急性呼吸困難症候群のラットモデルにおける肺組織の単細胞RNAシーケンス

サマリー

本記事は、急性呼吸困難症候群(ARDS)ラットモデルにおける肺組織の単細胞RNAシーケンス(scRNA-seq)解析の標準化されたプロトコルを提示します。LPS誘導モデルの確立からバイオインフォマティクス解析までのステップを詳述し、21の細胞クラスターと6のマクロファージサブポピュレーションを特定し、ARDSの病因に関与する主要な炎症経路を明らかにしています。

要約

急性呼吸困難症候群(ARDS)は、免疫応答の調節不全と肺胞損傷を特徴とする高い死亡率を持つ重篤な炎症性肺疾患ですが、その細胞の多様性は完全には解明されていません。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は、細胞型特異的なメカニズムを解析する前例のない解像度を提供しますが、ARDSでの応用は技術的なばらつきにより制限されています。ここでは、リポ多糖(LPS)誘導ラットARDSモデルにおける肺組織のscRNA-seq解析の標準化されたプロトコルを提示します。この手法には、最適化された組織解離、厳格な品質管理、二重線除去、バッチ効果補正、クラスタリング、注釈、差異発現解析のための包括的なバイオインフォマティックパイプラインが含まれます。私たちのアプローチは、21の異なる細胞集団を確実に同定し、ARDSにおいて独自の転写署名を持つ6つのマクロファージ/単球サブポピュラーを明らかにします。サブクラスター特異的差異遺伝子発現および機能豊化解析により、ARDSの病因の主要な遺伝子と経路がさらに特定されました。この再現可能なワークフローにより、細胞多様性、炎症経路、候補治療標的の詳細な特徴付けが可能となり、ARDSにおける機構的およびトランスレーショナル研究の強固な基盤を提供します。

概要

急性呼吸困難症候群(ARDS)は、びまん性肺の炎症と非心原性肺水腫を特徴とする急性呼吸器疾患であり、主に進行性低酸素血症と^呼吸不全として現れます。ARDSの病理的メカニズムには、炎症カスケードの調節不全、肺胞毛細血管の障害、複数の免疫細胞の異常な活性化および相互作用が含まれます^3,4。ARDSの進行中、肺組織内の免疫細胞は炎症メディエーターの分泌や免疫応答の調節を通じて炎症カスケードを駆動し、肺内皮を乱し、外因性凝固カスケードの活性化を引き起こし、肺損傷を悪化^{させます。}しかし、ARDSにおける細胞レベルの病理メカニズムに関する現在の理解は限られており、特定の薬理学的治療の開発を制限しています。現在の管理戦略は主に酸素サポートや人工呼吸の様々なモダリティで構成されています^。ARDSの病原における細胞の異質性と動的変化の詳細な特徴付けは、新規治療標的の特定や新たな治療戦略の開発において極めて^{重要です。}

単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)技術の登場は、RNAシーケンシング研究に画期的な突破口をもたらし、疾患の病因における細胞の異質性と機能的動態を解析できるようになりました^11,12。従来のバルクRNAシーケンシングと比較して、scRNA-seq技術は希少だが重要な細胞サブポピュレーションを特定し、細胞状態遷移の動的プロセスを明らかにし、複雑な細胞間相互作用ネットワークを発見できます。これらの情報は集団レベルでの解析ではしばしば隠されがちです(13,14,15)。ARDSにおける最近のscRNA-seq研究は、特定の単球遺伝子発現シグネチャーの同定、異常なマクロファージ分極パターンの発見、そして前線維化細胞間通信ネットワークの解明など、重要な進展を遂げています。.これらの発見は、ARDSの病態生理学的メカニズムの理解を深めるだけでなく、バイオマーカーの発生、疾患の層化、精密治療に関する新たな知見も提供します^20,21。

しかし、現在のARDSのscRNA-seq研究は、方法論的標準化の不十分さ、サンプル処理プロトコルの大きな違い、そして研究結果や臨床応用の再現性を制限する不整合なデータ解析パイプラインなどの課題に直面しています(^22,23)。本プロトコルは、組織処理、品質管理、データ解析の手順を最適化することで、ARDS肺組織のscRNA-seq解析に伴う技術的課題に対応し、メカニズム的研究と治療開発の基盤を提供します。標準化されたアプローチにより、異なる研究室間での再現性が保証され、細胞異質性に関するARDS研究における比較研究が容易になります。

