ナノエマルジョン用途におけるヒヨコ豆タンパク質濃縮物の構造的、熱的、機能的特性に対する空気分類に基づく乾式分画の影響

Summary

乾燥抽出したひよこ豆タンパク質濃縮液は、高タンパク含有量、強い発泡特性、そして3.0%のw/v濃度でのナノエマルジョンの効果的な安定化を示しました。構造解析および熱解析により、残留結晶度が低く分子柔軟性が高まった非晶質優性組織が示され、食品コロイドシステムにおける持続可能で植物由来の機能成分としての適合性が支持されました。

Abstract

ひよこ豆タンパク質濃縮物(CPC)はドライ抽出法で得られ、その組成的、機能的、構造的特性から体系的に特徴付けられ、ナノ乳剤(NE)への適用性を評価しました。乾燥抽出されたCPCはタンパク質含有率が44.8%で、発泡能力61.1%と94.7%の高い発泡安定性など、優れた機能性能を示し、効率的な界面吸着と凝集性のある膜形成を反映しています。乳化剤として3.0% w/v CPCを用いたNE製剤は、液滴サイズを大幅に減少させ、Z平均液滴直径152.7 nm、低ポリ分散指数(0.30)を得ました。これにより、細かく比較的均一な液滴サイズ分布と動態的に安定したコロイド安定性が示されました。ひよこ豆粉(CF)とCPCの比較差分走査熱量測定(DSC)解析により、主に2つの吸熱転移が明らかになりました。両サンプルとも結合水の放出に関連する68.4°Cの低温遷移を示しましたが、CPCはエンタルピー変化が大幅に低く、乾燥抽出後の天然分子秩序の部分的な乱れを示しました。NE系で用いられたCPCのX線回折(XRD)プロファイルは、2θ範囲の10°〜30°の範囲に広い非晶質ハローを示し、その間に限られた低強度の鋭い反射が散在していました。これらの発見は、部分結晶領域を持つ非晶質優性構造を裏付けており、濃縮物の全体的な結晶度は約15%と推定されています。本研究は、乾燥空気分類CPCを用いた油水中NEの再現可能かつ溶剤フリーの製造プロトコルを説明し、教育用途および産業規模拡大の可能性に適しています。

Introduction

豆由来のタンパク質は、構造的に安定した食品乳化剤の設計における多機能成分として大きな注目を集めています。これらの産物の中で、ひよこ豆(Cicer arietinum)は、世界で3^番目に広く栽培されている豆科作物であり、豊富なタンパク質含有量(18%〜24%)、低アレルギー性、そしてバランスの取れた必須アミノ^{酸プロファイル1,2}で特に注目されています。一般的に、タンパク質分離株は炭水化物や脂肪を除去するための追加加工を受けるため、タンパク質濃度が高く(80%〜90%)なりますが、CPC(50%−75%)は食物繊維やその他の必須栄養素を保持します^。これらの栄養的・農学的利点は、ヒヨコ豆タンパク質が従来の植物性・動物性タンパク質乳化剤の有効な代替手段であることを示しています。広範な使用にもかかわらず、従来の低分子量界面活性剤で安定化された乳剤は、熱力学的に不安定であり^、貯蔵中に凝集、凝集、相分離しやすいことが多いです。対照的に、液滴径が200 nm未満のNEは、速度論的安定性の向上、封膜されたバイオアクティブ化合物の保護性向上、水系での分散性の向上を示します。その結果、NE技術は、放出制御と疎水性成分の生体利用能向上を備えた機能性食品開発の効果的な戦略として浮上^{しました。}

最近の研究では、CPCがNE形成において良好な界面および機能的特性を示し、強い水結合能力、顕著な発泡性能、油と水の界面の安定化能力などが報告されています。CPCは乳化の安定性とクリーンラベルの魅力により、マヨネーズ型乳化剤における卵黄の代替品として評価されています^。これらのモデルシステムを超えて、ひよこ豆タンパク質ベースのナノエマルシファーは、飲料(濁った飲み物、プロテインウォーター、抗酸化飲料、クルクミン、オメガ3脂肪酸、カロテノイド、エッセンシャルオイルのナノエンカプセル化)、植物由来乳製品類似体、低脂肪製剤、ベーカリーや菓子のフィリングなど、さまざまな食品マトリックスに応用が期待^{されています。}

