酸素供給用途における階層的多孔質UiO-66ナノ粒子における合成、ヘモグロビン封装および双直交PEG化

サマリー

このプロトコルは、酸素供給のために設計された階層的に多孔質なUiO-66ナノ粒子の合成、ヘモグロビン封閉、表面PEG化について詳述しています。この手法は欠陥工学とひずみ促進バイオルソゴナル共役を組み合わせ、生物医学応用に適した透過性が高く生理学的に安定したキャリアを生成します。

要約

ヘモグロビンベースの酸素キャリア(HBOCs)は、いくつかの生物医学的文脈で低酸素を軽減するための重要な酸素供給プラットフォームです。しかし、遊離ヘモグロビン(Hb)は赤血球外では不安定で血管活性性があります。ここでは、Hbを被覆し、生体直交ポリエチレングリコール(PEG)シェルで安定化される階層的に多孔質なUiO-66ナノ粒子(HP-UiO-66 NP)を製造するための再現可能かつ拡張可能なステップバイステッププロトコルを提示します。階層的なメソポロシティは、ドデカノン酸変調とその後の酸洗浄によって導入され、結晶性が保たれ、I/IV N₂ の等温線が結合したHP-UiO-66-NH₂NPが得られます。表面アミンはアジド(HP-UiO-66-N₃ NPs)に変換され、触媒を使わないひずみ促進アルキン-アジド環状付加成(SPAAC)がHb@HP-UiO-66-PEG NPを生成します。ワークフローは以下の通りです:i) UiO-66-NH₂ NPの欠陥工学、ii) 変調因子除去、iii) アジドの設置、iv) バッファード水媒体でのHb負荷、v) SPAAC介質によるPEGylation。各段階で重要な実験パラメータ、標準故障モード、トラブルシューティング戦略が詳細に説明され、実験室間での再現性が向上します。このプロトコルは、バッチごとにHP-UiO-66-NH₂ NPsをグラムスケールで生成することが可能です。Hbのカプセル化効率は、穏やかな条件下で~35%(負荷含有量~24 wt%)を得ており、PEG基化後の流体力学的直径~140 nmの再分散性NPで達成されます。包括的な物理化学的特徴付けにより、フレームワークの完全性、中間孔性、成功した表面化学、および最大~12nm幅の拡散PEGコロナが検証されます。機能的アッセイでは、被包されたHbの可逆的な酸素化/脱酸素化が示され、酸素輸送能力の保持が示されています。PEG化は生理食塩水、HEPES、血清におけるコロイドおよび構造の安定性を著しく高め、非PEG化対象で観察されるリン酸塩による分解を防ぎます。詳細なトラブルシューティングガイダンス、重要なステップのビデオ支援による可視化、スケールアップの考慮事項を統合することで、このモジュール式プロトコルは金属有機フレームベースのHBOCへの堅牢でアクセスしやすいルートを提供します。この戦略は、治療的送達のために保護的でありながらアクセス可能な微小環境を必要とする他の生体高分子や酵素にも容易に適応可能です。

概要

多様な生医学的環境において、十分な酸素供給は効果的な治療と組織治癒のために極めて重要です。¹.外傷や外科的出血では、重度の酸素喪失が命に関わることがあり、ドナーの血液^{が利用できない場合}に安全な血液代替の必要性が強調されます。腫瘍学では、低酸素腫瘍領域が酸素依存治療の有効性を制限し、補助的な酸素投与は治療効果を著しく向上させることができます。酸素は創傷治癒においても中心的な役割を果たし、酸素の供給が増加すると血管新生や組織修復が促進されます⁷。同様に、虚血状態や臓器移植においても、酸素キャリアは低酸素損傷を軽減し、組織の生存率^{と回復を改善する}ことができます^8,9。

合成ヘモグロビン(Hb)ベースの酸素キャリア(HBOCs)は、低酸素^症10を軽減する有望なアプローチを示しています。しかし、赤血球(RBC)外のHbは本質的に不安定で、急速に二量体へと解離し、腎毒性、酸化損傷、一酸化窒素の除去による血管収縮を引き起こす^{可能性があります。}これらの課題を緩和するために、リポソーム¹²、ポリマーソーム¹³、ポリマーナノ粒子(NP)^{14、15、16、17}などの生体適合性ナノキャリア内でHbを安定化させるエンカプセル化戦略が開発されています。これらのシステムはHbの安定性を高めますが、高い封膜効率を達成しつつ、本来の酸素結合機能を維持しつつも依然として困難です¹⁸。さらに、メトヘモグロビンへの酸化変換やヘム漏れは酸素運^搬性能を損なう可能性があります。急速な排出と早期のHb漏れは循環時間と臨床翻訳をさらに制限します²⁰。

金属有機フレームワーク(MOFs)は、その結晶構造、大きな表面積、調整可能な多^{孔性により}、薬物および生体高分子の送達のための多用途なナノプラットフォームとして近年登場しています。有機リンカーと調整された金属ノードで構成されるMOFは、分子拡散や構造カスタマイズを可能にし、生物医学応用に魅力的です。しかし、ほとんどのMOFは主に微細孔質の空洞(<2 nm)を持ち、タンパク質、核酸、酵素などの高分子の合成後のカプセル化を著しく制限^します。この制限を克服する一つの方法は、生体分子がMOF成長中に核生成センターとして機能する生体模倣鉱化(in situ biomimetic mineralization)であり、ZIF-8およびZIF-90で示^{されています。}この戦略は有効であるにもかかわらず、適合するMOF化学の範囲を制限する緩やかな合成条件を必要とし^ます。

UiO-66は、Zr₆O₄(OH)₄の八面体ノードと1,4-ベンゼンジカルボキシレート(BDC)リンカーから構成されるジルコニウム系MOFで、その卓越した化学的安定性と生体適合性³¹で際立っています。その堅牢な構造は水中および生理環境での分解に強く、生物^{医学用途に最適です}。しかしながら、その本質的な微細多孔構造は生体高分子のカプセル化への有用性を制限しています。分子寸法が~5 nmのHbは、純粋なUiO-66の内部孔には収容できません。同様に、UiO-66をHb関連系で探求した研究は限られており、MOFは主に表面ベースのHbセンシングに用いられ、フレームワークのカプセル化にはあまり使われ^{ていません。}その結果、UiO-66ベースのHbカプセル化プラットフォームは比較的未発達のままです。