プロトコル

生後6〜7週、体重220g±10gの特定病原体フリー(SPF)オスSprague-Dawley(SD)ラット12頭が北京バイタルリバー実験動物技術有限公司から購入されました(動物ライセンス番号:SCXK (Jing) 2025-0008)。これらのラットは、中国国家実験動物標準化技術委員会発行の国家標準「環境・居住施設の実験動物要件」(GB 14925-2010)に準拠して、北京中医薬大学東直門病院の実験動物センターに収容されました。実験手順は北京中医薬大学東直門病院動物福祉倫理委員会の承認を受けました(承認番号:24-54)。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. モデルの確立とサンプル採取

注意:実験前に、すべてのラットに1週間の順応期間を設け、ストレスによる影響を最小限に抑えてください。

1. 大腸菌リポ多糖(LPS)を0.9%の生理食塩水に溶かし、0.4 mg/mLのLPS溶液を得ます。
2. SPFオスのスプラグ・ドーリー(SD)ラット12匹をランダムに2つのグループに分けます:対照群(n=6)とARDSモデル群(n=6)です。
3. 対照群に0.5mL/体重100g の投与量 で0.9%の生理食塩水を気管内注射で投与します。
4. 0.4 mg/mLのLPS溶液を同じ量(0.5 mL/100g)で気管内注射 で ARDSモデル群に投与し、16時間後にイソフルランで麻酔を行います(機関承認プロトコルに従い)。
5. 腹部大動脈 から 血液を採取し、遠心分離機(4°C、1000 × g、30分)で血清を採取します。
6. 胸腔を開けて肺組織を摘出してください。
7. 気管支切断部からシリンジを用いて気管支肺槽洗浄液(BALF)を採取します^24,25。
8. 右肺葉を採取し、PBSで洗浄して次の病理検査を行います。
9. 左肺葉を採取し、PBSで洗浄し、その後の単一細胞シーケンシングおよび分子生物学実験を行う^26,27。

2. 肺組織の組織病理学的評価

1. 採取したラットの右肺組織を4%パラホルムアルデヒドに浸し、12時間固定します。
2. 固定後、エタノール(70%、80%、90%、95%、100%、100%)で脱水し、各濃度で2時間ずつ脱水します。
3. 脱水組織をキシレンで処理し、透明になるまで処理します。
4. 透明な組織に溶融パラフィンを浸透させ、60°Cのオーブンで2時間浸透させます。
5. 浸透した組織ブロックを埋め込み型に入れ、新しいパラフィンを注ぎ込み、冷やして固まらせてパラフィンブロックにします。
6. マイクロトームでパラフィンブロックを厚さ4μmのスライスに切り分け、45°Cの水浴で切片を広げ、ポリL-リジン被覆スライドで拾い上げます。
7. スライドを60°Cのオーブンで焼き、セクションがスライドにしっかり密着するようにします。
8. 切断をキシレンに浸して脱水し、エタノールの降下勾配(100%、95%、90%、80%、70%)で再水和します。
9. 切片をPBSで洗い流し、ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色を行い、カバースリップを中性樹脂で取り付けます。
10. 好中球浸潤、間質性炎症、浮腫、うっ血に基づく標準化されたスコアリングシステムを用いて、全スライドスキャン断片の肺損傷を評価します。
    注:各パラメータは病理学的関与の程度に基づいて0から4のスコアが付けられました:0(なし);1人(≤25%);2 (26-50%);3 (51-75%);4(>75%)^28,29。

