全身磁気刺激は、摂食障害のマウスモデルにおける過食的な摂食を減少させます

サマリー

全身磁気刺激(WB-MS)は、食べられる食事への断続的アクセスを伴う過食型の給餌モデルで用いられました。WB-MSはシミュレーション中に一時的に摂取量を減少させ、食事摂取量は変えませんでした。それでも効果は持続せず、治療後に過食様の行動が再発し、体重、脂肪、尿差(c-Fos)の発現に変化はありませんでした。

要約

全身磁気刺激(WB-MS)は、食べられる食事への断続的アクセスを伴う過食型の給餌モデルで用いられました。WB-MSはシミュレーション中に一時的に摂取量を減少させ、食事摂取量は変えませんでした。それでも効果は持続せず、治療後に過食様の行動が再発し、体重、脂肪、尿差(c-Fos)の発現に変化はありませんでした。

概要

過食とは、生理的な空腹感がない状態で大量の非常に食べやすい食べ物を急速に摂取する、調節不全の摂食パターンです。これは過食障害(BED)の核心的特徴であり、肥満や^{代謝機能障害}と強く関連しています^1,2。増え続ける証拠は、摂食行動の制御喪失における中縁系報酬回路の役割を強調しています^3,4。BEDは、報酬系系と実行制御系の間の異常なコミュニケーションが強迫的な食事を促す、皮質骨架菌シグナル伝達の変性障害としてますます概念化されています。神経生物学的レベルでは、中脳辺境経路内のドーパミン作動性シグナル伝達とグルタミン作動性入力が、インセンティブの顕著性変化と食べ^{やすい食べ物への}過剰な動機付けに寄与します^5,6。さらに、GLP-1、インスリン、グレリンなどの末梢代謝信号がこれらの回路と相互作用し、報酬評価や摂食行動を調節します⁷。最近の証拠はさらに、過食様行動がNAc内の神経動態の変化、特にデルタおよびシータ波域(2〜8Hz)での低周波振動と関連していることを示しています。^これらは制御喪失前の報酬期待や渇望状態と関連しています。

NAcは辺縁系、皮質系、運動系を結ぶ統合的なハブとして機能し、動機付けの信号を目標指向の行動に変換します。このシステムの乱れは、特に繰り返し食べられる食べ物に触れると、強迫的かつ習慣^{的な摂取パターン}を促^します。食べられる食べ物への断続的アクセスを用いる実験モデルは、過食様の過食を確実に誘発すると、NAcの活性化増加と関連しており、強迫的な摂食行動におけるその役割を支持しています(^11–14)。非侵襲的神経調節とは、経頭蓋磁気刺激のような磁場を用いたアプローチを含む、外科的介入なしに脳活動を変化させる技術を指します^。これらの戦略は、神経精神疾患における神経興奮性およびネットワーク活動の調節能力により臨床的関連性を得ています(^16,17)。人間では、神経調節が過食症状を軽減し、行動制御を改善し、代謝調節にも影響を与えることが示されています(^18,19)。

この証拠に基づき、全身磁気刺激(WB-MS)は強迫的な摂食に関与する回路を調節できる非侵襲的な治療アプローチを示している可能性があります。局所的技術とは異なり、低周波磁場は神経の興奮性や分散した脳ネットワークに影響を与える可能性があり、NAc⁸のような皮質下構造への影響の可能性を示唆しています。実験的研究により、これらの場はドーパミン作動性およびグルタミン作動性^{神経伝達6,7,8,19}を調節し、報酬関連回路に影響を与えるもっともらしいメカニズムを示しています。しかし、過食行動に与える影響はまだ不明です。したがって、本研究では、低頻度WM-MSの効果を、食べられる食品への断続的アクセスによって誘発される過食型マウスモデルにおいて、食物摂取量、体重、脂肪増加、NAcにおけるc-Fos発現を評価しました。

プロトコル

すべての手続きは、メキシコの実験動物飼育・使用に関する公式基準(NOM-062-ZOO-199)に準拠して実施され、メキシコ国立自治大学(UNAM)の実験動物飼育機関委員会(CICUAL)により、プロトコル番号035-CIC-2023に基づき承認されました。研究で使用されたすべての材料は 材料表に記載されています。

個体群の定義と取得

出生後30日目(P30)時点で合計30匹のC57BL/6マウス(メス9匹、オス21匹)を使用し、初期体重は15〜18gでした。マウスは個別に飼育環境条件のもとで飼育され、12時間12分の明暗サイクル(午前6時に照明を点灯)、周囲温度23±2°C、相対湿度70±10%の環境で飼育されました。