ひよこ豆タンパク質(CP)の乳化機能は^{広く報告されています}が、乾燥抽出経路由来のナノ乳化システムは、特に再現性、構造的完全性、食品用途のスケーラビリティに関して比較的限定的な注目しか受けていません。従来の湿式抽出プロトコルが広範なpH調整、遠心分離、溶媒除去を必要とするのに対し、空気分類は水や化学薬品、過剰な熱処理を使わずに常温条件下での迅速なタンパク質濃縮を可能にします³。したがって、乾式抽出はタンパク質の機能性を維持しつつ環境負荷や加工の複雑さを軽減するという明確な利点を提供します^3,6。

しかし、現在の食品コロイド研究における重要な未充足の課題は、ドライ抽出がタンパク質構造や熱挙動をどのように変化させるか、そしてこれらの変化がナノ乳化性能やコロイド安定性にどのように結びつくかを明確に理解することです。特に、分子組織、界面活性、発泡挙動に関わる構造-機能関係の体系的な評価が、CPCベースの食品コロイ^{ドシステムの応用}を進めるために必要です。

本研究の新規性は、乾燥空気分類CPCを再現可能で溶媒を含まないナノ乳化剤として利用し、その組成的濃縮と構造的、熱的、界面的機能性を直接関連付けることにあります。したがって、本研究は、乾気分類によって得られたCPCが、組成的豊化とその構造的、熱的、界面的特性を体系的に結びつけることで、効果的なナノエマルシザーとして機能できることを示すことを目的としています。特に物理化学的特徴付け、発泡能力と安定性、XRD解析に重点を置き、NEの形成と安定性を支配する構造-機能関係を明らかにします。

Protocol

試料の調製
ひよこ豆粉(CF)からのタンパク質分離
2025年の生育シーズンに収穫され、トルコ南東部から調達されたカブリひよこ豆(Cicer arietinum L.)は、衝撃に基づく空気分類ミリングシステムで加工されました。このシステムでは、粒子に遠心力と繰り返しの衝撃を加え、粉砕ディスクやリングギアに加害しました。初期のプレミリング工程の後、粗い粒をさらに粉砕して空気分級ミルを用いてCFを製造しました。インパクトミリング中は、40〜45 m³/hのエアフロー率、7,000〜8,000 rpmの分類機速度、200 kg/hの送り速度が適用され、これは文献⁸に記載された運用条件および社内最適化プロトコルに従って行われました。

その後、同じ空気分類システムを用いて、常温での空気分類によりCFからタンパク質豊富な微細分画が得られました。分類車の車輪速度は10,000rpmに設定され、送り速度は約200 kg/h、気流量は52 m³/hで維持され、前述の⁸。この分離工程により、粒子サイズ、密度、空力特性の違いに基づいてタンパク質分画が選択的に濃縮されました。

空気分類の結果、得られた粉末は微細な粒子サイズ分布を示しました(d(0.9) = 20-22μm)。そのため、材料の損失や不必要な機械的応力を避けるためにふるい分けの工程は行われませんでした。タンパク質豊富化された分画は、25kgのガス洗浄ポリエチレン袋に直接包装され、水分の吸収を最小限に抑え機能特性を保存するために4°Cで保存されました。

ナノエマルジョン製剤
CPCは、最終的な配合で活性タンパク質濃度3.0%(w/v)を標的とした油水中(O/W)NEの製剤の唯一の乳化剤として使用されました。この濃度は、1.0% w/v、2.0% w/v、3.0% w/v CPCの予備スクリーニングに基づいて選定され、3.0%が最も効果的なドロップレートサイズ縮小と最も高い短期物理的安定性を提供することが示されました。CPC粉末の測定されたタンパク質含有量(44.8% w/w)に基づき、必要な粉末濃度は6.67% w/vと計算されました。CPCは連続水相の乳化剤として機能し、中鎖トリグリセリド(MCT)オイルは分散油相として専用で、5.0% v/vの固定濃度で使用され、100 mL製剤あたり5.0 mLのオイルに相当します。いかなる製剤においても低分子量界面活性剤は使用され^{ませんでした。}

