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方法論記事

骨折後のICG近赤外線イメージングおよび超音波を用いたリンパ管排膿の評価

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DOI:

10.3791/70466

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2026年6月23日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Shanghai Pudong New Area Hospital of Chinese Traditional Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、インドシアニングリーン(ICG)近赤外線画像と超音波を組み合わせて、マウスの足底ICGクリアランスおよび膝窩リンパ節の腫大を定量化することで、骨折後のリンパ排液を評価します。

要約

外傷性骨折はしばしばリンパ管排出機能の障害を伴います。骨折後のリンパ管排出の減少とリンパ節の肥大は、急性炎症反応と免疫細胞の動的プロセスが継続していることを示しています。本記事では、偽手術または脛骨骨折手術を受けるマウスの足底領域に0.2 mg/mLのインドシアニングリーン6 μLを皮内注射する方法を説明しています。近赤外蛍光イメージングにより、0時間および24時間の足底ICG信号を定量化し、マウスリンパ管排出の読み取りとして24時間のクリアランス率を算出しました。同時に超音波を用いて、膝窩リンパ節(PLN)の3D再構築、体積比較、骨折による拡大の評価を行いました。 結果は、骨折後リンパ除去率が有意に低下し、足底領域におけるICGの蛍光強度が著しく高まり、PLNsの容積が有意に拡大していることを示しました。 従来のリンパ系測定方法(組織病理学的切片やリンパシンチグラフィーなど)は、生 体内での動的かつ連続的な観察に失敗することが多いのに対し、この方法は高い安定性と再現性を示しています。特に、動 的なin vivo モニタリングを可能にする。これにより、骨折モデルにおけるリンパ逆流の変化を調べるための強力な技術的支援を提供する。

概要

外傷性骨折はしばしば重大な組織損傷や腫れを引き起こし、感染、壊死、骨の非癒合などの合併症のリスクを高めます1,2。Grzegorz Szczesnyらは、リンパ管排尿障害が組織浮腫を引き起こすことが治癒遅延と関連していることを示しました。研究によれば、骨折治癒過程では骨組織の修復に加え、骨折部位のリンパ系も重要な役割を果たしています。リンパ管は間質液の排出や腫れの予防だけでなく、免疫細胞の移動や代謝老廃物の除去も担っています。しかし、骨折初期段階では、TNF-α、IL-1、IL-6、マクロファージコロニー刺激因子(MCSF)などの炎症促進因子がリンパ内皮細胞を損傷し、変性、浮腫、線維化などの病理的変化を引き起こす可能性があります。関連する研究では、骨や骨膜、周囲の脂肪組織や筋肉組織にリンパ内皮細胞が存在していることが示されています。さらに、リンパ管排出は骨折後の血腫の微小環境の調節にも関与しています。効果的なリンパ排出は骨芽細胞の生存と骨髄間葉幹細胞(BMSC)の増殖を促進します7。骨折時には、損傷部位の免疫細胞が産生する炎症促進因子(TNF-α、IL-1、IL-6)および成長因子(TGFβ1およびPDGF)が、骨芽細胞アポトーシスおよびBMSC増殖の重要な調節因子8。ヒュセイン・アルスランらの研究者は、リンパ浮腫が骨芽細胞に悪影響を及ぼすことを確認しています。これらの研究結果は、骨折治癒におけるリンパ管排流の重要な役割を強調しています。ICG近赤外線(NIR)蛍光イメージングの最近の進展により、動物モデルおよびヒトの両方におけるリンパ流動態の非侵襲的リアルタイム観測が可能になりました。この技術により、リンパ管の収縮率、排出速度、経路の完全性を定量的に評価できます10,11。関節炎と炎症のマウスモデルを用いた研究では、ICG-NIR画像診断が急性と慢性リンパ応答を区別できることが示されており、組織損傷と回復中の異なる排液パターンが浮き彫りになりました。さらに、NIRリンパ画像診断は手動リンパドレン後の機能回復のモニタリングやリンパ標的治療の有効性評価にも有効であることが示されています。超音波検査は、ドレーンリンパ節の形態や容積、さらにリンパドレクターの障害に伴う組織浮腫を評価するための補完的な定量的手法を提供します。近紫外線蛍光イメージングと超音波の統合により、リンパ機能と解剖学的変化を同時に評価でき、生体内でのリンパ動態の多様態調査を可能にします。リンパ機能障害が心的外傷後治癒における重要な役割が認識されているにもかかわらず、骨折後のリンパ排液を評価する標準化かつ再現性の高い方法は依然として不足しています。現在の多くの画像診断方法は侵襲的であったり、十分な空間分解能を欠いたり、リンパ流を動的に監視できなかったりします。したがって、ICG-NIRと超音波画像診断を組み合わせたプロトコルの開発は、この方法論的欠点を補い、リンパの回復と骨修復への貢献を評価する効果的なツールを提供すると期待されています。