3. 酵素結合免疫吸着アッセイ

注意:取得直後に分析ができない場合、サンプルは-80°Cで維持されることがあります。

1. 標準を溶かし、室温で15分間置き、製造元の指示に従って連続希釈を行います。
2. マニュアルの指示通り、ビオチン化抗体作動液、酵素共役作動液、洗浄バッファーを準備してください。
3. 各サンプル100μLまたは連続希釈標準100μLを抗体被覆ウェルに加え、37°Cで90分間インキュベートします。
4. プレートを4回洗い、ビオチニル化抗体作動液100μLを加え、37°Cで30分間培養します。
5. プレートを4回洗浄し、酵素共役作液100μLを加え、37°Cで30分間培養します。
6. 1ウェルごとに基質溶液100μLを加え、光を遮断した状態で37°Cで10分間培養します。
7. 1ウェルあたり100μLのストップ溶液を加え、優しく混ぜ、マイクロプレートリーダーを使って450 nmの光密度(OD)を測定します。
8. 設計されたソフトウェアを使ってOD値を標準濃度とプロットして標準曲線を生成します。
9. 測定された外径値と標準曲線に基づいて試料濃度を決定します。

4. シーケンスのための単一細胞懸濁液の準備

注意:肺組織を入手後は、細胞の生存を維持するために氷敷し、迅速に処理してください。

1. 肺組織をPBSで4°Cまで冷やして3回洗浄します。
2. 予備冷却されたPBSを2mL加え、さらに滅菌ハサミで約0.5mm3の大きさで小さな断片に刻みます。
3. パスツールピペットを使って、PBSとともに挽いた組織を15mLの遠心分離機チューブに移します。
4. 培養皿に4°Cまで予冷されたPBSを追加1mLに加え、残りの組織断片をすすいで再懸濁させ、懸濁液を同じチューブに移します。
5. 体積を6.5 mLに調整し、PBSを4°Cに予め冷却し、組織断片をコラーゲナーゼI(100 U/mL)およびディスパーゼII(1 U/mL)を含む酵素溶液で消化し、室温で優しく振って30分間培養します。
6. 組織断片が半透明になり、明確な固体片が残らなくなったら、消化組織を70μmおよび40μmの細胞ストレーナーでろ過し、遠心分離機(4°C、500 × g、5分)して上清液を廃棄します。
7. ペレットを赤血球(RBC)溶解バッファー3 mLに直ちに再懸浮させ、ピペッティングで優しく混ぜ、氷で10分間溶除します。
8. 上澄液が淡い黄色またはほぼ無色に見えたら、反応を終えるためにPBSを7mL加え、遠心分離機(4°C、500 × g、5分)して上清液を廃棄します。
9. PBSを3mL追加して細胞を再懸濁させ、トリパンブルー染色法で細胞濃度と生存可能性を測定します。
   注意:細胞生存率が70%未満の場合は、死細胞除去手術を実施してください。
10. DPBSで調製した0.04%の牛血清アルブミン(BSA)を含む洗浄バッファーで細胞を2回洗浄します。
11. セルを再懸浮させてカウントし、濃度を1,000セル/μLに調整して後回のロードと検出を行います。

5. 単一細胞シーケンシングデータの品質管理

注:単細胞RNAライブラリーは、細胞懸濁液からドロップレットベースの単一細胞ライブラリ構築法を用いて製製されました。ライブラリは高スループットプラットフォーム上でDNAナノボールベースのシーケンシング化学を用いてシーケンスされました。各ライブラリあたり約21,000個のセルがロードされ、セル回復率は約60%を目指していました。シーケンスにより、ライブラリごとに合計5.0×¹⁰⁸ リードが発生し、セルあたり平均深さは30,000〜40,000でした。生のシーケンスデータは対応する単一細胞RNA解析パイプラインを用いて処理され、各サンプルの遺伝子発現マトリックスが作成されました。