ごく最近、私たちは階層的に多孔質なUiO-66 NP(HP-UiO-66 NP)を導入し、Hbを収容できるメソポロスドメインを組み込むことで、HBOC^{発生における}UiO-66の機能範囲を拡大しました。階層的多孔性は欠陥工学によって導入され、合成時にドデカノン酸(DA)などの長鎖モノカルボン酸を減調剤として用^{いることで行われます}。この変調子はZr⁴⁺との配位をBDC配位と競合し、欠陥形成とメソポアの拡大を引き起こします。その後の減調因子除去により、微孔およびメソポーラスドメインが共存し、変調剤濃度や^{鎖長によって}孔径が調整されるHP-UiO-66 NPが得られます。

メソポロシティの導入は分子アクセスを向上させますが、リン酸塩を含むバッファーのフレームの整合性を損なう可能性があります。リン酸イオンはZrクラスターと協調し、部分的または完全な構造崩壊を引き起こすことがある^38,39。したがって、表面安定化戦略は^{生理的条件下}でコロイドおよび化学的安定性を維持するために不可欠です。一般に、MOF表面安定化は非共有結合相互作用(例:ファンデルワールス相互作用や水素結合)⁴¹、露出した金属部位との配位相互作用⁴²、または有機リンカーへの共有結合⁴³によって達成されます。他のリンカーの中でも、ポリエチレングリコール(PEG)はその広範な入手可能性と合成複雑性が最小限であることから特に魅力的です⁴⁴。重要なのは、PEG表面修飾(一般にPEGylationと呼ばれる)は、優れた生体適合性、非特異的タンパク質吸着の減少、免疫認識およびマクロファージの吸収低下など、薬物送達系にいくつかの好ましい特性をもたらすことです^(45,46)。これらの効果は総合的に免疫原性反応を減少させ、全身循環を延長します⁴⁷。

従来のPEG化技術はしばしばカルボジイミドやマレイイミドの化学的化学に依存しており、これらは触媒や反応性中間体を必要とし、Hbのような感受性生体分子を損傷する可能性があります。この制限を回避するために、私たちはアジドとジベンジルシクロオクチン(DBCO)官能化種間の触媒を持たない生物直交反応である株促進アルキン-アジド環状付加(SPAAC)を用い、穏やかな水性条件下でのサイト特異的共役を可能にします^35,48。このアプローチにより、封装されたHb機能を損なうことなく効率的な表面変質が保証されます。

構造設計と生体機能検証に焦点を当てたHP-UiO-66^{NPs 35}を基に、本プロトコルはパラメータ範囲と重要な取り扱いを考慮した詳細な段階的な実験ワークフローを提供することで、方法論的透明性と再現性を強調しています。合成の主要段階、Hbカプセル化、SPAAC化学によるPEG化に関するトラブルシューティングのガイダンスが含まれており、最終的に安定したHb@HP-UiO-66-PEG NPが得られる( 図1参照)。

ワークフローは以下の通りです:(i) DAを変調子として使った欠陥工学によるアミノ修飾HP-UiO-66-NH₂ NP合成;(ii) 表面アミン基のアジド官能基化;(iii) 穏やかな水性条件下でのHbの被覆;(iv) SPAACを通じた共有結合PEG結合。

各主要ステップごとに、このプロトコルは粒子の凝集、孔の崩壊、非効率的な表面官能化など、共通の実験的課題を特定し、実験室間再現性を向上させるための実践的なトラブルシューティング戦略を提供します。重要なのは、本論文がHP-UiO-66 NPsの合成が容易に拡張可能であり、1バッチあたりの信頼性の高いグラムスケール生産を可能にすることを広く示していることです。

最終的なPEG化ナノキャリアは、生理食塩水、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネエスルホン酸(HEPES)、および血清において高いコロイド安定性を示しつつ、Hbの酸素結合および放出能力³⁵を維持します。フーリエ変換赤外分光法(FTIR)、核磁気共鳴(NMR)、粉末X線回折(PXRD)、窒素(_N2)吸着法、ゼータ(ζ)ポテンシャル解析、動的散乱(DLS)、走査型電子顕微鏡(SEM)、透過式電子顕微鏡(TEM)などの解析手法は、化学変換、骨格の完全性、多孔性、ナノスケールの形態学、そして表面機能化の成功を裏付けています。

再現性、スケーラビリティ、運用上の明瞭さを強調し、技術的に敏感な工程をビデオで可視化することで、この手法は安定したMOFベースの酸素キャリアを再現可能で堅牢かつアクセスしやすい方法で製造します。重要なのは、このアプローチがモジュール式であり、機能を維持するために保護されつつも酸素透過性のある微小環境を必要とする他の生体高分子や酵素にも容易に適応できることです。したがって、Hb@HP-UiO-66-PEG天然天然体は、生物体液中での分解に抵抗しつつ効率的に酸素を供給できるHBOCsの創出に向けた有望な一歩を示しています。

実用的な観点からは、この戦略はHbを超える他の生体高分子にも拡張可能であり、約20 nm未満の寸法を持ち、アクセス可能な最大メソポアサイズに対応し、以下のいずれかの特徴を示唆する条件を備えています:(i) 過酷な化学条件に対する感受性で、軽度な合成と表面変質を有利にします;(ii) 機能活動を維持するためには、水和で酸素透過性のある微小環境の必要性;(iii) リン酸塩によるMOF劣化に対する感受性があり、表面安定化が必要であること。このアプローチは、中層のアクセス性とフレームワークの整合性のバランスを取るために、適度な欠陥密度に依存しています。生体分子の機能を維持するために触媒を使わないサイト特異的表面修飾が必要な場合、SPAACベースのPEG化は明確な利点を提供します。したがって、このプロトコルは効率的な生体高分子の負荷、機能保存、生理学的条件下での長期的なコロイド安定性に適しており、より大きな生体分子や極端な熱的・酸性の安定性を必要とするシステムでは代替のMOFプラットフォームが必要となる場合があります。