本研究は、マウスの脛骨骨折後のリンパ排流を評価するために、ICG-NIR蛍光画像法と高分解能超音波を組み合わせた革新的な枠組みを提示します。このアプローチにより、排膿効率の半定量的解析が可能となり、骨折治癒過程におけるリンパ節の容積を測定できます。しかし、いくつかの制限もあります。まず、ICG-NIRは主に表層リンパ管の評価に用いられ、より深い構造の画像化能力は限られています。第二に、リンパ節の容積の変化は一定の情報を提供しますが、特異性に欠け、直接的な機能的測定を完全に置き換えることはできません。この方法論は大きな翻訳効果を持ち、骨再生におけるリンパ機能の理解を深めます。

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プロトコル

これらの動物実験は上海モデル生物センターの動物管理・利用委員会(承認番号)によって承認されました。NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03)。本研究では骨折モデルを持つC57オスマウス(生後6〜8週)を用いました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 術前ケア

  1. ネズミを少なくとも1週間は自由に慣らしてください 。 食べ物と水へのアクセスも確保してください。コンピュータ生成のランダム化リストを使って、動物を骨折または偽グループにランダムに割り当てます。
  2. マウスを動物用温熱パッドの上に置き、温度を37°Cに一定に保ちます。
  3. ガス麻酔装置を起動し、マウスを誘導室に2%〜3%のイソフルランで5分間置きます。
  4. 誘導後は1%–2%イソフルランに切り替え、手術終了まで鼻のコーン による 麻酔を維持します。