習慣化

P30では、動物たちは個別に自宅ケージに入れられ、水や標準的な食事は 自由 に提供されました。すべてのケージは段ボールの筒で環境に配慮し、寝床には木屑が使われていました。7日間の慣れ期間中、体重、食事量、水分摂取量は24時間ごとに記録されました。

過食的な摂取

本研究で用いられた実験モデル^{は、研究者}が説明した断続的な過食のパラダイムに基づいています。グループ割り当て前には、すべての動物を基準の変動を減らすために比較可能な平均体重(17g)に調整されました。動物(N=30)は、デジタルの「ホイール回し」ツールを使って無作為に実験グループに割り当てられ、個々の被験者がリストアップされ、順に3つのグループのいずれかに割り当てられました。標準グループには女性(標準女性グループ、SFG;n=3)と男性(標準男性グループSMG;n=7)が含まれ、標準的な食事と水を継続的に利用できていました。連続アクセス群には、女性(連続女性グループ、CFG;n=3)と男性(連続男性グループ、CMG;n=7)が含まれ、標準的な食事、水、食べられる食品(M&M)への継続的な 自由 アクセスが認められていました。間欠的アクセス群には、女性(間欠的女性グループ、IFG;n =3)および男性(間欠的男性グループ、IMG;n = 7)が含まれ、標準的な食事と水を 自由 に利用でき、週に3回(月曜、水曜、金曜)2時間(午後4時から6時)にわたり、食べられる食事が提供されました。これらの給餌条件は35日間維持されました。

全身磁気刺激(WB-MS)

この刺激パラダイムは、同様の実験条件下でC57BL/6マウスを用いた低周波電磁場(50Hz、1 mT)を用いた先行研究に基づいて選ばれました(^20,21)。WB-MSはパルス磁気療法装置(Dhan 1000、磁気治療ユニット)を用いて行われ、50 Hzで10ガウス(1 mT)の正弦波交流磁場を発生させました。刺激セッションでは、マウスは個別に自宅ケージに収容され、ケージの両側に2枚の電磁プレートが挟まれていました。磁場干渉を避けるため、ワイヤーケージ、グリッド、水筒などの金属部品は刺激時に一時的に取り外されました。この仕組みにより、動物は手続き中も拘束や追加のストレスなく自由に動くことができました。

実験の一貫性を確保するため、刺激セッションと非刺激セッションの両方で同一の取り扱いと環境条件を維持しました。コントロールセッション(15日目から21日目)では、磁気プレートは同じ位置に配置されましたが非活性化を保ち、取り扱い、ケージ操作、環境騒音、電磁プレートの配置などの影響を制御しました。

WB-MSは、実験プロトコルの22日目から28日目にかけて、午後3時40分から4時までの毎日20分間の曝露で構成され、過食的評価期間(午後4時から6時)直前に実施されました。29日目から35日目までは、マウスに再び刺激なしのセッションを与え、その後食事量を評価しました。

脂肪組織の収集

実験プロトコル終了時(36日目午前8時)、すべての実験群から脂肪組織が採取されました。SGはメス3頭とオス2頭(n = 5)、CGはメス3頭とオス3頭(n = 6)、IGはメス3頭とオス4頭(n = 7)で構成されていました。すべての動物はケタミン(60 mg/kg)およびキシラジン(5 mg/^kg)で麻酔され、足のつまみ刺激に対する侵害受容反応がなかったことから、十分な麻酔深度が確認されました。次に、No.3スメス刃を用いて腹側中央切開を行い、肋下、鼠径部、腹部正中部を貫通し、その後皮膚を優しく外側に引っ込めて腹腔を露出させました。

卵、腹膜後部、皮下脂肪組織のデポを慎重に特定し、解剖し、標本間変動を最小限に抑えるために標準化された条件下で切除しました。解剖直後、組織は校正された分析天秤(最大容量220g、可読性0.1mg)で計量され、製造元の仕様²³に従って事前に検証されました。すべてのサンプルは、実験の一貫性を確保するために、グループ間で同一の条件下で処理されました。

