りなく特定でき、加齢が遺伝子発現プロファイル、免疫細胞の浸潤、上皮-間葉系相互作用にどのように変化をもたらすかを明らかにします。

現在、多くの組織解離法が利用可能であり、機械的解離法¹¹や、コラーゲン酵素、ディスパーゼ、トリプシン¹²などの酵素を用いた37°Cでの温熱酵素消化を含むプロトコルも含まれます。肝臓、肺、腎臓、心臓、そして複数の^{腫瘍タイプを含む}幅広い組織に対して様々な解離戦略が記載^{されています。しかし}、経年経過した涙液腺組織から実用的な単細胞懸濁液を製備することは、線維化の増加と細胞の脆弱性のため技術的に依然として困難です。また、以前に報告したように、脆弱な腺細胞の回復は困難であり、解離に伴う膜透過性の変化がこれらの大きな分泌細胞からの周囲RNA放出を増加させることがあり、これが下流の単一細胞データセットにおける背景信号に寄与する可能性がある¹⁶。いくつかの研究で老化した涙腺のscRNA-seqアトラスが報告されているが、これらのデータセットの質は最適でない解離法によって制限されており、上皮細胞の収率は間質集団よりも低い。ここでは、老年マウスLGの効率的な解離と、下流のscRNA-seqおよびバルクRNA-seq解析のための異なる細胞集団の分離のための詳細かつ最適化されたプロトコルを提示する(図1)。このアプローチは、加齢に伴う涙腺機能障害の分子メカニズムを研究する強力なツールを提供する。

このプロトコルは、老化した涙腺から高品質で生存可能な単細胞懸濁液の生成を可能にし、包括的なトランスクリプトム解析の信頼できる基盤を提供します。また、筋上皮細胞、線維芽細胞、その他加減に伴う変化を遂げる上皮細胞や間質細胞タイプを含む多様な細胞集団の詳細な同定と分子特性解析を可能にします。最適化されたワークフローにより細胞の完全性が保たれ、ストレス誘発の転写アーティファクトを最小限に抑え、生体内細胞状態の正確な表現が保証されます。さらに、この手法は広く応用可能であり、他の外分泌腺や線維組織にも適応可能です。これらの場合には、穏やかな組織解離と異なる細胞集団の正確な分離が、下流の単一細胞研究において重要です。

プロトコル

すべての動物実験は、スクリップス研究所の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)が承認したプロトコル(プロトコル番号08-0123、2023年8月29日承認)に従って実施されました。スクリップス研究所の動物ケアは、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)によって認定されています。マウスは標準的な12時間の光と12時間の暗夜サイクルで飼育され、 自由に餌と水が提供されました。 実験にはPdgfra^EGFP および Acta2^GFP の遺伝子組換えマウス系統が使用されました。マウス系統に関する詳細情報は「材料表」セクションに記載されています。

1. 一般的な考慮事項

1. 生物有害物質および動物組織の取り扱いは、NIHユニバーサル・プロフォーメンション¹⁷ を遵守してください。すべての動物作業は、承認されたIACUCプロトコルおよび指定された動物バイオセーフティレベルに従って実施してください。
2. 標準的な実験室の安全対策に従い、マウスピペットの回避、鋭利器の使用最小限、エアロゾル発生手順のための生物学的安全キャビネットの使用、適切な個人防護具の着用、鋭利器の破刺耐性容器での処分、そして廃棄前にすべての生物有害廃棄物の適切なラベル貼りと除染を行うこと。
3. 作業面や機器は適切な消毒剤(例:10%漂白剤)を用いて定期的に除染してください。
4. すべての遠心分離工程は、予冷の冷蔵遠心分離機で4°Cで行い、細胞の生存能力を保ち温度によるストレスを最小限に抑えてください。
5. 特定の機器構成に合わせてフローサイトメーターと細胞選別機の設定を最適化し、適切な対照サンプルを用いて各抗体-蛍光体共役体のパラメータを調整します。同じサイトメーターと選別装置を固定かつ最適化された設定で使用し、実験シリーズ全体で変動を最小限に抑えましょう。
6. 選ばれた溶液は最大1日前に準備し、使用まで適切に保管してください。すべての溶液はバイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で準備してください。
7. 酵素処理中のキレートを防ぐため、Ca²⁺/Mg²⁺を含む溶液はEDTA含有バッファーと分けて保管してください。この手順に必要なすべての試薬は 材料表に示されています。