水性CPC分散は、計算されたCPC粉末を超純水に溶かし、800rpmの連続磁気攪拌を1,800秒間行って、完全な水和と均一なタンパク質分散を確保して調製しました。完全な水和は、目に見える粒子や堆積物がないことで確認されました。

油相は連続攪拌のもとで水和CPC溶液にゆっくり加えられ、その後12,000rpmで240秒高せん断均質化され、粗い(従来型)乳剤が生成されました。これは均一で不透明な外観で、油の分離が目に見えない形で識別されます。これらの条件は、タンパク質の凝集を避けつつ、十分な滴滴破壊を確保するために選定されました。

その後、粗い乳剤を30%振幅でプローブソニック化して180秒間取得し、試料温度を30°C以下に保ちタンパク質凝集を防ぐために氷水浴で行いました。超音波検査中は断続的に温度を監視しました。予備的な最適化実験(データ未記載)では、60秒、120秒、180秒の超音波処理時間が評価され、180秒が最適条件として選ばれ、200nm未満の液滴径かつ低いPDIのNEの再現性に基づき最適条件が選ばれました。したがって、本研究で報告されたすべてのNEは、最適化された超音波処理時間180秒を用いて調製されました。

NE形成の成功は、1,800秒の静止後に位相分離が見られない安定したやや乳白色の分散が現れたことによって支えられました。目に見えるクリーミングや相分離を示すサンプルは、さらなる解析から除外されました。すべての試料は物理化学的^{特性評価9}の前に室温(25 ± 2 °C)に平衡化されました。

注意:高エネルギー機器(ホモジナイザーおよびソニックケーター)の取り扱いは、機関の実験室安全手順に従って行われました。音響処理中には聴覚保護とスプラッシュシールドが使用されました。乳剤の調製時には酸や塩基は使用されませんでした。したがって、化学的中和や有害廃棄物処理の手順は不要でした。

ひよこ豆粉(CF)およびひよこ豆タンパク質濃縮物(CPC)の栄養学的および物理化学的特性評価
合成分析
CFおよびCPCサンプルの栄養組成は、公式分析化学者協会(AOAC)の公式分析方法を用いて決定されました。粗繊維はAOAC 991.43、総灰はAOAC 923.03、粗脂肪はAOAC 920.39、粗タンパク質はAOAC 984.13に従い、窒素からタンパク質への変換係数はN × 6.25で分析されました。すべてのサンプルの総炭水化物含有量は、水分、タンパク質、脂肪、灰分の割合の合計を100%から差し引いて差分で算出されました^。

色分析
試料の色パラメータは、反射モードで動作するベンチトップカラリメーターを用いて測定されました。測定前は、メーカーが提供した白黒校正基準を用いて標準化されていました。均一かつ再現性の高い測定を確保するため、5.0 gの粉末サンプルを円形のガラス製キュベット(内径64.0 mm)に優しく充填し、滑らかで均質な表面を作り出しました。基材や背景の影響を最小限に抑え、反射条件下で半透明粉末を実質的に不透明にするために、十分な層厚(≥50.0 mm)を適用しました。すべての測定は室温の反射モードで行われました。

色座標はCIELAB色空間で表現され、L*は明度(0=黒、100=白)、a*は赤-緑軸、b*は黄-青軸を表します。追加の色パラメータ、例えば総色差(ΔE*)、クロマ(C*)、色相角(H°)、色指数(CI)は、¹¹ (式1–4)に記載された式に従って計算されました。

(式1)

(式2)

(式3)

(式4)

pH分析
CFおよびCPC試料のpHは、ガラス電極を備えたデジタルpHメーターを用いて、25.0±2.0°Cの試料分散に直接挿入して測定しました。 測定前に、pHメーターは標準的なバッファー溶液(pH 4.0および7.0)を用いて校正されていました。すべての測定は分析的再現性を確保するために三重(n = 3)で実施されました。