プロトコル

1. Hb摘出(予想期間:2日)

注:市販の牛血(SSI Diagnostica A/S、Hillerød、DK)からのHb抽出は、先に報告したプロトコル⁴⁹に従って行われます。

1. 牛の血液(通常1回10mL)を50mLの円錐形遠心分離機チューブに移します。血液を希釈し粘度を下げるために、0.9%(w/v)の生理食塩水を等量に加えます。均一な懸液が得られるまで、何度か優しく反転させます。
2. 希釈した血液を1,500 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 遠心分離後、濃い赤色のペレット(赤血球)の上に透明な黄色い上清液(血漿)が現れます。完全なペレット化が達成されない場合は、必要に応じて遠心分離を続けます。
3. ペレットを乱さずに慎重にデカントし、プラズマ層を捨ててください。新鮮な生理食塩水(10 mL)を加え、穏やかな逆行で赤血球ペレットを再懸浮させ、同じ条件下で遠心分離を繰り返します。血漿、タンパク質、血小板を除去するために合計2回の洗浄サイクルを行います。
   注:洗浄工程は、下流トルエン抽出を妨げる可能性のある血漿汚染物質のない純粋な赤血球を得るために非常に重要です。
4. 2回目の洗浄後、上清液を捨て、洗浄した赤血球ペレットをトルエン、超純水、生理食塩水の混合液に1:0.4:1の体積比で再懸濁させます。例えば、ペレットを加える前に、50 mLの分離漏斗でトルエン10mL、超純水4 mL、生理食塩水10 mLを混ぜます。
5. じょうごを密閉し、数回優しく倒さして相を混ぜます。漏斗を4°Cの温度で一晩(~12〜16時間)置き、位相を完全に分離させます。トルエン相は脂質膜を抽出し、Hbを豊富に含む透明な水相を残します。
6. 翌日、分離漏斗のストップコックを使って下層水層を慎重に回収します。この層は透明で濃い赤色に見えます。
7. 水性Hb溶液を遠心分離機管に移し、8,000 x g で4°Cで20分間回転させ、残留した細胞の残渣や乳化物質を除去します。
8. 真空ろ過装置を使って、上清液を珪藻土のフリットでろ過します。穏やかな真空のみをかけてください(泡立ちやタンパク質の変性を引き起こす可能性のある高圧負圧は避けてください)。
9. ストロマフリーHbを含むろ過液を採取してください。このストックはすぐに氷で保存するか、長期使用時はアリコート(~1 mL)で−80°Cで冷凍してください。
   注意:Hbアリコートは数ヶ月間冷凍保存しても分解が検出されません。
10. 製造元のプロトコルに従い、純粋な牛Hbを校正標準としてビシンコニン酸タンパク質アッセイを用いてHb濃度を定量します。最終的なHbストックを所定の作動濃度(通常はHEPESバッファー中の20 mg ^mL-1 、pH 7.4)に調整します。
    注意:細胞物質のない透明な赤色のHb溶液が出ることを期待してください。
11. オプションとして、抽出されたHbのUV-vis吸収スペクトル(375〜700 nm)を測定し、酸素結合および放出能力を評価すること。最初のUV-visスペクトルを記録します。ジチオナイトナトリウムを加え、_N2 ガスで10分間パージして酸素を放出し、脱酸素化Hbのスペクトルを記録します。その後、空気で10分間空気をパージして再酸素化し、スペクトルを再記録します。
    注:酸素化(ソレットバンドは約412nm、Qバンドは541および577nm)、脱酸素(Qバンドは530nm、Qバンドは557nm)のHbが空気と_N2でパージした後の特徴的なSoretバンドとQバンドが存在することは、Hbが機能的であることを示しています(補足図1参照)。
    注意:トルエンは、白衣、安全メガネ、手袋などの適切な個人用防護具を着用し、排気フード内で慎重に取り扱ってください。本研究では、すべてのトルエン含有廃棄物が、デンマーク環境省の指針に従い、「トルエンおよび混合物」とラベル付けされた指定された容器(グループC)に有機化学液廃棄物として収集・処分されました。対応する廃棄物処理に関する文書は 補足ファイル1に記載されています。

2. HP-UiO-66-NH₂ NPの製造(予想期間:3日)

注意:HCl(37%)は腐食性があります。白衣、耐酸手袋、適切な目の保護具を着用して、排気フードの中で持ち物をしてください。酸はゆっくり加え、蒸気の吸入は避けてください。