2. プラスチック製陶器

1. 滅菌条件下では、皿、チューブ、シリンジに1xPBS+1% BSAを室温(RT)で1時間間プリコートします。吸入し、使用まですべて滅菌状態に保ちます。
2. ピペットチップを事前にコーティングしてください。各チップごとにPBS+1%BSAを3回吸引して内側をコーティングします。コーティングされたチップを滅菌チップボックスに戻し、無菌インキュベーターで一晩乾燥させます。翌日、細胞分離手順中にこれらのコーティング済みチップを使用します。

3. 溶液とバッファー

1. DNase Iストック(5 mg/mL)
   1. 5M NaClのストックから150 mM NaClを準備し、溶液を滅菌ろ過します。
   2. ろ過した150 mM NaCl溶液に1 M CaCl₂を加え、最終濃度5 mM CaCl₂を得ます。
   3. 100 mgのDNase Iを150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂バッファー20mlに再懸浮させ、5 mg/mLのDNase Iストック溶液を得ます。
   4. 500μLのアリコートを準備し、−20°Cで最大6か月間保存します。酵素活性の喪失を防ぐために、繰り返しの凍結融解サイクルを避けてください。
2. 消化培地
   1. 実験前日に、DMEM/F12と0.5%BSAを混ぜて濾過してミディウムベースミックスを準備してください。
   2. 基底培地DMEM/F12 / 0.5% BSAに1M HEPESおよび1M CaCl₂を加え、それぞれ15 mMおよび3 mMの最終濃度を得ます。
   3. 使用直前に以下のすべての酵素を追加してください:コラーゲナーゼIV(1 mg/mL; 125 U/mL)、ディスパーゼII(2.5 mg/mL; 1.25 U/mL)、およびDNase I(20 U/mL; 5 mg/mLストックから0.05 mg/mL)。
3. ブロッキングメディウム1(BM1)
   1. 1M HEPESと0.5M EDTAを1x HBSSに加え、それぞれ15 mMおよび3 mMの最終濃度を得ます。
4. ブロッキング・ミディアム2(BM2)
   1. DMEM/F12にFBSと1M HEPESを加え、それぞれ10%と15 mMの最終濃度を得ます。
5. DNase処理用の培地
   1. 実験前日に、0.5%BSAを混ぜたHBSSを1回混ぜてベース培地を準備し、ろ過します。
   2. 基底培地1x HBSS / 0.5% BSAに1M HEPES、1M CaCl₂、1M MgCl₂を加え、それぞれ10 mM、1.5 mM、2 mMの最終濃度を得ます。
   3. 使用直前に、調製された混合物にDNase I(200 U/mL、5 mg/mLのストックから0.5 mg/mL)を加えます。
6. ブロッキング・ミディアム3(BM3)
   1. 同じろ過基材1倍HBSS / 0.5% BSAを使用し、1M HEPESと0.5M EDTAを加えて、それぞれ10 mMと1 mMの最終濃度を得ます。
7. ブロッキング・ミディアム4(BM4)
   1. 同じろ過基材1倍HBSS / 0.5% BSAを使い、1M HEPESを加えて最終濃度10 mMを得ます。
8. FACSバッファ
   1. 実験前日に、ベース培地を1xのDPBSと0.5%BSAを混ぜて濾過します。
   2. 1M HEPESと0.5M EDTAを1x DPBS / 0.5% BSAに加え、それぞれ最終濃度25 mMおよび1 mMを得ます。
9. scRNAseq(MSC)用培地
   1. 実験前日に、1xのDPBSと0.4%BSAを混ぜて濾材を準備します。

