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研究記事

慢性運動による生理的ストレスのラットモデルにおけるヒルド療法の生化学的および組織病理学的影響

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DOI：

10.3791/70494

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2026年5月22日

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1Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Kırşehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embriyology, Kırşehir Ahi Evran University, 3Faculty of Sports Sciences, Department of Coaching Education, Kırşehir Ahi Evran University, 4Faculty of Medicine, Department of Medical Biochemistry, Kırşehir Ahi Evran University, 5Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kırşehir Ahi Evran University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ストレス反応を調査するために、慢性運動による生理的ストレスのラットモデルを確立します。血清生化学的プロファイリングと組織病理学的解析を通じて、ヒルドー療法と運動の相互作用の制御された評価を可能にします。運動後の回復メカニズムを研究するための再現可能な枠組みを提供します。

要約

慢性的な運動は筋肉損傷、酸化的不均衡、ホルモンの変化を特徴とする生理的ストレスを引き起こし、回復やパフォーマンスを損なう可能性があります。抗炎症、抗酸化、循環促進成分を含む伝統的な生物療法的介入法であるヒルドセラピーは、自然回復の選択肢として注目されています。本研究は、運動による生理的ストレスのラットモデルにおいて、慢性運動後のヒルドー療法の生化学的および組織病理学的効果を評価することを目的としました。32頭の雄ラットが、対照群、ヒルドセラピー、運動、ヒルドセラピープラス運動の4つのグループに割り当てられました。血清生化学的パラメータおよび酸化ストレスマーカーを解析し、骨格筋および肝組織を組織病理学的に調べて、運動誘発性の変化およびヒルドー療法の調節効果の可能性を評価する。慢性的な運動にさらされたラットは生理的ストレスの生化学的および構造的指標を示しました。ヒルドセラピーはこれらの変化の部分的な減衰、特に組織病理学的所見と関連しており、酸化ストレスマーカーの変化は統計的に有意ではありませんでした。これらの結果は、ヒルドーセラピーが運動後の回復過程に調節的な効果を及ぼす可能性を示唆しています。しかし、酸化ストレス経路への影響を明らかにするにはさらなる研究が必要です。

概要

伝統的な医療実践は、さまざまな急性および慢性疾患の管理のために幅広い臨床文脈で用いられてきました1,2.その中でも、医療用ヒル療法(ヒルドセラピー)は、さまざまな文化や医療システムで長い歴史を持って使用されています。近年、この伝統的なアプローチは、炎症性疾患、変形性関節症、血管疾患など様々な臨床疾患における治療効果の可能性から、再び科学的な関心を集めています。これらの効果は主に、ヒル唾液に含まれる複雑な生物活性分子の混合物に起因しており、これらは抗凝固作用、抗炎症作用、抗菌作用を示します3,4,5。さらに、動物モデルを用いた実験研究では、ヒルドーセラピーが抗酸化作用、抗炎症作用、抗アポトーシス作用を通じて組織損傷に対する保護効果を発揮する可能性が示されています。

治療に最も一般的に用いられるヒルド・ベルバナの唾液には、ヒルジン、ブデリン、エグリン、カリンなど多様な生物活性成分に加え、ヒアルロンダーゼやさまざまな低分子量代謝物などの酵素が含まれています。これらの成分は抗凝固作用、抗炎症作用、抗酸化作用、線維素溶解作用、鎮痛作用、抗がん活性を示します2,7。この広範な生物学的活性プロファイルは、ヒルの唾液(LS)が現代の生物医学的応用における補完的な治療ツールとして機能する可能性を示唆しています。しかし、特定の生理的ストレス条件下での全身的影響は完全には解明されていません。

激しいまたは長時間の身体活動は筋膜の微細構造的損傷を誘発し、クレアチンキナーゼ(CK)、乳酸脱水素酵素(LDH)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)などの酵素の血清レベルが有意に増加します。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)も筋肉損傷に反応して増加することがありますが、通常はAST 5,8,9ほどではありません。さらに、高強度または長時間の運動は、主要なストレスホルモンであるコルチゾールの上昇を引き起こし、その反応は運動強度、持続時間、個人の生理的状態によって異なります(10,11)。運動後の血糖値上昇も起こり得ますが、これは主にコルチゾール介在性の糖新生によって引き起こされ、代謝ストレス応答の特徴です12。これらの結果は、筋肉損傷の生化学的マーカーと代謝ストレスの指標の両方が激しい運動後に増加する傾向があることを示しています5。