1. ZrCl₄ (400 mg、1.715 mmol)を250 mLの丸底フラスコに重く量ります。DMF(80 mL)をゆっくり加え、5分間超音波でZrCl₄を完全に溶かします。DA(12g、60 mmol)を加え、さらに30分間超音波処理を行い、透明で均質な溶液が得られるまで加熱します。目盛りシリンダーを使って溶液全体の体積を測定し、必要に応じてDMFを加えて最終体積を100 mLに調整します。DAは競合変調器として作用し、制御格子欠陥を導入します。
   注意:ZrCl4を溶解する際はDMFをゆっくり添加してください。配位過程は発熱性であり、軽い発煙を引き起こす可能性があります。すべての操作をフームフード内で行います。DAの導入による体積増加を考慮し、初期の体積80 mL DMFを用いてZrCl4とDAを溶解し、完全な溶解後にのみ最終体積を100 mLに調整することで正確な濃度制御を図ります。
2. 同じフラスコに2-アミノ-1,4-ベンゼンジカルボン酸(BDC-NH₂、155mg、0.857 mmol)を加え、さらに30分間超音波処理を行います。均一な淡黄色溶液が得られるまで続けます。
3. 溶媒熱合成に適した150 mLのテフロンライニングオートクレーブまたは丸底圧力容器に混合液を移します。しっかり密封し、予熱したマッフル炉で120°Cで18時間加熱します。加熱中は制御不能な核生成を防ぐために原子炉を乱さないでください。
4. 反応後、炉を停止し、容器を自然に室温(~2時間)まで冷却させます。媒質全体に均一に現れる細かい黄色の懸液が観察できます。
5. 遠心分離(11,000 x g、10分、室温)で製品を採取し、上清液は廃棄します。同じ遠心分離条件下でDMF(100 mL)でペレットを3回洗浄し、余分な配位子と未反応のDAを除去します。製品が完全にペレット化していない場合は、必要に応じて遠心分離時間を延長してください。
6. DMF(100 mL)に0.5 mL濃縮HCl(37%)を含む酸除去液を準備します。洗浄したペレットをこの溶液に完全に浸し、マフル炉で90°Cで12時間加熱します。この工程でDA変調器が除去され、構造内にメソポアが生成されます。
7. 12時間後、遠心分離機(11,000 x g、5分、室温)で上清液を捨てます。酸処理を繰り返し、0.5 mL HClを含む新しいDMFバッチで、DAを完全に除去します。製品が完全にペレット化していない場合は、必要に応じて遠心分離時間を延長してください。
8. ペレットをDMF、アセトン、エタノール(100 mL、11,000 x g、5分、室温)で順次洗浄し、残留酸や溶媒を除去します。沈殿物が完全にペレット化していない場合は、遠心分離時間を必要に応じて延長してください。洗うたびに、ボルテックスや軽い超音波処理でペレットを優しく再分散させます。
9. 製品を真空オーブン(140°C)で一晩乾燥させた後、ファンムフード内で乾燥させます。最終的な材料(HP-UiO-66-NH₂ NPs)は細かい黄色の粉末として現れます。典型的な収量は約428mgと予想されます。
10. PXRDのピークは2θ=7.3°、8.4°、25.7°で鋭く残ることを確認し、結晶性UiO-66トポロジーが保持されていることを示しています。アルカリ性(2 M KOH in D₂O)消化後に^1HNMRによるDAの完全除去(1.2 ppmでメチレンピークなし)を確認します(図2B)。
11. N2の吸着脱着で77 K⁵⁰で間隙率を特徴付けます。曲線はヒステリシスループを伴うタイプI/IVの等温線が結合しており(図2C)、メソポア形成を裏付けています。
    注:高温乾燥の不完全または試料質量不足は、_N-2 吸着-脱着等温線を用いた孔隙率測定の不正確さを引き起こします。140°Cで真空乾燥を繰り返し、ブルナウアー・エメット・テラー(BET)面積が1,000 m^{2 g-1}<場合、試料重量が100 mgを超えることを確認してください。
12. オプションとして、SEMを用いてNPの形態を評価してください。HP-UiO-66-NH₂ NPは球形の形態を示し、サイズ分布は約100 nmと狭いです(図2D)。
    注意:HP-UiO-66-NH₂ NPは微孔孔と中間孔の両方を持ち、その後のHb封膜に適しています。
13. HP-UiO-66-NH₂ NPの合成は、ステップ2.1から2.9で使用される試薬と溶媒の量を比例的に増やし、複数の並列溶媒反応を行うことでスケールアップできます。モル比、濃度、反応温度、反応時間を同じに保ち、試薬と溶媒の量を1.5倍に増やすことで、2つ以上の150 mLテフロン裏打ちオートクレーブまたは丸底圧力容器を同時に稼働させることが可能となり、HP-UiO-66-NH₂ NPのグラムスケール生産が可能になります(図3)。
    注意:すべての有機溶剤は、白衣、耐酸手袋、適切な目の保護具を着用した状態で、排気フード内で取り扱ってください。DMFを含むすべての廃棄物を収集し、デンマーク環境省のガイドラインに従い「DMFおよび混合物」とラベル付けされた指定された容器(グループC)に有機化学液体廃棄物として処分してください。微量のZrCl4およびHClを含む廃棄物溶液は適切に取り扱われました。対応する廃棄物処理に関する文書は補足ファイル1に記載されています。

3. HP-UiO-66-NH₂ NPのアジド官能化(HP-UiO-66-N₃ NP)(期待期間:1日)

注意:トリメチルシリルアジド(TMSN₃)および三三ブチル亜硝酸塩(tBuONO)は有毒かつ揮発性があります。すべての作業は、白衣、ニトリル手袋、目の保護具を着用して、排気フード内で行ってください。

1. HP-UiO-66-NH₂ NP(50 mg)を25 mLの丸底フラスコに正確に計量してください。THF(10 mL)を加え、5分間超音波処理して粒子を完全に分散させます。サスペンションは不透明ですが均一です。
   注:超音波処理後のNPの均一な分散は、反応物との効果的な接触に不可欠です。分散が不完全の場合は溶液の体積を増やし、超音波検査を繰り返します。
2. フラスコを400rpmに設定した磁気攪拌器の氷水浴(0°C)に入れます。ガラスシリンジを使い、温度を5°C以下に保ちながら5分間にわたり0.4mLのブオノを滴り加えます。
3. すぐにTMSN₃(0.35 mL)を同じ冷温条件下で滴りずつ加えます。軽い発泡が現れることがあり、窒素化の進行を示します。反応を光から守るために、浴槽をアルミホイルで包んでください。
4. 反応混合物を氷水浴で一晩(~16時間)攪拌し続け、MOF表面のアミン基の完全なアジド置換を可能にします。
5. 氷浴を取り除き、懸濁液が室温に達するまで待ちます。遠心分離機(11,000 x g、5分、室温)で改良NPを回収します。沈殿物が完全にペレット化していない場合は、遠心分離時間を必要に応じて延長してください。
6. ペレットはTHF(10 mL)で3回徹底的に洗浄し、各洗浄後は遠心分離(11,000 x g、室温5分)で回収します。続いて、同じ条件下で遠心分離機でアセトン(10 mL)を使った追加3回の洗浄を行い、残留試薬や副生成物を除去します。沈殿物が完全にペレット化していない場合は、遠心分離時間を必要に応じて延長してください。
7. 製品(HP-UiO-66-N₃ NPs)は、オーブン(140°C)で真空で一晩乾燥させた後、排気フード内で乾燥させます。典型的な収量は約45mgと予想されます。
8. FTIR分光法で化学変換を検証してください:~2122 ^cm-1 の位置で鋭い非対称アジドの伸びが現れます(図4A)。バンド強度は表面置換効率と相関しています。
   注意:変換が不完全だと、その後のクリック活用に影響を及ぼす可能性があります。アジド帯が弱い場合は、tのBuONOとTMSN₃の2倍量を用いて官能機能化を繰り返します。結晶性と中間孔構造が保たれたアジド終端のHP-UiO-66-N₃ NP(図4B-D)が期待され、Hbカプセル化およびSPAAC PEGylationが準備整備されています。
   注意:他の試薬(例: tBuONOやTHF)を含むすべての廃棄物液体は、デンマーク環境省のガイドラインに従い、指定されたグループO有害廃棄物容器に収集してください。すべての容器にTMSN₃およびその混合物の存在を示す明確なラベルを付けてください。関連する廃棄物処理に関する文書は 補足ファイル1に記載されています。