1. PCRとバーコードラベル付けによってオリゴライブラリを構築し、濃度>10 ng/μL、ピークサイズ180 bp ±10 bpを保証します。
2. 断片化、末端修復、アダプターライゲーション、PCRによってcDNAライブラリーを構築し、濃度>10 ng/μL、ピークサイズ350–550 bpを確保します。
3. Rソフトウェア(v4.2.0)のSeuratパッケージ(v4.3.0)内のRead10X関数を使って、遺伝子発現マトリックスから各サンプルごとにSeuratオブジェクトを生成します。
4. ミトコンドリア遺伝子比率>10%またはヘモグロビン遺伝子比率>5%)の細胞を除去して、低品質の細胞を除去します。
5. スケールファクター10,000の「LogNormalize」法でデータを正規化します。
6. 「vst」法を用いて高い変動特徴を特定し、上位2,000遺伝子を保持して後流解析に備えます。
7. Seuratの組み込み細胞周期マーカー遺伝子を用いて細胞周期スコアリングを行い、細胞周期効果を退化させます(G2M)。スコアおよびS.スコア)をデータスケーリング中に測定します。
8. DoubletFinder(v2.0.3)でpN = 0.25、pK = 0.09、期待ダブルレート0.06の潜在的なダブルレットを検出・除去し、これらは処理から除外します。
9. Harmonyパッケージ(v0.1.1)を用いて、シータ=2、max.iter.harmony=20でサンプル間でバッチエフェクトを正しく調整します。
10. 個々のサンプル名やARDSモデルグループおよび対照群のグループ情報の情報列をSeuratオブジェクトのメタデータに追加してください。

6. 次元削減、クラスタリング、セルタイプ注釈

1. SeuratのRunPCA関数を用いて、高変数遺伝子に対して主成分解析(PCA)を行います。
2. ElbowPlot 可視化を使って最適な主成分数を決定します。
3. SeuratのFindClusters関数とFindNeighbors関数 を 用いて、Leidenアルゴリズムを適用して解像度0.1で主要なセルクラスターを特定します。
4. 選択した主成分を用いてUMAPの次元削減を実施します。
5. FindAllMarkers機能を使ってマーカー遺伝子を同定することで細胞型を注釈します。
6. DotPlot関数を用いて、細胞型を超えたマーカー遺伝子発現を可視化します。
7. メタデータにセル注釈結果の新しい情報欄を追加し、Umapでセルタイプ注釈を可視化します。
8. dplyr関数を用いて、各特定された細胞タイプ内の各実験群の割合を計算し、細胞数とパーセンテージを計算します。
9. ggplot2を使って、セルタイプごとのグループ構成を示すスタックバープロットを生成し、パーセンテージラベルやグループ間の統計的比較も含みます。

7. サブポピュレーション分析

1. サブセット関数を用いてターゲットセルのサブポピュレーションを抽出し、対応するスーラオブジェクトを作成して下流のサブポピュ解析を行います。
2. サブポピュレーションデータを再正規化し再スケールし、ミトコンドリア遺伝子、ヘモグロビン遺伝子、UMIカウント、細胞周期スコアを回帰します。
3. 二次的なPCA解析を行い、サブポピュラーに対して特にハーモニーバッチ補正を適用します。
4. FindNeighborsおよびFindClusters関数を用いて再クラスタリングを行い、ターゲット細胞サブポピュレーション内の異なるサブタイプを識別します。
5. 新しいUMAP埋め込みを生成し、セルタイプ注釈付きのサブポピュレーションクラスターを前述と同じアプローチで可視化します。

8. 差異遺伝子発現解析

1. MAST統計法を用いて、各サブクラスターのARDSモデル群と対照群間の差異発現遺伝子(DEGs)を特定します。
2. 差異発現検査中のシーケンス深度効果を制御するために潜在変数回帰を取り入れます。
3. あらかじめ定義された対数折りたたみに基づくDEGは、FindMarkers関数を使って閾値と調整されたp値を変化させます。
4. 各サブクラスターごとにggplot関数を用いた火山プロットを作成し、有意性ラベル付けによる遺伝子発現パターンの差異を可視化します。
5. DEGの結果をエクスポートし、機能強化やその他の下流解析を促進するための包括的な要約表を作成します。