4. 組織採取とマイクロディサクレーション(~ 40 - 50分)

1. イソフルランで麻酔し、IACUCの機関ガイドラインに従い頸椎脱臼による安楽死を行います。
2. 細い鉗子とハサミを使って目と耳の間の皮膚を切り開き、優しく引き戻して涙腺を露出させます。
3. 腺を隔離するには、鈍い先端の鉗子でわずかに持ち上げ、円を描くように優しく離して周囲の結合組織を慎重に分離します。涙腺の境界がはっきりと見え、耳下腺を含む隣接組織から簡単に分離できます。
4. 尿腺(各乳腺の重さはマウスの体重、性別、年齢によって約10〜25 mg)を、氷に冷たい1xPBSを2 mL入った35mmのペトリ皿に移します。解剖顕微鏡で残った脂肪を取り除き、2本の鉗子で結合組織カプセルを慎重に剥がします。
5. 細胞標識を確認するために、蛍光顕微鏡で小さな組織断片を調べ、酵素分解に進む前に期待されるリポーターや蛍光信号を確認します。
6. 無菌の35mmペトリ皿を氷の上に置き、皿の中央に冷たい1xPBS(腺のサイズに合わせて調整した体積)を800〜1000μL加えます。1つの涙腺を1xPBSに移します。
7. 2本の無菌メスを使い、腺を細かく粉砕し、柔らかくペースト状の質感にします。組織断片がPBSに浸かったまま刻む過程で保ちつつ、皿の上で自由に浮かないようにしてください。
8. 皿の片側に組織片を採取し、残留PBSを吸引し、新鮮な冷えたPBS1mLで洗浄します。
9. 洗浄された組織断片を、1ウェルごとに2mLの予温消化培地を含む6ウェルプレートに移します。すべてのサンプルが処理されるまで、プレートは氷の上に保管してください。

5. 最初の酵素的消化(~1.5 - 2時間)

1. プレートを37°C、60rpmの揺らす水浴で30分間孵化します。
2. 広口径の1 mLの先端で組織を15回優しく研磨し、その後プレートを37°C、60 rpmの揺れる水浴に戻してさらに30分間加熱します。
3. 通常の1 mLの先端でサンプルを10回優しく乾燥させた後、プレートを37°C、60 rpmの揺らす水浴に戻してさらに30分間加熱します。
4. サンプルを10回優しく乾燥させ、細胞懸濁液を2mLのドルフィンマイクロ遠心分離機チューブに移します。
5. プレートの各ウェルに1mLの冷たいBM1を加え、残留細胞を含む消化培地を回収します。次の工程までプレートを氷の上に置きます。
   注意:この段階で大きな細胞クラスターや組織断片がまだ観察されている場合は、各インキュベーションステップをさらに10〜20分延長してください。推奨された研磨回数(最大10〜15回の穏やかな通過)を超えないでください。追加の機械的ストレスは細胞の生存能力を損なうためです。

6. 酵素活性と一次洗浄の終了(~ 15分)

1. セル懸濁液を含むチューブを300× g で4°Cで5分間遠心分離します。
2. 上清液は廃棄します。初期プレートの各ウェル(残留細胞を含む)からBM1を対応するチューブに移し、細胞ペレットを優しく再懸濁させます。
3. 各ウェルに600μLの冷水BM1をさらに注ぎ、洗浄液と対応するチューブを混ぜて残りの細胞をすべて回収します。
4. 細胞懸濁液を優しく再懸浮させ、再び300× g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。

7. アキュターゼおよびDNase処理(~ 30 - 35分)