4. Hb負荷と数値化(予想期間:2日)

1. HP-UiO-66-N₃ NPs(5 mg)を2 mLの遠心分離機チューブに移し、その後0.5 mLのHEPESバッファー(20 mM、pH 7.4)で2~2分間超音波検査を行います。Hbを含むHEPESバッファー0.5mL(20 mg ^mL-1)を加え、チューブを数回優しく反転させてNPを完全に分散させます。
2. チューブをサーモシェーカーに置き、室温(22〜25°C)で1,000rpmで2時間振ってキュベーションします。
3. 培養後、室温で13,500 x g を5分間遠心分離し、得られた Hb@HP-UiO-66-N₃ NPsをペレット化します。未捕獲のHbの定量のために上清液を慎重に採取してください。沈殿物が完全にペレット化していない場合は、遠心分離時間を必要に応じて延長してください。
4. ペレットを超純水(1 mL)で優しく洗浄し、上下にピペットで緩く吸着した水素を除去し、洗浄を2回繰り返します。各洗浄液の上清液を慎重に採取し、未捕獲のHbの定量を行います。最終ペレットを0.5 mLの超純水に再懸浮させて特性評価を行います。酸化を防ぐために、サンプルは冷蔵庫(4°C)で保管してください。
5. 鹵素硫酸ナトリウムラウリル硫酸(SLS)-Hbアッセイ⁵¹を用いて、収集した上清液中の未捕獲Hbを決定します。各上清液を10 μLを96ウェルマイクロプレートにピペットし、100 μLのSLS試薬(超純水で0.6 mg ^mL-1 )を加えます。暗闇で室温で5分間インキュベートし、その後UV-vis分光光度計で412nmの吸収を測定します。
6. HEPESバッファーでHbストック溶液(0-10 mg ^mL-1)を用いて標準曲線を作成し、吸収度値を濃度に変換します。
7. カプセル化効率(EE)とロード内容(LC)を次のように計算します:
   EE(%)=[(初期Hb - 上清Hb)/初期Hb]×100
   LC(%)=[(被包Hb)/(被包Hb + NP質量)] × 100
8. Hbカプセル化を拡大するために、NP100mgを20 mL(10 mg mL⁻¹)のHb溶液と併せてインキュベートします。カプセル化後の孔隙率を評価するために、得られたNPをエタノールに24時間浸漬し、その後140°Cの真空オーブンで一晩乾燥させ、_N2 吸着-脱着等温線を記録して多孔率を評価します。粉末の赤色はHbのカプセル化に成功したことを示し(図5A)、_N2 の取り込みが著しく減少することで、中間孔がHbで満たされたことが確認されます(図5B)。
9. ゼタサイザー・ナノZSを使ってζ電位を測定します。表面電荷は~+40 mV(HP-UiO-66-N₃ NPs)から~+20 mV(Hb@HP-UiO-66-N₃ NP)に減少し、Hb吸着と一致します(図5C)。
10. オプションとして、SEM顕微鏡(図5D)およびPXRD回折図(図5E)を取得し、形態学的完全性と構造的安定性を確保します。
11. NPの可逆的な酸素結合を評価するためにUV-vistスペクトル(375-700 nm)を記録します。ナトリウムジチオナイトを加え、_N2 で10分間パージして酸素を放出し、スペクトルを記録し、その後空気で10分間パージして再結合を許可し、再度スペクトルを記録します(図5F)。
    注:空気でパージした後、酸素(ソレットバンドは約412nm、Qバンドは541および577nm)および脱酸素(Qバンドは約557nm)のHbが特徴的に存在し、N2はHbが機能し続けていることを示しています。
12. 機能的に活性化し酸素化挙動が可逆的であるHbを含む均一な赤色Hb@HP-UiO-66-N₃ NPが期待されます。

5. Hb@HP-UiO-66-PEG NPの製造:SPAACによるPEG化(期待期間:2日)

1. 2 mLの遠心分離機チューブを準備し、Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs(10 mg)を0.5 mLの超純水に分散させます。DBCO-PEG(Mw ~2,000、0.5 mL超純水に20 mg)を加え、PEGとNPの比率を2:1(w/w)にします。完全に混ざるまで優しく渦巻きます。
2. 混合物を室温で1,000rpmのサーモシェイカーで1時間培養し、その後冷蔵庫(4°C)に移して一晩(~16時間)反応させます。この触媒を含まないSPAACクリック反応は、DBCOをアジド基と共有結合させ、安定したトリアゾール結合を形成します。
3. 室温で12,000 x g の遠心分離機で5分間、PEG化Hb@HP-UiO-66-PEGNPをペレット化します。沈殿物が完全にペレット化していない場合は、遠心分離時間を必要に応じて延長してください。反応していないPEGを含む上澄液は捨てます。
4. 同じ遠心分離条件下で、超純水(ピペッティングで上下にピペットで各2mL)でペレットを3回洗浄します。これにより遊離PEG鎖や小さな分子副産物の除去が確実に行われます。
5. 精製したHb@HP-UiO-66-PEGのNPを2 mLの超純水に再懸浮させ、4°Cで保存します。
   コロイドは均一でやや乳白色をしており、良好な分散安定性を示しています。
6. FTIR分光によるPEG化の成功を確認し(図6A):2122 ^cm-1 でアジドバンドの消失、PEG由来メチレン(−CH₂−)およびエーテル結合(−O−)シグナルがそれぞれ2883および1097 ^cm-1で出現。
7. アルカリ性消化後の ^1HNMR(図6B)で2 M KOH/D₂Oで検証。PEG化サンプルは、PEGのオキシエチレン陽子に対応する4 δ = 3.53 ppmの追加シグナルを示します。
8. DLSによって流体力学的直径および多分散指数(PDI)を測定します(図6C)。
   ~115 nm(PDI ~0.1)から~140 nm(PDI ~0.17)への拡大により、薄いポリマー層による表面コーティングが確認されました。
9. オプションとして、Zetasizer Nano ZSを用いて表面ζ電位を測定し、表面PEG化が表面電荷に与える影響がほとんどないかを検証します(図6D)。PEG化後のわずかな変化(~+20 mVから~+17 mV)は表面電荷への影響が最小限であることを示しています。
10. TEMによる形態を観察してください(図6E)。TEMは粒子の縁の周囲に拡散した~10〜12nmのリムを明らかにし、PEGコロナを表します。
11. 酸素電極(図6F)を用いて酸素放出アッセイを行い、PEG基化後もHb機能が保たれていることを示し、これはPEG化されていない形態と同様です。安定した赤褐色の分散したHb@HP-UiO-66-PEG非物質が、強いコロイド安定性と酸素結合能力の保持を示し、長期的な生理学的検査に適しています。
12. オプションとして、Hb@HP-UiO-66-PEGNPにカプセル化された遊離HbおよびHbの酸素解離曲線(ODC)を行い、50%Hb酸素飽和度(p50)およびヒル係数(Hill-n)を特定します(図7)。