2. 実験的手続き

注:麻酔設定、ICG用量と量、注射部位と深さ、曝露時間、ROI定義、超音波スキャンパラメータをすべてのセッションで標準化し、動物間変動を最小限に抑えてください。

  1. 近紅外・ICGイメージング
    注:ICG近赤外線イメージングのステップバイステップ手順は 図1に示されています。
    1. インドシアニングリーン(ICG)0.2mgを重量し、1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移し、1mLのPBSに溶かして0.2 mg/mLのICG溶液を準備します。光から守るためにアルミホイルでチューブを包みます。
    2. イメージングシステムを起動し、FluoBeam v1.46を開いてください。カメラの高さは必要に応じて調整してください。
    3. 綿棒を75%エタノールで湿らせ、モデルした後ろ足の足底面を消毒します。
    4. 10μLのマイクロシリンジを使い、ICG溶液6μLを吸引します。針を足底面に約1mm挿入し、一定の速度で溶液を注入し、全量を届けるまで注ぎます。
    5. ソフトウェアで「カメラ」と「レーザー」機能の両方を有効にしてください。「modify」をクリックして新しいフォルダを作成し、それをセーブディレクトリに設定してください。画像取得時の露出時間は0時間と24時間で同じに保ちましょう。
    6. マウスをカメラの下に伏せ、後肢を視野の中央に置きます。モデル化された後肢が視野の中心にあることを確認してください。
    7. 露光時間を30msに設定し、0時間と24時間の画像の両方で同じように保ちます。注射後0時間および24時間の同じ足底注射ROIの画像を取得し、ICG信号強度を測定します。露光時間は0時間と24時間で同じように保ちましょう。
    8. 後肢のリンパ管が視野に明確に見えたら、「写真」をクリックして画像を撮影してください。
    9. 画像取得後、データをエクスポートし、画像解析ソフトウェアを使って0時間および24時間の蛍光強度を定量化し、蛍光クリアランス率を計算します。
    10. 画像解析ソフトを開いてください。
    11. 「 ファイル→を開く」をクリックして蛍光画像を取り込み、同じ動物と同じ検査日に対応する0時足底画像を開き(その後、24時間の一致画像を開きます)。
    12. 楕円を選択し、次に 「選択→編集」→「指定」をクリックします。Width= 30 、 Height=30を設定し、 楕円を選択して OKをクリックします。
    13. 円を背景の部分の上に置きます。
    14. 「Analyze → Measure」をクリックし、結果ウィンドウに平均値を0時間背景時の蛍光強度(FI0hbg)として記録します。
    15. ターゲット観測地点の上に円を置き、「 分析→測定」をクリックし、結果ウィンドウに平均値をFI0hとして記録します。
    16. 0時間時における補正蛍光強度を、補正後FI0h = FI0h − FI0hbgとして計算します。
    17. マッチングされた24時間画像を開き、ステップ3〜7を繰り返して補正FI24hを取得します。
    18. 背景補正蛍光強度を用いてクリアランス率を計算します:クリアランス率 = [(FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%。
  2. Bモード超音波検査
    注:超音波画像診断およびリンパ節の識別の段階的な手順は以下の通りです。 図2.
    1. 超音波システムを起動し、トランスデューサーを接続し、後肢がはっきり見えるようにマウスの位置を調整します。連続麻酔下で、マウスを画像撮影台の伏せ位置に置き、頭部はオペレーターから離れ、尾はオペレーターの方を向きます。膝を屈曲させて膝窩が上向きかつやや外側に向くようにし、トランスデューサーを膝窩のくぼみの上に位置させます。
    2. モデル化された後肢に超音波結合ジェルを塗布します。
    3. トランスデューサーを回転させ、その角度が後肢の縦軸に平行になるようにします。
    4. スキャン距離を4mm、ステップサイズを0.04mmに設定します。画像上の膝窩リンパ節を解剖学的な位置から特定します。
    5. 尾と後ろ肢を両手で持ってネズミを安定させます。トランスデューサーがスキャンしている間は動物を動かさないでください。
    6. 画像を取得しましょう。膝窩リンパ節は、小さな楕円形またはやや豆型の結節で、エコージェニシティは中間から低めで、周囲の脂肪よりやや低く、隣接する暗色の縞模様筋と明確に区別されます。
    7. 画像を3D再構成ソフトウェアにエクスポートし、3D画像処理を行います。
    8. 超音波イメージングシステムコンソールで3Dスキャンを終えた後、スキャンを3Dデータセットとして保存し、動物識別番号、グループコード、時刻(0時間/24時間)を記録します。
    9. 取得コンソールから解析コンピュータへ生データをエクスポートし、元のフォルダ構造は変更せずに行います。可能な限り、各動物ごとに1つのフォルダを使い、各時間点で使いましょう。
    10. 3D再構築ソフトを開きます。
    11. 「Study」をクリックしてモジュールを入力し、「インポート」を選択します。
    12. データフォルダをクリックし、インポートするデータを確認し、ダブルクリックで開いてください。
    13. 表示モードでは、「画像処理」→「3Dにロード」→「横視」→「体積測定」→「スタート」を選択してください。
    14. スライスの向きやステップパラメータ(「ボクセル/間隔」)が取得設定と整合しているか確認してください。
    15. マウスホイールやスライススライダーを使って近位端から遠位端へスクロールし、PLNが最初に現れるスライスを特定します(通常は楕円形または豆型の構造で、周囲の脂肪に比べてやや低エコーで、比較的明確な境界があります)。
    16. PLNが最初に現れるスライスを左クリックして輪郭をトレースし始めます。
    17. リンパ節の縁に沿って、できるだけ外包に近づけ、周囲の脂肪や血管腔の侵入を避けながら、閉まった輪郭線を一点ずつ描いてください。
    18. マウスホイールを使ってPLNの最大断面積を示すスライスに移動し、ステップ10を繰り返して2つ目の輪郭を完成させます。
    19. マウスホイールを使ってPLNが消える直前のスライスに移動し、ステップ10を繰り返して3つ目の輪郭を完成させます。
    20. 「Finish」をクリックすると3D分割体積を生成し、体積測定値を出力します。
    21. 結果パネルにPLNボリューム(mm3)を記録してください。
    22. 測定結果パネルで「エクスポート」を選択し、結果を.csvまたは.xlsファイルとしてエクスポートしてください。
    23. ファイルタイプを選択し、画像をTIFF画像エリア(.tif)としてエクスポートしてください。
    24. 解析中は動物コードと時刻のみを表示し、グループ割り当て(骨折/偽)は表示せず、すべての体積抽出が完了し、統計解析のためにグループが解読されるまでブラインドを維持します。
  3. 統計解析ソフトウェアを用いた統計解析
    1. 「新しいテーブル&グラフ」を選択し、「グループ化」を選択します。
    2. データ入力フォーマットを「入力」に設定します。複製値をサブカラムに積み重ねます。
    3. 1 / 7 / 14 と Sham / Fractureの生値を入力します。-グラフを開きます。
    4. グラフタイプを散乱(個別値)+平均+誤差バーに変更してください。
    5. 軸のフォーマット:Y軸を設定し、軸のタイトルを変更します。
    6. 「 解析 」をクリックして双方向のANOVAを行ってください。
    7. 各時点でシャムとフラクチャーを比較してください。
    8. 有意性の結果をグラフに追加します。