マッサージ、冷水浸水、抗酸化物質豊富な栄養補助食品(例:ポリフェノール、タルトチェリーエキス、クルクミンなど)など、さまざまな戦略が運動後の回復を支援する可能性が調査されています。システマティックレビューによると、これらの介入は酸化ストレスや筋肉損傷のパラメータに影響を与える可能性があることが示唆されています。しかし、その効果は個人によって大きく異なり、十分な生化学的保護を一貫して提供できない場合があります 13,14,15。それに伴い、運動による生理的ストレスの条件下で追加の利益をもたらす可能性のある代替的または補完的なアプローチの探求への関心が高まっています。この文脈で、ヒルの唾液に含まれる生物活性化合物は酸化ストレスや炎症反応を調節することが報告されています7。さらに、臨床観察ではヒルドー療法が特に筋骨格系および血管疾患において痛みや炎症を軽減する可能性が示唆されています。

LSで同定されたフラボノイド、フェノール分子、その他のバイオアクティブ成分を含むいくつかの化合物は、酸化ストレス経路の調節を通じて炎症反応の減弱に寄与しています。これらの抗酸化特性は他の唾液成分と相乗効果を発揮し、ヒルドセラピーの全体的な抗炎症効果を高める可能性があります7,16。さらに、ブデリンやエグリンなどのプロテアーゼ阻害剤は好中球由来酵素の活性を低下させることが示されており、それによって組織損傷を制限します4.さらに、ヒル組織で同定されたさまざまなペプチドや脂質由来分子が炎症シグナル伝達経路に抑制作用を及ぼすことが報告されています17。

これらの発見にもかかわらず、運動誘発性生理的ストレスにおけるヒルドセラピーの潜在的役割は、特に制御された実験モデル1,2,4においては十分に探求されていません。過去の研究では抗炎症、抗凝固、微小循環効果が示されており、運動は筋肉損傷や酸化ストレス反応を引き起こすことがよく知られています18ですが、生化学的、ホルモン的、組織病理学的結果を単一の実験的枠組みに統合した研究は限られています。

したがって、本研究は生化学的、ホルモン的、組織病理学的アウトカムを統合し、運動誘発生理的ストレスの管理モデルにおけるヒルドー療法の包括的な実験的評価を提供することを目的としています。この多次元的アプローチは、ヒルドー療法の調節効果の可能性の理解に貢献し、補完的な生物療法介入を評価するための再現可能な枠組みを提供することを目指しています。

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プロトコル

すべての実験手順はARRIVEガイドラインに従って実施されました。研究プロトコルは、キルシェヒル・アヒ・エヴラン大学動物実験地域倫理委員会によって審査・承認されました(承認番号:2025年3月6日、5月1日、トルコ)。すべての手続きは、実験動物のケアと使用に関する機関のガイドラインに準拠していました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 動物の選定と飼育

32匹のオスのウィスター・アルビノラット(RRID:RGD_2308852週齢、200〜250g)が使用されました。動物はポリカーボネートケージ(40 cm×25 cm× 20 cm)に個別に収容され、木製のシェービングベッドが敷かれていました。環境条件は22〜24°Cで維持され、12時間の光と12時間の暗いサイクルが続きました。食料と水は 自由に提供されました。

実験前に1週間の順応期間が実施されました。この期間中、動物は毎日食事量、水分補給状況、グルーミング行動、運動活動を監視しました。研究には正常な生理的行動を示す動物のみが含まれていました。

2. 実験群とランダム化

動物はコンピュータ生成のランダム化シーケンスを用いて、4つの実験グループ(n=8グループ)にランダムに割り当てられました。グループ割り当て前に動物に数値識別子を割り当てることで、分類隠蔽が確保されました。実験群は、介入を受けなかった対照群(C)で構成されていました。運動グループ(E)はトレッドミル運動のみを行い、ヒルドーセラピー群(H)は週3回単独でヒルドーセラピーを受けました。および研究プロトコルに従い両方の介入を受けたヒルドーセラピーと運動群(HE)の組み合わせです。すべての介入は2週間にわたって実施されました。概日リズムの変動を最小限に抑えるため、すべての手技は午前9時から11時の間に実施されました。

3. 慢性的な運動プロトコル

運動は、調整可能な電気刺激グリッドを備えた電動齧歯類トレッドミルを使って行われました。動物はトレッドミル装置の個別のレーンに配置されました(図1)。15分/分の速度で15分の2日間の適応フェーズが実施されました。適応期間の後、運動強度は20 m/minに増加し、動物たちは2週間にわたり毎日45分のランニングセッションを受けました。必要に応じて、グリッド を通じて 1.0 mAの微弱な電気刺激が加えられ、連続運転を維持しました。