脳組織の調製と免疫蛍光

マウスは最後の^{食事摂取セッション}から90分後に安楽死させられました。心内灌流後に4%のパラホルマルデヒドを用いた脳を採取し、その後組織学的解析のために処理しました。冠状脳切片(30μm)は、−18°Cで維持され、アジドナトリウムを含むPBSに保存されて処理されるまで取得されました。各実験群からオス動物の一部が免疫蛍光解析のための脳組織準備に割り当てられました(SG, n = 4;CG、n = 4;残りの動物は脂肪組織の採取に使用されました。この差別的配分は、方法論的要件に基づいて事前に決定されました。なぜなら、パラホルマルデヒドを用いた心内灌流は、脂肪組織の完全性を破壊し、その後の脂肪組織採取と両立しない組織固定を引き起こすからです。したがって、サンプル分布は技術的制約のみによって決定され、実験群の割り当てや生物学的アウトカムとは独立していました。

c-Fos免疫蛍光法では、0.25%豚皮ゼラチンと0.5%トリトンX-100を含むPBSで希釈したマウスモノクローナル抗c-Fos抗体(1:1000、sc-166940)で切片を72時間インキュベートしました。PBSはブロッキングおよび透過性溶液として機能しました。一次抗体培養は室温で24時間、その後4°Cで48時間の培養が行われました。 インキュベーション後、切片をPBSで徹底的に洗浄し、同じ溶液で希釈したドンキー多クローナル抗マウス二次抗体(Alexa Fluor 488結合、1:500、AB_2338840)で2時間培養しました。最後に、セクションは取り付け媒体を使ってガラススライドに取り付けられました。

画像取得と定量化

共焦点イメージングは、488 nmレーザーと20倍対物レンズを搭載した顕微鏡を用いて行われました。Zスタック画像はNIS-Elements Cソフトウェアで取得され、盲解析のために符号化された識別子で保存されました。c-Fos陽性核の定量化はImageJ(ImageJ 2.9.0 / 1.53t)を用いて行われました。カウントには完全に閉じ込められた核のみが含まれ、個々の細胞の重複カウントを防ぐために四分円ベースのアプローチが適用されました。各動物に対して、すべての実験群で同一の取得パラメータを用いて、3つの独立した免疫染色切片からそれぞれ1枚の画像を取得しました。c-Fos陽性核の数は各画像ごとに個別に定量化され、同じ動物に対応する3つの区画から得られた値を合計しました。この総値は解析面積に正規化され、c-Fos密度(正の核/^mm2)として表されました。使用された実験手順の全体的な概略図は 図1A–Hに示されています。

図1:過食プロトコルおよびWB-MS介入の実験設計とタイムライン。 (A)は初期の飼育条件を示すマウスの代表画像を示します。合計30匹(メス9匹、オス21匹)が個別に自宅ケージに飼育され、P30から1週間の慣れ期間を経ました。(B)実験的1日目から35日目までの過食プロトコル全体で実施された食事条件を示しています。対照群は標準的な食事と水を 自由 に利用できました。継続的アクセスグループは、標準的な食事、水、そして食べられる食事を 自由 に利用できました。断続的なアクセスグループは、標準的な食事と水を 自由 に利用できました。同時に、食べられる食事は月曜、水曜、金曜の午後4時から6時までのみ提供されていました(C)。これは、15日目から21日目まで動物は同じ食事条件下で行われ、ケージの下に磁気刺激プレートが置かれ、刺激を与えなかった(偽曝露)ことを示しています。(D)は、22日目から28日目まで、WB-MSを摂取可能な食物曝露の20分前に投与し、各グループの対応する食事条件を維持したことを示しています。(E)は29日目から35日目までWB-MSが中止されたことを示しますが、食事条件は変わりませんでした。(F)は出生後72日目(P72)に脳が採取され、その後73日目に脂肪組織が採取されたことを示しています(P73)。(G)はクリオスタットを用いた脳切片と免疫組織化学的手法を示しています。最後に、(H)はc-Fos免疫反応性の共焦点顕微鏡解析を示しています。画像は著者によってBiorenderを使用して作成され、適切なライセンスが取得されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

統計解析

統計解析はSPSSバージョン25を用いて実施されました。正規分布を仮定できなかったため、研究全体を通じてノンパラメトリック検定が使用されました。SG、CG、IGの差はKruskal–Wallis検定を用いて評価されました。各実験群内での繰り返し比較をフリードマン検定で分析し、適切な場合は多重比較検定を行った。特定の実験的評価項目、特にメスではサンプル数が限られていたため(グループあたりn=3)、オスおよびメスのC57BL/6マウスのデータをプールして図 2、 図3、 図4 に示す分析を行い、統計的堅牢性を高め、実験結果の探索的評価を支援しました。さらに、雄と雌のC57BL/6マウスの過食様摂取データを統合し、両方向ANOVAと複数比較検定を用いて、WB-MS刺激週を含む給餌プロトコル全体の実験群および時間の効果を評価しました。統計的有意なのは p ≤ 0.05と定義されました。