6. NPの安定性評価(期待期間:7日)

1. Hb@HP-UiO-66-PEG NPs(~5 mg)を7本の2 mL遠心分離機チューブに投与します。超純水、生理食塩水(0.9% NaCl)、HEPES(20 mM)、マウス血清、ヒト血漿、Dulbecco改良Eagle中高グルコース(DMEM)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の各培地を2mL加えます。培養中の培地蒸発を防ぐため、遠心分離機のチューブキャップをしっかり閉じることを必ず確認してください。CD-1マウス血清およびヒト血漿はInnovative Research(米国ミシガン州ノヴィ)から購入されています。
2. サンプルは37°Cで1,000rpmのサーモシェーカーで最大7日間キュベートします。
3. 3日と7日後、遠心分離(12,000 g、10分、室温)で粒子を採取し、超純水で一度洗浄し、PXRD用に乾燥させます(図8A)。沈殿物が完全にペレット化していない場合は、遠心分離時間を必要に応じて延長してください。
4. 0、24、72、168時間で、アリコット(~50μL)を抽出し、DLS分析(サイズおよびPDI)のために20倍に希釈します(図8B)。
5. オプション:PBSで48時間後にSEMサンプルを準備し、形態を目視的に確認します(図8C)。
   注:NPの懸濁液(PBS中)を超純水で希釈することは、緩衝成分からの背景干渉を減らし、NPの鮮明なイメージングを促進するため、SEM分析に不可欠です。
6. 同じ条件下で非PEG化Hb@HP-UiO-66-N₃ NPと比較してみると、特徴的な結晶反射の急速な消失と広範な非晶質散乱の特徴の出現は、PEGコーティングなしの不安定性を示しています。
   注:PEG化サンプルはすべての培地で7日間経っても構造的に無傷のままですが、PEG化されていないサンプルはPBSまたはDMEMで24時間以内に分解されます。

7. 物理化学的特徴評価(予想期間:~15日)

注:この節では、NPの形態、組成、多孔率、Hbの完全性を確認するために必要な解析手法について説明します。これらの特性評価技術は、合成および修飾プロセスの再現性を検証するものです。