  1. 枯渇基準
    疲労とは、3回連続した刺激(各~5秒)にショックグリッドを離れられない状態と定義されました。この閾値に達した動物は即座に除去されました。このプロトコルは、定義された適応、強度進行、疲労基準を持つ既存の齧歯類トレッドミル運動モデルから適応されました。
  2. ヒルドセラピーの応用
    薬用ヒル(Hirudo verbana、~2 g)は、機関認定の供給源から入手されました。使用前に、各動物の背側部分は電動クリッパーで剃られ、皮膚は消毒剤なしで無菌生理食塩水で優しく洗浄され、ヒルの付着を防いでいました。その後、動物は動きを制限しつつストレスを最小限に抑えるために、透明なアクリル製の拘束管に入れられました。背側正中線に1本のヒルを置き、口腔吸盤固定によって視覚的に固定が確認されました。給餌は10分間許可されていました(図2参照)。散布期間後、コットンアプリケーターを部位から約1〜2cmの位置に置き、付着部を70%エタノール蒸気にさらすことでヒルを剥離しました。剥離後は、約1〜2分間、無菌ガーゼで優しく圧迫して局所出血を抑え、縫合は行わなかった。申請は週3回、2週間にわたって実施されました。この手技は、標準化された適用パラメータ21のもとで、以前に記載された実験的および臨床的なヒルドーセラピープロトコルに基づいて実施されました。

4. 安楽死と採血

実験終了時(最後の介入から24時間後)、動物たちはケタミン(75 mg/kg)およびキシラジン(10 mg/kg)で腹腔内麻酔を受けました。足の引き込みや角膜反射の欠如により、十分な麻酔深度が確認されました。その後、左心室穿刺 による 無菌5 mLシリンジを用いた心内血液採取が行われました。安楽死は出血多血で完了し、その後開胸術が行われた。その後、内側腓腹筋および肝組織を収集し、さらなる解析を行いました。採血後1時間以内に血液サンプルを血の活性化チューブに移し、1,000× g で4°Cで15分間遠心分離して処理しました。 分離した血清は200μLの部分に分割され、−80°Cで保存され分析されました。

5. 生化学的およびELISA分析

ALT、AST、LDH、CK、グルコース、電解質、コルチゾールなどの生化学的パラメータは、標準化された検査手順に従い自動生化学分析装置を用いて分析しました。CAT、SOD、MDA、GPXのすべてのELISAアッセイは、標準化された条件下で製造元の指示に従って実施されました。キットプロトコルで必要な場合、血清サンプルはサンプルバッファーで1:5で希釈されました。その後、指定されたウェルに50μLの標準サンプルと50μLの血清サンプルが追加され、37°Cで60分間インキュベートされました。培養後、付属の洗浄バッファーを使ってプレートを5回洗浄し、結合していない成分を除去しました。検出抗体(50 μL)を各ウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートしました。その後、基質溶液を加え、反応混合物を暗い環境で10〜15分間培養して色の現像を許可しました。反応は50μLの停止液を加えて終了し、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの光学密度を測定しました。すべてのサンプルは分析の信頼性と再現性を確保するために二重に分析されました。

6. 組織病理学的解析

組織病理学的評価のために、組織サンプルは標準的な組織病理学的手順に従って処理されました。組織は最初に10%中性バッファーホルマリンに72時間固定され、その後50%、70%、80%、96%、100%エタノールからなる段階的なエタノール系列で脱水され、各濃度で1時間の培養が行われました。脱水後、組織はキシレンで2回連続して30分の期間を除去し、その後パラフィンブロックに埋め込まれました。厚さ5μmの切片は回転式ミクロトームを用いて取得し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)、およびマッソン三色染色剤で組織学的検査を行いました。最後に、染色されたスライドはデジタルイメージングシステムを備えた光学顕微鏡で検査されました。

7. 統計解析

データ解析は統計ソフトウェアを用いて実施されました。データ分布はコルモゴロフ–スミルノフ検定を用いて評価されました。正規分布データでは、一方向ANOVAに続いてTukeyの事後検定が適用されました。正規分布でないデータでは、Kruskal–Wallis検定の後にMann–Whitney U検定が用いられました。 p値は0.05<統計的に有意とされました。

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結果

筋肉損傷と疲労のパラメータ

血清筋損傷マーカーは、クレアチンキナーゼ(CK)レベルがグループ間で有意に異なることを示しました(p < 0.05)。運動群ではLDH、AST、ALTの値が上昇傾向を示しましたが、これらの変化は統計的に有意ではありませんでした(p > 0.05)。CK濃度はE群で最も高く、HE群は著しく低く、対照群およびH群に近いレベルを示し、運動誘発性筋ストレスに対するヒルドー療法の緩和効果を示しました(図3A–D)。

酸化ストレスと抗酸化物質のパラメータ

SOD、GPX、MDAのレベルは群間で有意な差はなく(p > 0.05)、HE群は軽度の上昇傾向を示しました。対照的に、E群...