含水率
CFおよびCPC試料の残留水分含有量は、制御された加熱条件下で動作する迅速水分分析装置を用いて測定されました。すべての測定は分析的再現性を確保するために三重(n = 3)で実施されました。

CPCの構造的および機能的特徴付け
XRD解析
CPCのXRD解析は、Cu-Kα放射線(λ = 1.5406 Å)を搭載した実験室用X線回折計を用いて行われました。回折図は、2θの範囲10°〜90°、2.5°分¹の走査速度で40 mA、45 kVで記録され、以前に報告された手順¹²に従いました。

ピークの識別、背景減算、曲線フィッティングは標準的なXRD解析ソフトウェアを用いて実施されました。結晶度は、¹³の方法に従い、結晶反射の積分面積と回折グラム下の総面積の比率として計算されました。式(5)に示されています。

(式5)

見かけの結晶粒サイズ(D)は、最も強い回折ピークに適用したシェラー方程式(式6)を用いてXRDデータから推定されました。

(式6)

ここでDは見かけの結晶粒サイズ(nm)、Kは形状因子(0.9と仮定)、λはX線波長、βは選択回折ピークの半倍幅(FWHM、ラジアン単位)、θはブラッグ角です。

差分走査量電(DSC)解析
CFおよびCPCの差動走査量(DSC)分析は、実験室の差分走査量熱計を用いて実施されました。約10.0±0.1 mgのサンプルが正確に計量され、穴の開いた蓋を持つ凹型アルミニウム坩堝で密封され、空のアルミニウム坩堝が基準として使用されました。酸化効果を最小限に抑えるため、窒素大気(20 mL/min)下で測定が行われました。試料は動的スキャン^{条件下で、}0°Cから400°Cまで5°Cの一定加熱速度で加熱されました。測定の正確性と再現性を確保するため、解析前に温度および感度の校正が行われました。

熱遷移は、開始温度(T_o)、ピーク温度(T_p)、エンドセット温度(T_e)、および各遷移に関連するエンタルピー変化(ΔH)を決定することで特徴づけられました。さらに、吸熱ピーク幅(EPW)とピーク高さ指数(PHI)もEqsに従って計算されました。(7)および(8)はそれぞれ以下の通りです:

EPW= (Te−Tp)(式7)

PHI =ΔH/(Tp− To)(式8)

発泡能力(FC)と安定性(FS)
CPC水溶液分散(3.0 g/L)の発泡能力(FC)および泡安定性(FS)はpH7.0で評価され、必要に応じて0.1 N塩酸(HCl)を用いて調整されました。30 mLのタンパク質分散を50 mLのポリプロピレン遠心分離機チューブに移し、11,000 rpmで120秒運転する高速ホモジナイザーで均質化して泡を生成しました。均質化直後にサンプル体積の急増と安定した泡層の形成によって、泡形成が視覚的に確認されました。

FCは均質化直後の体積増加率として計算され、FSは600秒、1,800秒、3,600秒、7,200秒後の保持泡体積に基づいて算出されました。すべての測定は三重行(n = 3)で行われ、FCおよびFS値は方程式に従って計算されました。(9)および方程式。(10)、それぞれ¹⁴:

(式9)

(式10)

注意:希釈塩酸は、手袋や目の保護具を含む適切な検査室の安全対策に従って取り扱われました。廃棄物の処理は機関の化学物質安全ガイドラインに従って行われました。

CPCおよびCPCベースのNEの物理化学的安定性
平均粒子サイズおよび粒子サイズ分布
試料の粒子サイズ分布とZ平均流体力学直径は動的光散乱(DLS)を用いて決定されました。Z平均流体力学直径と多分散指数(PDI)が記録され、それぞれ液滴の平均大きさとサイズ分布の均一性を特徴づけました。^15,16。