3. 術後ケア

  1. 実験の最後に、マウスを温熱パッドの上に置き、麻酔から回復させます。
  2. 状態を注意深く観察し、異常がなければケージに戻して引き続き飼育してください。

4. 評価

注意:グループ割り当ての盲検をした研究者に画像取得および定量解析を行い、統計解析が完了するまですべてのデータセットを符号化しておくこと。

  1. 近紅外・ICGイメージング
    1. マウスの足パッドから収集したICG画像の蛍光強度を相対的に定量的に解析するために画像解析ソフトを用いましょう。
      注:マウスフットパッドにおけるICGのクリアランス率の計算式は以下の通りです:
      クリア率(%) = [(FI0h – FI24h) / (FI0h)] × 100%
    2. 同じ方法で各測定のクリアランス率を記録し、統計解析ソフトを使ってリンパクリアランス率と時間の関係を分析します。
  2. Bモード超音波検査
    1. 3D再構成ソフトウェアを用いてBモードおよび三次元画像を解析し、PLNの体積を決定します。
    2. 統計解析ソフトウェアを使って散布図を作成し、リンパ管排水とリンパ節容積の変化を時間とともに評価します。
  3. 統計解析
    1. 1日目、7日目、14日目に得られた反復測定値を二方向反復測定分析を用いて解析します。

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結果

骨折モデル確立後1日目、7日目、14日目に、骨折群の24時間足底ICG蛍光強度(FI24h)が偽手術群よりも一貫して高かった(図3)。収集された足底画像からのICG蛍光強度の比較的定量解析では、骨折群のリンパICGクリアランス率が偽手術群よりも有意に低いことが示されました(p < 0.05)(図4)。一方、3次元Bモード超音波検査では、骨折群マウスの膝窩リンパ節容積が1日目、7日目、14日目に対照群より有意に多かったことが明らかになりました(p < 0.05)(図5)。これらの結果は、リンパ節クリアランス率とリンパ節腫大の間に高い相関があることを示しました。