1. PXRD
   1. 測定前に、吸着した水分を除去するために、各NPサンプルあたり5~mgを冷凍乾燥機で一晩乾燥させます。
   2. サンプルを平らなゼロバックグラウンドシリコンホルダーに装着し、清潔なガラススライドで優しく平らにして薄く均一な層を形成します。
      注意:強く押さないと好みの向き効果が出ることがあります。
   3. Cu Kα放射(λ = 1.5418 Å)を搭載したベンチトップ回折計を用いてPXRDパターンを記録します。スキャンパラメータを2θ = 4-50°、ステップサイズ=0.02°、滞留=1ステップあたり1秒に設定します。
   4. 得られたパターンを、以前報告された結晶データに基づくMercuryソフトウェアで生成されたUiO-66構造と比較してください。³¹。7.3°、8.4°、25.7°に鋭いピークが存在することは結晶の完全性を示します。
2. N₂ 吸着-脱着(BET表面積および孔径分布)
   1. Micromeritics Smart VacPrepシステム(超高純度_N2パージング付き)を用いて、140°Cの真空下で各NPサンプル100mg~100mgを24時間デガスします。
   2. 脱ガスされた試料を直ちにマイクロメリティクス・トライスター表面積分析装置の分析ポートに移します。相対圧力範囲(P/P₀)0-1の77 KでN₂ 個の等温線を記録します。
   3. 拡張されたルーケロール基準⁵²に従い、BET法を用いて表面積を計算します。Micromeriticsソフトウェアに実装された非局所密度汎関数理論を通じて、孔径分布を計算します。
   4. Origin 2022を使って吸着/脱着曲線および孔径分布プロットを作成しましょう。吸着/脱着データをソフトウェアにインポートし、X軸に相対圧力(P/P₀)、Y軸に吸着体積N₂ を配置します。
   5. 孔径分布データをX軸に、増分孔体積をY軸にプロットします。結果を「線+記号」グラフとして提示します。すべての解析はデフォルトのソフトウェア設定で行ってください。
3. FTIR分光法
   1. 乾燥サンプル1つあたり~5mgを、清潔な瑪瑙モルタルで細かい粉末に粉砕します。粉末をALPHA-Pブルーカー分光計⁵³のATR結晶に置きます。
   2. 解像度2cm1で4,000〜400cm-1の範囲のスペクトルを収集します。
   3. 特徴的なピークの特定:約2122 ^cm-1でN₃ストレッチが現れることでアジド形成が確認されます(図4A)。PEG基化後、−CH₂−およびC-O-Cバンドがそれぞれ~2883 ^cm-1および~1097 ^cm-1で観察され、_N-3の伸縮が消失します(図6A)。アジドバンドの消失とPEG由来のメチレン(−CH₂−)およびエーテル骨(−O−)シグナルの出現により、SPAAC反応の完了が確認されます。
   4. Origin 2022を使ってFTIR曲線をプロットします。X(波数)とY(送信)値で生データをソフトウェアにインポートします。ソフトウェアのデフォルト設定を使って「線」形式のグラフを生成してください。
4. ¹H NMR
   1. ガラスバイアルに2 M KOHを0.5mLにNPs~10mgを加え、80°Cで1〜2時間加熱して骨格を消化します。
   2. 遠心分離機(12,000 x g、10分、室温)で未溶解残渣をスピンで分解します。上澄液を5mmのNMRチューブに移します。
   3. 400 MHzのBruker Avance分光器で ^1HNMRスペクトルを記録します。
   4. BestReNovaのソフトウェアを使って、BDC-NH₂ の芳香族陽子(δ=6-8 ppm)やPEGシグナル(δ = ~3.53 ppm、 図6B)を含む特徴的な化学シフトを割り当てます。ソフトウェアのNMR処理モジュールのデフォルト設定でNMRデータを解析します。
5. SEM
   1. シリコンウェハに~5μLのNP懸濁液を沈着させます。ほこりのないキャビネットで自然乾燥させます。充電が発生した場合は、5nmの金でスパッターコートを施してください。
   2. FEI Quanta 200 SEMを10-20 kVの加速電圧で撮影した画像。
   3. 画像をImageJで分析してください。スケール情報が埋め込まれた元のTIFF画像をソフトウェアにインポートし、明るさとコントラストは視覚化のためだけに調整します。寸法情報に影響を与える可能性のある追加の処理は行わないでください。ソフトウェアの分析機能を使ってスケールバーを生成してください。
6. TEM
   1. レーシーカーボンCuグリッド(300メッシュ)に約5μLのNP分散を置きます。余分なフィルターペーパーで吸い取り、常温で乾燥させます。
   2. FEI Tecnai T20 G2 TEMを200 kVで試験します。
   3. 画像をImageJで分析してください。画像処理は 7.5.3節に記載された手順に従います。
7. DLSとζポテンシャル
   1. サイズおよびPDI解析のために超純水でNPを20倍ほど希釈すること;ζ電位についてはHEPESバッファー(20 mM、pH 7.4)で希釈します。
   2. Zetasizer Nano ZSを25°Cで測定してください。 少なくとも3つの独立したサンプル(n = 3)が準備され、それぞれのサンプルは三重に測定されます。
   3. DLSおよびζ潜在データをOrigin 2022を使ってプロットしてください。強度加重粒子サイズ分布を「線+記号」グラフとして、ζポテンシャル結果を「カラム」グラフとして提示します。データを平均±標準偏差(n = 3)として報告します。すべての解析はソフトウェアのデフォルト設定で行ってください。
8. Hb機能のためのUV-vis分光法
   1. 3 mLの超純水に3 mgの遊離Hbまたはそれに対応する量のNP(すなわち、同量の封膜化されたHbを含むもの)を分散します。サスペンションをクォーツのキュベットに移してください。UV-2600 UV−vis分光光度計を用いて375〜700 nmのUV-visスペクトルを記録します。
   2. ナトリウムジチオナイトを少量の水素溶液またはNP懸濁液に加え、_N2 で10分間パージしてサンプルの酸素を脱酸素します。ソレットバンドが412nmから430nmにシフトし、Qバンドの合体を記録します。試料を10分間空気で泡立てて再酸素化し、逆転を観察します(図5F および 補足図1)。
   3. Origin 2022を使ってデータをプロットします。スペクトルを「線グラフ」として提示し、波長はX軸、吸収はY軸に配置します。
9. 放出酸素の定量化
   1. 遊離Hb1mgまたはそれに対応するHb@HP-UiO-66-N3_および Hb@HP-UiO-66-PEGNP(同量の封入Hbを含む)を600μLの超純水に分散します。懸濁液を2mLのガラスバイアルに移し、ゴムキャップでしっかり密封します。
   2. 酸素電極の針プローブをゴムキャップを通して懸流液に慎重に挿入し、針式_O2 メーターを使って溶存酸素レベルを監視します。
   3. 注射針を使って懸濁液にK₃[Fe(CN)₆]溶液(100μL超純水で10wt%)を素早く加え、酸素レベルの変化を継続的に記録します。
   4. K₃[Fe(CN)₆]加算後の最大値を、加算前の初期値から引いて放出酸素を計算します。Origin 2022を使って、同じ量の遊離Hbから放出される酸素(図6F)に正規化します。遊離Hbまたは各NPに対して3つの独立したサンプル(n=3)を測定します。
      注:Hb@HP-UiO-66-N₃ およびHb@HP-UiO-66-PEGのNPは同等の酸素放出を示し、それぞれ遊離Hbから放出される酸素の約60%を放出します。
10. ODCの測定とp50およびヒル-nの計算
    1. 最終Hb濃度~1 ^mL-1 の遊離牛HbまたはHb@HP-UiO-66-PEGを、3 mL HEPESバッファー(20 mM HEPES、0.9% (w/v) NaCl、pH 7.4)で調製します。試料を磁気攪拌棒付きのクォーツキュベットに移します。
    2. キュベットをヘモックス分析装置に入れます。測定温度を37°Cに設定し、安定した基準線が得られるまで連続攪拌のもとでシステムを平衡させます。
    3. 1〜148 mmHgの部分圧範囲で段階的に脱酸素化することでODCを記録します。プリインストールのHemox分析ソフトを使ってODCを測定し、デフォルトの分析設定でp50とHill-nを計算してください。各サンプルごとに3つの独立したサンプル(n = 3)を測定します。
    4. 処理済みデータをエクスポートし、デフォルトの「線」グラフ形式でOrigin 2022を使ってODCをプロットします。

8. 再現性と統計分析

1. このプロトコルで記述されたすべての手順を少なくとも3回独立に実行してください。これらの繰り返しで観察された典型的な結果として結果を報告してください。反応時間や温度などの主要な実験パラメータを合理的な範囲内に保ち、他のユーザーにとって再現性と信頼性を確保します。
2. 構造特性評価(PXRD、N₂ 吸着脱着、FTIR、 ^1HNMR、SEM、UV-vis)を、統計解析を行わずに質的確証のための代表的なデータとして提示します。
3. 定量的測定値(DLS、ζ電位、p50、ヒルn)を平均 ± SD(n ≥ 3)として報告します。適宜、非ペアの二尾ウェルチt検定または一元ANOVAを用いて統計的有意性を決定します。有意水準をns(有意なし)、* = p < 0.05、** = p < 0.005、*** = p < 0.001、**** = p < 0.0001。

結果

HP-UiO-66-NH₂ NPの成功した合成はPXRDによって検証され(図2A)、特徴的な回折ピークは2θ=7.3°、8.4°、25.7°にあり、模擬されたUiO-66構造³⁶とよく一致しました。模擬パターンに対するわずかなピーク広がりは、粒子のナノスケールの寸法に起因し、合成⁵⁴後の結晶の完全性の維持が確認されました。アルカリ消化後の ^1HNMR分光法により、DAの特徴的なメチレン陽子シグナルが1.2 ppmで欠如していることから、DAの完全除去が確認されました(図2B)。N₂ の吸着-脱着等温線はタイプIとタイプIVのプロファイルが結合し、P/P₀ = 0.8-1.0の間にヒステリシスループが観察され(図2C)、微細孔質ドメイン...