測定前に、サンプルは蒸留水で1:100(v/v)の比率で希釈され、複数の散乱効果を最小限に抑え、信頼性の高い光散乱測定が可能となりました。分析は25 ± 2°Cの制御温度で実施されました。 PDIは液滴サイズ分布の均一性を示す指標として用いられ、PDI値が低いほどサイズ分布が狭いほどでした。測定は、新たに調製したNEの0日目と7日間の保管後に行われ、NE系¹⁶の短期物理的安定性を評価するために行われました。測定前に目に見えるクリーミング、沈殿、または相分離を示すサンプルはDLS解析から除外されました。

粒子のζポテンシャル
試料のζ電位は、先に記載された方法^15,16に従い、電気泳動光散乱(ELS)を用いて液滴の正味表面電荷および静電安定性を評価するために算出されました。測定は25.0±2°Cの制御温度で行われ、NEの元のイオン環境を保存するために希釈されていないサンプルを使用しました。

各試料の平均ζ電位値と対応する標準偏差を計算し、静電気相互作用と乳剤のコロイド安定性を評価しました。すべての測定は分散剤として水を用いて行われ、確立された基準に従って行われました

内部標準作業手順^書15.分析前に目に見える相分離やクリーミングが見られたサンプルはζ電位測定から除外されました。

手法検証と期待される結果
方法検証は、Z平均流体力学直径、PDI、ζポテンシャル、応力下での物理安定性などの主要な物理化学的パラメータの評価によって達成されました。プロトコルの成功は、200nm未満の液滴サイズとPDI≤0.30のNEの再現可能な形成によって支えられました。単純な保存を超えた安定性のさらなる検証のため、4,000rpmで900秒の遠心分離応力試験が実施されました。遠心分離後の可視的な相分離やクリーミングがないこと、そして7日間の保存期間における一貫したζ電位およびpHプロファイルが相まって、CPCの堅牢な乳化能力と提案プロトコルの再現性を支持しています。

統計解析
組成および機能測定は三重(n=3)で行われ、構造解析(XRDおよびDSC)は単一の代表的な測定として実施されました。結果は標準偏差(SD)±平均値として示されます。統計評価はSPSSソフトウェアによる一方向分散解析(ANOVA)を用いて実施されました。すべての解析において、p値は統計的有意性を示すと考え<0.05とされました。有意な差異が認められた場合は、複数比較にTukey氏の正直に有意差(HSD)検査を用いました。表や図に示された統計的な連結文字(例:a、b、c)は、Tukey HSD検査の結果から導き出されました。同じ文字を共有しても、5%の有意水準では有意な違いはないということです。

Results

CFおよびCPCの栄養学的および物理化学的特徴付け
組成パラメータ
CFとCPCの組成パラメータは 表1にまとめられています。CPCは44.8%のタンパク質、5.8%の粗脂肪、45.9%の総炭水化物を含み、乾燥分離プロセスの結果としてCFに比べてタンパク質がかなり濃縮していることを示しました。CPCで観察されるタンパク質含有量の増加は、空気分類がタンパク質豊富な部分を濃縮する効果を裏付けています。本研究で得られたタンパク質レベルは、CPCで報告された40%〜55%の範囲に位置し、生成されるCPCが以前に報告されたCPC材料と組成が同等であることを示しています。

組成的強化に加え、CPCは溶解度、保水能力、油保持能力、界面活性などの関連する技術的機能特性を示しました。これらの特性は分散系の形成と安定化に機能的に重要です。これらの特性に沿って、CPCは200nm未満の液滴サイズのNEの形成を可能にし(