結果

過食期間中、間欠的アクセス群(男性はIMG、女性はIFG)の被験者は、標準群(SFGおよびSMG)および連続群(CFGおよびCMG)の被験者よりも15日目、17日目、19日目に有意に高いカロリー摂取を示しました(Kruskal-Wallisテスト; p < 0.05; 図2A–B)。WB-MSは、1mTの強度と50Hzの周波数で、7日間連続で1日20分、グレーバンドで示されました。この刺激段階では、刺激後26日目にカロリー摂取量の著しい減少傾向が検出されました(Kruskal-Wallis検定:IFG、 p = 0.5510;IMG, p = 0.1683)は、その効果が持続しなかったことを示しています。重要なのは、両群とも29日目、31日目、33日目に過食様摂取が再出現したこと(Kruskal-Wallisテスト; p < 0.05)であり、WB-MSによって誘発される行動調節が一時的であることを示唆して...

ディスカッション

本研究結果は、WB-MSがマウスモデルにおいて、食べられる食べ物への断続的アクセスによって誘導される過食行動を一時的に調節する可能性を示唆しています。NAcでは神経活動に有意な変化は検出されませんでしたが、刺激期間中の断続的なアクセスセッションを通じて、食べやすい食事量は徐々に減少し、最終的な過食セッションで有意な減少が見られました。これらの観察は、磁気刺激が強迫的な摂食行動の基盤となる強化や動機付けに影響を与える可能性を示唆しています。しかし、本研究はこれらの効果の神経メカニズムを直接的に特徴づけることを目的とせず、過食関連疾患に対する補完的な神経調節アプローチとしてWB-MSの実験的探求を拡大することを目的としています。

これらの観察は、非侵襲的な脳刺激アプローチが肥満や摂食関連障害において、食べやすい食物関連のサインに対する反応性を減衰させる可能性があるという以前の報告と一致しています(^20,21

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ImageJ	imagej.net	Public Domain, BSD-2	Software. Javaベースの画像処理プログラム。米国国立衛生研究所と光学・計算機器研究所（LOCI、ウィスコンシン大学）で開発
Coverslips	Corning	2935	カバーガラス 24 x 50 mm（厚さ 0.13–0.17）
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	ドナーポリクローナル抗マウス二次抗体
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	標準食品。 https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	日常的な組織学用の凍結切片機。
M&Ms 43.8g (Brown packaging)	M&M´s	NA	食べやすい食べ物。100gあたりの栄養価：480 kcal、19gの脂肪、70gの炭水化物、5.1gのタンパク質、0.13gの塩成分：砂糖、ココアマス、脱脂粉乳、ココアバター、ラクトース、でんぷん、乳脂肪、パーム脂肪、グルコースシロップ、シア脂、安定剤（ガムアラビック）、デクストリ、グレイジング剤（蜜蝋、カルナウバロウ）、色素（E100、カルミン、E132、E133、E150a、E150c、E150d、E153、E160a、E160e、E162、E163、E170）、ビートルート濃縮物、乳化剤（大豆レシチン、E445）、塩、香料、パームカーネルオイル、酸化防止剤（E306）。（落花生、ヘーゼルナッツ、アーモンドを含む場合があります）。ミルクチョコレートは、少なくとも14%のミルク固形物を含んでいます。ミルクチョコレートは、ココアバターの他に植物性脂肪を含んでいます。
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	パルス磁気療法装置
PBS	MEYER	Monobasic 2415. Dibasic 2410.  NaCl S3014	リン酸ナトリウム一水和物。リン酸ナトリウム七水和物。 結晶塩化ナトリウム分子生物学グレード。
Nikon Microscope	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	共焦点顕微鏡
Polycarbonate mice cage	Orchid Scientific	EM01	WB-MS露出用に使用される非磁性ポリカーボネートケージ、完全に透明でオートクレーブ可能（373 x 190 x 138 mm）。
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	ケタミン注射液
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	キシラジン注射液
c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	マウスモノクローナル抗c-Fos抗体
Laboratory balance	Sartorius		分析用天びん
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10	抗褪色マウンティング液は、蛍光免疫染色（IF）顕微鏡で蛍光信号を保護し、光分解を最小限に抑えるように特別に調合されています。
Glass slides	VELAB	VE-P30	片面フロスト処理された顕微鏡ガラススライド 26 x 76 mm（厚さ 0.8–1.1 mm）
Sodium azide		K 6048.0100	99% のナトリウムアジド