1. 細胞ペレットに1mLのアキュターゼを加え、優しく再懸浮させます。チューブを37°C、60rpmで5〜10分間だけキュベートします。
   注意:培養中は細胞が沈着して底にくっつくのを防ぐためにチューブを横置きにしてください。
2. 1mLのピペットチップで10回優しくトリチレートします。
3. アキュターゼを希釈して酵素反応を終わらせるために冷たいBM2を1mL加えます。
4. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
5. 細胞を培地に再懸浮させてDNase処理を行い、チューブを上部まで満たします。
6. RTで10分間孵育し、5分後に1回優しく再懸浮させます。
7. その間に、1 mLのBM3を15 mLの円錐形チューブの上に置いた70μmの細胞ストレーナーを事前に湿らせます。
8. セルの懸流液をストレーナーに移す。
9. 元の採取チューブを1mLのBM3で洗い流し、同じこしにすすぎ液を移します。
10. こし器をさらに5mLのBM3で洗います。

8. 細胞計数と生存可能性の確認

1. ろ過された細胞懸濁液10 μLをBM3に取り、10 μLのトリパンブルーと混合します。トリパンブルー除外法を用いて細胞濃度と生存率を測定し、手動カウントまたは自動細胞カウンター(例:Countess 3自動細胞カウンター)で定量化します。生存率が下流応用の基準値(通常≥70-80%)を満たした場合のみ進行します。
   注:収率を計算する際は、現在15mLチューブ内の総体積~7〜9mLを考慮してください。
2. 下流の応用に従って進めてください。scRNA-seqについてはセクション9へ進みます。フローサイトメトリーに基づく細胞選別についてはセクション10へ進みます。
   注:scRNAシークシーフローには、破片や周囲RNAを減らしデータ品質を向上させるために、赤血球溶解や磁気死細胞除去が含まれます。しかし、これらのステップは、アクシナー細胞を含む脆弱または希少な上皮集団に偏り、細胞型表現に偏りが生じる可能性があります。フローサイトメトリーに基づくソーティングでは、回復を最大化し細胞表面エピトープを保存するためにこれらのステップは省略されました。したがって、ワークフローの選択は実験目標に基づいて導かれ、scRNA-seqや細胞回復のデータ品質と、ソーティングおよび下流応用における生存可能性を優先すべきです。

9. scRNA-seq用細胞の準備(~ 1 - 1.5時間)

1. 10xの赤血球溶液をミリQ水で再構成して1液を準備します。
2. 細胞懸浮液を含む15mLチューブを400× g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
3. 細胞ペレットを5mLの1x赤血球バッファーに再懸浮させ、RTで5分間培養します。
4. 再び300× g で4°Cで5分間遠心分離し、上澄液を捨てます。
5. 細胞ペレットを2 mLの冷水BM4に再懸浮させます。
6. ろ過細胞懸濁液10μLをBM4に含み、10μLのトリパンブルーと混合して細胞濃度と生存可能性を評価します。
7. MACS 30μmストレーナーを1mL 1x HBSSで事前に湿らせ、ストレーナーを通して細胞懸濁液を15mLチューブにろ過します。
8. 前の採取チューブを2mLの冷たいBM4で洗い流し、同じストレーナーで洗浄液を15mLチューブに通します。
9. ストレーナーはさらに10mLの冷水BM4で洗います。
10. 15 mLチューブを400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を完全に除去します。
11. ペレットを100μLのMACSマイクロビーズに優しく再懸浮させ、RTで15分間培養します。
12. その間に、Dead Cell Removal Kitから無菌の二重蒸留水を使って1個の結合バッファー(BB)を準備してください。
13. MACSのMSカラムを500μL 1x BBで洗い、平衡させます。
14. サンプルに400μLのBBを加え、マイクロビーズで細胞を再懸濁させ、全体積を平衡状態のMSカラムに塗布します。フロースルーを15mLのチューブに集めます。
15. カラムを4回500μLのBBで洗浄し、すべての流線分画を収集します。
16. 400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
17. 細胞を400μLのMSCバッファーに再懸濁し、懸濁液を1.5mLチューブに移します。
18. 前のチューブを700μLのMSCバッファーで洗い流し、そのすすぎ液をサンプルとプールします。
19. 400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
20. 細胞ペレットをMSCバッファーにワイドボアの先端で再懸航し、最終体積約1.5 mLまで保存します。
21. 400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
22. 上清液~100μLを残し、ペレットを優しく再懸浮させ、6μLセルと6μLのトリパンブルーを混ぜて再度細胞数を数えます。
23. 最終体積をMSCバッファーで調整し、700〜1200セル/μLにし、細胞濃度を確認するために再カウントします。
24. 赤血球溶解および死細胞除去後の細胞生存率を70%(通常70〜95%)≥10倍クロム処理(クロム単細胞3'溶液V3)で充填します。
25. 基本的なscRNAシークシークリー品質管理基準を適用します:nUMI>500、nGene >200、ミトコンドリア遺伝子割<15%)。代謝活性の高い上皮集団を保護するために許容ミトコンドリア閾値(15%)を用いましょう。下流解析ではすべてのQC基準を満たす細胞のみを含めてください。
    注:これらのQC閾値は、当社のデータセット(補足図1)から導き出された例の値であり、前回の論文¹⁸で報告されています。