ディスカッション

このプロトコルは、Hbカプセル化および酸素供給用途向けに設計されたHP-UiO-66 NPの合成、機能化、特性評価のための堅牢かつ再現性の高いルートを提供します。インサイドアウトの工学アプローチを採用することで、本研究は生体マクロ分子や薬物送達を含む生物医学応用のためのMOF非点子設計のための汎用的な枠組みを確立します。基盤となる材料概念や機能的パフォーマンスは以前にも報告されていますが、本プロトコルは運用の明確さ、再現性、拡張性を重視することで、従来の研究を大幅に拡張しています。詳細な取り扱い手順、敏感な段階のトラブルシューティングガイダンス、グラムスケール合成のための実践的な指示が提供され、ラボ全体での信頼性の高い実装を促進します。以下で説明するように、最適な構造的・機能的特性を持つ一貫したNPを得るためには、いくつかのステップが特に重要です。

HP-UiO-66-NH₂ NPの欠陥合成<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-アミノ-1,4-ベンゼンジカルボン酸	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	381071-25G
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルフォン酸	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	H3375-100G
アセトン(99%)	VWRインターナショナル(Søボーグ、DK)	23J244030
ビシンコニン酸タンパク質アッセイ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック(ロスキレ、DK)	23235
牛の血など;	SSI診断A/S(ヒラー&オスラッシュ;d、DK)	77667
遠心分離機チューブ
遠心分離機およびnbsp;	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(米国マサチューセッツ州)	75009903	メガフュージSTプラスシリーズ
重水素酸化物	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	151882
ジベンゾシクロオクチン-ポリエチレングリコール	ブロードファーム	BP-23949
ドデカノン酸およびnbsp;	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	L556-1KG
ダルベッコ改良型イーグル」S中・マイナス;高血糖	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	11965092
エタノール(100%)	VWRインターナショナル(Søボーグ、DK)	24L044013
赤外線分光法およびフーリエ変換、	ブルーカー(ビレリカ、アメリカ)
ヘモックス分析装置およびnbsp;	TSCサイエンティフィックCRP(ペンシルベニア州、アメリカ)
ヒトシエント化血漿	テブビオ	SER-PLP25
塩酸(37%)	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	320331-500ML
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所(NIH)		バージョン 1.47t
レースカーボンCuグリッド(300メッシュ)	アガー・サイエンティフィック社(イギリス、スタンステッド・エセックス)	AGS166-3H
磁気攪拌器	IKA-Werke GmbH &ケガド中隊(DE)	身分証明。番号:0010011496
MestReNova sofeware	Mestrelab Research(スペイン)		バージョン12
マイクロメリティクス トライスター表面積分析器	サーモフィッシャー・サイエンティフィック社	ASAP 2020プラス
ミニ遠心分離機	エッペンドルフ・ノルディック(Hørsholm, DK)	カタログ番号 5452000010
マウス血清	イノベーティブ・リサーチ(ミシガン州ノヴィ、米国)	IGMSCD1SER10ML
マッフル炉とnbsp;	ナベルテルム GmbH(ブレーメン、デラウェア州)	マッフル炉 LE 6/11
N,N′-ジメチルホルムアミド(99.9%)	VWRインターナショナル(Søボーグ、DK)	250131a008
ナノドロップ2000c機器	サーモ・フィッシャー
核磁気共鳴	ブルーカー(ビレリカ、アメリカ)
O2メーター	プレゼンス(ドイツ・レーゲンスブルク)
Origin 2022ソフトウェア	オリジンラボ・コーポレーション(マサチューセッツ州、アメリカ)		バージョン 2022
酸素センサー	プレセンス(レーゲンスブルク、DE)	OXY-1 ST痕跡
リン酸塩緩衝塩水	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	P4417-50TAB
プレートリーダー	テカン・グループ株式会社およびnbsp;(Männedorf, CH)
六サシアノフェル酸カリウム	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	60299-100G
水酸化カリウム	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	221473-500G
粉末X線回折	マルバーン・パナリティカル社(マルバーン、英国)		モデル:Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD(粉末測定用)(2020年発売)
丸底圧力容器	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	SYNP170004-1EA
走査型電子顕微鏡	FEI中隊(ヒルズボロ、アメリカ)	デュアルビームFEI Helios Nanolab 600
クロリドナトリウム	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	71376
ジチオナイトナトリウム	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	71699-250G
ナトリウムドデシル硫酸塩およびnbsp;	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	L4509-100G
シンスウェア&トレード;丸底圧力容器	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	SYNP170003
テルトブチル亜硝酸塩	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	20370-100ml-F
テトラヒドロフラン(99.7%)	VWRインターナショナル(Søボーグ、DK)	201022A004
サーモシェーカー	グラント・インスツルメンツ(ケンブリッジ)Ltd(英国)	PHMT-PSC18(01012015020119)
透過電子顕微鏡法およびnbsp;	FEI中隊(ヒルズボロ、アメリカ)	FEI Tecnai T20
トリメチルシリルアジド	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	155071-10G
TSC HEOX DAQシステム	TSCサイエンティフィックCRP(ペンシルベニア州、アメリカ)		Hemox分析ソフト
ウルトロサウンド・ソニケーター	ブランソン超音波コーポレーション(ダンベリー、アメリカ)	SKU:2410240003
UV-Vis分光光度計およびnbsp;	島津(京都、日本)
真空オーブン	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(米国マサチューセッツ州)
ゼタサイザー・ナノZS	マルバーン・パナリティカル社(マルバーン、英国)	シリアル番号。MAL1188530
ジルコニウム(IV)塩化物	メルク生命科学A/S(Søボーグ、DK)	357405-100G