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ディスカッション

このプロトコルには見落とされがちな詳細がいくつか含まれています。例えば、露光時間は固定されておらず、特定の蛍光強度に基づいて決定しなければなりません。しかし、同じマウス群の0時間と24時間の曝露時間は一定でなければなりません。そうでなければ、結果が信頼できない可能性があります。超音波で観察を行う際は、マウスの下肢に結合剤を完全に覆うことが重要です。露出した部分はプローブがスキャンした際に画像に歪みを引き起こすためです。スキャン中は、ネズミの下肢は動かずにいるべきです。操作者は片手で下肢を優しく引っ張り、もう一方の手で尾を握ることでネズミを安定させることができます。このステップは特に困難ですが、正確な超音波検査のためには非常に重要です。

ICG-NIRや超音波は様々な研究や臨床の場で広く使われていますが、観察される特定の指標によってパラメータが異なることに注意が必要です12,13。ICG-NIRはリン...

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

本研究は、国家自然科学基金(82174407 YJZ)、上海浦東新区衛生委員会の分野リーダー養成プログラム(PWRd2020-05)、浦東新地区衛生委員会分野リーダープロジェクト(PWRq2020-56)、および深圳の三明医学プロジェクト(No.SZZYSM202311006)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10マイクロリットルマイクロシリンジHamilton Company80330/00Hamilton 80330/00マイクロシリンジは、10figure-materials-1Lの容量を持つ精密機器で、26sゲージの針、51mmの長さ、およびポイントスタイル2を特徴としています。クロマトグラフィー、サンプル注入、分析化学アプリケーションで小容量を正確に投与するために設計されています。
3D超音波Vevo 3100イメージングシステムVevo 2100Vevo 2100は、小動物のリアルタイム3D可視化を提供する、プレクリニカル研究用の高周波超音波イメージングシステムです。心血管、腫瘍学、発達生物学の研究に優れた解像度を提供し、Vevo LABソフトウェアと統合されています。
75%エタノール上海タイタンサイエンティフィック株式会社G73537O75%エタノールは、実験室で表面滅菌、機器清掃、および防腐に広く使用される消毒溶液です。タンパク質変性を介して細菌、ウイルス、および真菌を効果的に殺傷し、生物学的および臨床設定で一般的に適用されます。
綿棒河北康吉医療機器株式会社20250303綿棒は、医療、診断、および実験室手順で正確なサンプル採取、溶液の適用、または清掃に使用される滅菌された吸収性アプリケータです。衛生的な取り扱いのために木製またはプラスチック製の棒に綿の先端が付いています。
カップリング剤天津金雅技術開発株式会社20241029カップリング剤、一般に超音波ゲルとして知られる、超音波トランスデューサと皮膚の間の音響伝達を向上させるために使用される水性媒体です。空気泡を除去して明瞭な画像を可能にし、非刺激性で、医療および診断用途に250mLの容器で供給されます。
Graphpad PrismGraphPadソフトウェアPrism 10データ分析、可視化、およびプレゼンテーションに使用される科学的なグラフ作成および統計分析ソフトウェア。
Image J米国国立衛生研究所ImageJ 1.54d生物学および医療画像分析に広く使用される、Javaベースのパブリックドメイン画像処理および分析プログラム。
インドシアニングリーン丹東易創製薬株式会社8305128インドシアニングリーンは、心臓出力、肝機能、肝血流、および眼科血管造影を決定するために使用される水溶性アニオン染料です。静脈内投与用に25mgのバイアルで供給され、イメージング目的で近赤外スペクトルで蛍光を示します。
イソフルランRWDR650-IEイソフルランは吸入性全身麻酔薬です。血液/ガス分配係数が小さいです。動物麻酔に使用されると、滑らかに、迅速に、快適に麻酔を誘導でき、回復が早く、筋弛緩が良好で、交感神経系に対する興奮作用はありません。イソフルランの肝臓での代謝速度が低いため、肝毒性が少なく、繰り返し使用しても明らかな副作用はありません。麻酔廃ガスの環境および実験室作業員への悪影響を避けるために、ガス回収システムと一緒に使用することをお勧めします。
マイクロバランス上海精密科学機器株式会社FA1004BFA1004Bマイクロバランスは、小サンプルの正確な計量用に設計された高精度分析機器で、0.0001gまでの読み取り精度を提供し、研究および品質管理に正確な測定が必要な実験室アプリケーションに適しています。
近赤外イメージングシステムオリンパスMVX10オリンパスMVX10は、近赤外イメージングに最適化されたマクロズーム蛍光顕微鏡システムです。幅広いズーム範囲で大型標本の高い解像度の可視化を提供し、深部組織の浸透のための高度な光学、および生物学および材料研究における蛍光技術との互換性を提供します。
Vevo labVevo LABVevoイメージングデータの分析に使用されるイメージング解析ソフトウェアパッケージで、測定、計算、およびレポート生成が含まれます。