10. フローサイトメトリーに基づく細胞選別のための細胞準備(~ 1 - 1.5時間)

1. MECsおよび線維芽細胞のフローサイトメトリーに基づく分離には、それぞれ Pdgfra^EGFP と Acta2^GFP リポーターマウスラインを用いて、各集団の正確な同定を可能にしました。
2. 細胞懸浮液を400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
3. 細胞ペレットを冷たいFACSバッファーで再懸浮させ、最終濃度は5×10⁵から2×10×^10×10 /10 μLあたりです。
4. FACS補償に必要な対照を準備します:陰性対照 - 野生型マウスの染色されていない細胞、背景蛍光対照 - Acta2^GFP および Pdgfra^EGFP マウスの染色されていない細胞、単染色対照 - 実験で使用される各抗体で個別染色した野生型マウスの細胞。
   注意:各対照サンプルに対して、少なくとも1×10⁵細胞を100μLのFACSバッファーに再懸濁させて使用してください。
5. FcBlock(1:100)を加え、氷で5分間孵化します。
6. CD326(EpCAM)-APCモノクローナル抗体(1:100)またはCD140a(PDGFRα)モノクローナル抗体(1:100)を追加します。光から保護して氷の上で45分間インキュベートします。
7. 抗体培養中は15分ごとに優しく細胞を再懸浮させます。
8. 各チューブに冷たいFACSバッファーを詰め、遠心分離機で300× g、4°Cで5分間投与します。
9. FACSバッファでFxCycleの作業解(1:1000)を準備します。
10. サンプルを1 mLで再懸浮し、FxCycleで500 μLの冷たいFACSバッファーにコントロールします。
11. すべてのサンプルをFACSチューブに移し、光から保護して氷に保管してください。
12. 直ちにフローサイトメトリーコアへ進み、選別を行います。選別された細胞をFACSバッファー、培養培地、溶解バッファー、またはRNAlaterに収集し、下流の用途に応じて行います。
    注意:機器の設定(例:ノズルサイズや圧力)およびイベント率は、ソーターの構成やターゲットセル集団によって異なります。したがって、各実験に最適なパラメータを決定するために予備パイロットランを推奨します。

結果

高齢外分泌腺の解離は脂質蓄積と広範なECM沈着により困難です。老年した腺は顕著なリンパ球浸潤と、腔内物質との顕著な導管拡張を示し、組織解離を複雑にする構造的および炎症的変化を反映しています。涙腺は、アシナー、導管、筋上皮の3つの主要な上皮細胞タイプから成る外分泌器官です。アクシナー細胞は、角膜の水分を保ち、抗菌および創傷治癒機能を果たす涙膜の水性およびタンパク質成分を産生します。高齢LGでは、慢性炎症が上皮損傷、免疫細胞浸潤、アシナー細胞内の脂質蓄積、細胞外マトリックス堆積の増加、管拡張と関連しており、これらはいずれも涙液分泌を妨げ、組織の異質性をさらに増加させる可能性があります(図2)。それにもかかわらず、本プロトコルはLGを効果的に解離し、若年(2か月)および老化(20か月)の腺における主要な細胞群をすべて特定可能にしました。UMAP解析により、MECsや線維芽細胞を含む上皮および間質の集団がよく代表され、多様な免疫細胞(図3A,B)が明らかになりました(