9. 濃縮分析

1. 組織を使って遺伝子シンボルをENTREZ IDにマッピングします。経路解析の互換性のためのRn.eg.db注釈データベース。
2. すべてのサブクラスターのDEGを組み合わせ、ログフォールド変化閾値および調整p値(Wilcoxonランク-sum検定、logfc.threshold = 0.25、p_val < 0.05)に基づいて有意な遺伝子をフィルタリングします。
3. 生物過程、分子機能、細胞成分オントロジーカテゴリ、ベンジャミニ・ホッホバーグ補正法を用いたGO機能の濃縮を用いて遺伝子オントロジー(GO)濃縮解析を行います。
4. ラット生物データベースを用いたKEGG増濃関数を用いた京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路濃縮解析を実施し、統計的有意性閾値を適用します。
5. GOおよびKEGGの濃縮結果に対してドットプロットを作成し、遺伝子比と調整p値付きで著しく濃縮された上位15項を表示します。
6. 濃縮結果をCSVファイルとしてエクスポートし、可視化プロットを保存して包括的な経路解析の解釈に備えてください。

結果

ラット肺組織のHE染色では、対照群では透明な肺胞構造がほとんど炎症が見られなかったのに対し、ARDSモデル群では肺胞腔の歪み、壁の厚化、著しい炎症性細胞浸潤が見られ、対応する肺損傷スコア(図1A–E)に示されました。BALFおよび血清中のIL-6、TNF-α、IL-1βの上昇により、モデリングの成功と全身性炎症反応が確認されました(図2A–F)。品質管理後のScRNA-seq解析では、主要な細胞タイプ、免疫細胞、構造細胞を含む21の異なる細胞クラスターが明らかになり、比較解析ではARDSモデル肺組織におけるマクロファージ/単球、好中球、樹状細胞の量が著しく増加していることが示されました(図3A–D)。その後のマクロファージ/単球の再クラスタリングにより、M1、M2、組織常在マクロファージを含む...

ディスカッション

本プロトコルは、急性呼吸困難症候群(ARDS)のラットモデルにおける肺組織の単一細胞RNAシーケンス解析の標準化されたアプローチを提示します。これらの結果は、組織病理学的検査、肺損傷スコアの上昇、BALFおよび血清中の炎症性サイトカインの増加によって確認され、LPS誘発ARDSモデルの成功裏に確立されたことを示しています。単細胞トランスクリプトミクス解析により、21の異なる細胞集団が確認され、ARDS組織におけるマクロファージ/単球、好中球、樹状細胞が顕著に増加しました。マクロファージ/単球サブポピュレーションのさらなる特徴付けにより、M1、M2、組織常在マクロファージを含む6つの異なるクラスターが特定され、それぞれがARDSに応答して独自の転写シグネチャを示すことが判明しました。

ここで説明するプロトコルは、ARDSにおける単一細胞研究に内在するいくつかの重要な技術的課題に対応しています。酵素による消化法の選択は、細胞の生存率と^{表現型を維持し}つつ成功した細胞解放のた...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.4% トリパンブルー溶液	ギブコ、アメリカ	15250061
4% パラホルムアルデヒド	Servicebio、中国	G1101
牛血清アルブミン(BSA)	サンゴン・バイオテック、中国	A600332-0005
コラーゲン酵素I型	イェセン、中国	40507ES60
カーブエキスキス	ハイアムズ開発	v1.4
ディスパースII	イェセン、中国	40104ES60
大腸菌(Escherichia coli)脂多糖(LPS)およびnbsp;	シグマ、アメリカ	L6511
ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色	ソラービオ、中国	G1120
ハイスループット遺伝子シーケンサー	MGIテック株式会社	MGISEQ-2000RS
ホスファターゼ阻害剤	ビヨタイム・バイオテクノロジー、中国	P1081
リン酸塩緩衝溶液	ソラービオ、中国	P1020
PMSF	ソラービオ、中国	R0010
R software	ルーセント・テクノロジーズ、アメリカ	v4.2.0
ラット IL-1&β;ELISAキット	4abio、中国	CRE0006
ラットIL-6 ELISAキット	4abio、中国	CRE0005
ネズミはTNF-&α;ELISAキット	4abio、中国	CRE0003
赤血球(RBC)溶解緩衝液	ソラービオ、中国	R1010
赤血球溶解緩衝剤	天源バイオテック、中国	RT122-1
RNaseフリーの水	アンビオン、アメリカ	AM9937
TEバッファー、pH 8.0	アンビオン、アメリカ	AM9858
トリスグリシントランスファーバッファー	Servicebio、中国	G2017