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ディスカッション

本研究は、ヒルドー療法が運動誘発性生理的ストレスに関連する選択パラメータの測定可能な変化と関連していることを示しました。運動群で観察されたCK、LDH、AST、ALTの上昇は、筋肉筋疲労の指標として記述されたサルコレムマル障害と酵素漏れを反映しており、これらのマーカーが筋肉の緊張の指標として記述されていた以前の報告と一致しています。対照的に、HE群は酵素レベルが対照値に近い状態を示し(図3A–D)、この生化学的パターンは組織学的に、筋繊維の組織が比較的保存され、筋肉および肝組織の壊死変化が減少していることで支持されました(図7および図8)。これらの発見は、ヒルドーセラピーが慢...

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謝辞

動物ケアとサンプル採取にご協力いただいたクルシェヒル・アヒ・エヴラン大学実験研究所のスタッフの皆様に感謝いたします。また、組織学・生化学研究所が組織処理および生化学分析において提供した貴重な技術支援にも感謝いたします。この研究は、クルシェヒル・アヒ・エヴラン大学科学研究プロジェクト調整ユニット(BAP)のプロジェクトNo.TIPの支援を受けました。A2.25.004。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
-80°Cディープフリーザー(モデルDF590)NüveDF590サンプル保存は & マイナス;80°C
アクリル拘束管該当なし該当なしヒルド療法中の固定に使用される透明なアクリル拘束剤(直径6cm、長さ20cm)
自動生化学分析装置(Alinity)アボット該当なし血清生化学パラメータ解析に使用
自動組織処理機ライカ・バイオシステムズ該当なし組織脱水とパラフィン浸潤
遠心分離機(モデルFC5706)OHAUSコーポレーションFC5706最大速度:6000rpm(ローター半径により4,000回転およびg倍)
デジタル顕微鏡カメラ(Axiocam 208カラー)カール・ツァイスアクシオカム208カラー組織病理学のための画像取得
イオシンY(黄みがかった)メルク / シグマ・オルドリッチ1.15935.0025H&E染色(エオシン成分)
エタノール絶対量(99.5%)テッキム・キムヤTK.200655.05001エタノール脱水シリーズに使用
ホルムアルデヒド溶液(~37%)メルク / シグマ・オルドリッチ1.04002.2500組織固定に使用
ハリス・ヘマトキシリン溶液ベストラボBS-002H&E染色(ヘマトキシリン成分)
塩酸ケタミン医薬品グレード(市販の供給源は明示されていません)該当なし腹腔内麻酔に使用(75 mg/kg)
光学顕微鏡(プリモスター)カール・ツァイスプリモ・スター組織病理学的画像診断
マッソンs トリクローム染色キットGBL参考文献 5022結合組織染色に使用
モーター付きげっ歯類トレッドミルコロンバス・インスツルメンツエクサー3/6制御された速度と電気刺激を用いた標準化されたトレッドミル運動に使用されます
ラットカタラーゼ(CAT)エリサキットBTラボE0869Ra96ウェルプレート;血清CAT活性測定
ラットグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX1)ELISAキットリード・バイオテクノロジーRE2557R96ウェルプレート;血清CAT活性測定
ラット・マロンジアルデヒド(MDA)ELISAキットBTラボE0156ラ96ウェルプレート;血清CAT活性測定
ラット超酸化物ジムターゼ(SOD)ELISAキットBTラボE0168Ra96ウェルプレート;血清CAT活性測定
ロータリーミクロトーム(オートカット)ライカ・バイオシステムズRMオートカットカット5とミュー;m個パラフィン断面
スライドウォーマーライカ・バイオシステムズHI1210組織学スライドの乾燥
キシラジン塩酸塩医薬品グレード(市販の供給源は明示されていません)該当なし腹腔内麻酔に使用(10 mg/kg)
キシレン(異性体の混合物)テッキム・キムヤTK.090270.05003パラフィン埋め込み前の組織クリアリング

参考文献

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