ディスカッション

ここでは、外分泌組織から単細胞懸濁液を生成するための大幅に改良されたプロトコルを最適化・評価し、特に涙腺に焦点を当てました。この手法を用いて、古いLGおよび若いLGからクリーンで高品質な単一細胞懸濁液を生成し、単一細胞シーケンスやその他の下流用途に適しています。

多数の組織解離プロトコルが存在するにもかかわらず、分離時に最も脆弱な細胞群を効率的に回復させるためにそれらを修正・最適化する必要がありました。特定の細胞集団の脆弱性と、分離が困難な上皮および間葉系集団が同時に存在するため、非酵素的機械的解離のみに基づくプロトコルを開始から除外しました^21,22。冷間酵素解離は、低温(0-10°C)で高い触媒活性を保持する親性生物由来のプロテアーゼを使用することに依存しており、低温条件下でも組織解離を行え、ストレス誘発の転写活性化アーティファクトを最小限に抑えます(^16,...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>マテリアル<ストロング>
BSA	シグマ・オルドリッチ	A4919
CaCl2(1 M解)	バイオビジョン	B1010-100
コラーゲナーゼIV	シグマ・オルドリッチ	C5138
死細胞除去キット	ミルテンニ・バイオテック	130-090-101
死細胞除去キット	ミルテンニ・バイオテック	130-090-101
ディスパースII	ロッシュ	C756V28
DNase I	シグマ・オルドリッチ	DN25-100MG
DPBS	Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	14190-144
胎児用牛血清、超低IgGです	ギブコ	# 16250078
ハンクのバランスソルトソリューション(HBSS)	コーニング(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)	21-022-CV
HEPES(1 M解)	シグマ・オルドリッチ	H0887
イソフルラン溶液	コヴェルトゥス	# 11695067772
MACS®SmartStrainers(30 & micro;m)	ミルテンニ・バイオテック	130-098-458
MACS®SmartStrainers(70 & micro;m)	ミルテンニ・バイオテック	130-110-916
ミディアム/F12(DMEM/F12)	ミリポール	DF-042-B
MgCl2 1M	シグマ・オルドリッチ	M1028-100ML
MSコラム	ミルテンニ・バイオテック	130-042-201
NaCl(5Mストック)	インビトロジェン&トレード;	AM9759
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)タブレット	シグマ・オルドリッチ	P8920-500ML
赤血球溶解液(10回以上)	ミルテンニ・バイオテック	130-094-183
StemPro Accutase	Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A1110501
トライパンブルー溶液、0.4%	Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15250061
超純度EDTA(0.5M、pH 8.0)	インビトロジェン	15575020
<強い>抗体<強い>
CD140a(PDGFRA)、モノクローナル抗体(APA5)、APC-eFluorおよびトレード;780、ラット/IgG2a、カッパ	eバイオサイエンス	47-1401-82;リッド:AB_2784706
FcBlock(CD16/CD32 Fcブロッカー)	BD バイオサイエンス	553141;リッド:AB_394656
FxCycle™バイオレット・ステイン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	F10347
ラットCD326(EpCAM)-APCモノクローナル抗体(G8.8)、ラットIgG2a、カッパ	eバイオサイエンス	17-579182;リッド:AB_2716944
Mice
Acta2GFP <も>	イヴォ・カラジッチ博士からのご厚意	PMID: 18571490
PdgfraEGFP - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J	ジャクソン研究所	リッド:IMSR_JAX:007669
<ストロング>装備
インビトロジェン&トレード; 伯爵夫人&トレード;3 自動セルカウンター	フィッシャー・サイエンティフィック	A49862;リッド:SCR_026963