Discussion

本研究では、CPCを空気分類によって得られ、その組成的、機能的、構造的、コロイド的特性の観点から特徴付けられ、特に植物由来のナノ乳化剤としての応用に焦点を当てました。空気分類などの非熱的手法では、CFに対してタンパク質含有量が顕著に濃縮され、CPCは44.8^{%となります}3。文献で主に湿抽出に基づくCPCと比較して、本研究は乾燥した空気分類経路が、定義された処理条件下でNE形成と短期的な物理化学的安定性を支えるタンパク質豊富な部分を得られることを示すことで、現在の知見を拡張しています。これは、乳化応用のためにpHシフト、溶媒・化学的入力、広範な水溶液処理工程に依存していた従来の研究とは異なります(17,18,19)。組成解析と界面機能性(泡立)およびコロイド特性評価(Z平均、PDI、ζ電位、25°Cでの7日間保存)を組み合わせることで、本研...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL円錐形チューブ	コーニング	352070	ポリプロピレン遠心分離機管
エアクラスファイアミル		CSM1250	タンパク質分画に用いられるエアクラスファイアミル
分析的均衡	サルトリウス	BCE224I-ISだ	分析バランス(最大容量120g)
自動ピペット	ブランド	3123000055	調整可能なピペット(200 & μ;L、1 mL、5 mL)
遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	冷蔵遠心分離機
ひよこ豆のサンプル		—	食用グレードのひよこ豆
比色計	ハンターラボ	A60-1014-593	色分析用の機器
差動走査型カロリメーター	ネッツシュ	—	DSC解析
デジタル温度計	ハンナ・インストゥルメンツ	HI-98501	温度監視
リン酸二カリウム(Na2HPO4)	シグマ・オルドリッチ	S7907	分析等級
脂肪分析機	C. ゲルハルト有限会社&KG中隊	13-0005	ソックスレットベースの脂肪分析
高速ホモジナイザー	ヴェルプ	SA20900010	粗乳剤の均質化
塩酸(HCl)	シグマ・オルドリッチ	320331	分析等級
塩酸溶液(0.1 N)	シグマ・オルドリッチ	H1758	pH調整
キェルダール触媒タブレット	C. ゲルハルト有限会社&KG中隊	12-0328	キェルダール分析
磁気攪拌器	イカ	3339000	サンプルの混合と水和
中鎖トリグリセリドオイル	Ataman Kimya A.	https://www.atamanchemicals.com /中鎖トリグリセリド-mct _u30009/? lang=TR#:~:text =Orta%20zincirli%20trigliseritler %20(MCT)%2C%20hindistance vizi%20ve%20hurma%20%C3 %A7ekirde%C4%9Fi%20ya%C 4%9Flar%C4%B1nda,g%C3%B Cne%C5%9F%20kremleri%20i% C3%A7in%20%C4%B1slat%C4% B1c%C4%B1%20ajand%C4%B1r.	食品・医薬品グレードのオイル
水分分析器	メトラー・トレド	HC103	水分測定
粒子サイズとゼータポテンシャル解析器	マルバーン・インストゥルメンツ	ZEN3600	DLSと電気泳動移動度
pHメーター	メトラー・トレド	MET-30671567	pH測定
プラスチック遠心分離機チューブ	アイソラブ	078.02.003	使い捨てプラスチックチューブ
豚のペプシン	シグマ・オルドリッチ	P7012	酵素(1:10,000)
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)	シグマ・オルドリッチ	P5379	分析等級
プローブソニケーター	バンデリン	—	乳化音響化
保護ゴーグル	ベイマックス	BX-2500	実験室安全装置
タンパク質アナライザー	C. ゲルハルト有限会社&KG中隊	12-0520	タンパク質の決定
タンパク質消化システム	C. ゲルハルト有限会社&KG中隊	12-0700	ケルダール消化ユニット
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ・オルドリッチ	S9625	分析等級
水酸化ナトリウム(NaOH)	シグマ・オルドリッチ	S5881	分析等級
ヘラ	—	https://www.blabmarket.com/ meta-etiket/plastik-spatul?srsltid =AfmBOoqsvXR_3rQgU1n8QBn DyR_P9D52v2Hahy27RLOH7Zg VbFzzcbsb	プラスチックヘラ
超純水システム	ELGAラボウォーター	PC110COBPM1	水抵抗率18.2 MΩ·CM
ボリューメトリックフラスコ	ショット・デュラン	2120117	100 mL ボリュームフラスコ
水浴	メマート	WTB24	温度管理(20–25 & deg;C)
X線回折計(Cu–Kα)	パナリティカル	STEM-LE-0294-LC	XRD解析(45 kV、40 mA)