参考文献

  1. Zhang, S., Sheng, H., Xu, B., Lao, Y. Acute external iliac artery thrombosis following pelvic fractures: Two case reports. Medicine (Baltimore). 100 (6), e24710(2021).
  2. Szczesny, G., Olszewski, W. L., Gewartowska, M., Zaleska, M., Gorecki, A. The healing of tibial fracture and response of the local lymphatic system. J Trauma. 63 (4), 849-854 (2007).
  3. Zheng, Y., et al. A novel therapy for fracture healing by increasing lymphatic drainage. J Orthop Translat. 45, 66-74 (2024).
  4. Thomas, C., Le, J. T., Benson, E. Managing lymphedema in fracture care: Current concepts and treatment principles. J Am Acad Orthop Surg. 28 (18), 737-741 (2020).
  5. Jiang, X., Nicolls, M. R., Tian, W., Rockson, S. G. Lymphatic dysfunction, leukotrienes, and lymphedema. Annu Rev Physiol. 80, 49-70 (2018).
  6. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397.e24 (2023).
  7. Dimitriou, R., Tsiridis, E., Giannoudis, P. V. Current concepts of molecular aspects of bone healing. Injury. 36 (12), 1392-1404 (2005).
  8. Arslan, H., et al. Effect of lymphedema on the recovery of fractures. J Orthop Sci. 12 (6), 578-584 (2007).
  9. Cheon, H., Kim, S. A., Kim, B., Jeon, J. Y. Investigation of optimizing indocyanine green solution for in vivo lymphatic research using near-infrared fluorescence indocyanine green lymphangiography. Sci Rep. 13 (1), 14966(2023).
  10. Polomska, A. K., et al. Minimally invasive method for the point-of-care quantification of lymphatic vessel function. JCI Insight. 4 (4), e126515(2019).
  11. Wang, F., Weng, Y., Geng, J., Zhu, J. A narrative review of indocyanine green near-infrared fluorescence imaging technique: A new application in thoracic surgery. Curr Challenges Thorac Surg. 3, 35-35 (2021).
  12. Zheng, Y., et al. Lymphatic platelet thrombosis limits bone repair by precluding lymphatic transporting damps. Nat Commun. 16 (1), 829(2025).
  13. Kim, K. M., Kim, K. Y. Lymphangiogenesis after nonvascularized lymph node transplantation: Lymphangiographic findings in mice and minipigs. PLoS One. 18 (12), e0295836(2023).
  14. Zhang, P. H., et al. Efficient pulmonary lymphatic drainage is necessary for inflammation resolution in ARDS. JCI Insight. 9 (1), e173440(2024).
  15. Kenney, H. M., et al. Persistent popliteal lymphatic muscle cell coverage defects despite amelioration of arthritis and recovery of popliteal lymphatic vessel function in TNF-TG mice following anti-TNF therapy. Sci Rep. 12 (1), 12751(2022).

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