方法論記事

高密度微電極アレイを用いた蒼蒼胆深部脳刺激のネットワーク全体メカニズムの調査

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DOI：

10.3791/70507

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2026年6月16日

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1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

この記事について

サマリー

ここでは、生体内で受けたジストニックハムスターモデルの急性小脳スライスから、体外で高密度微細電極アレイ記録を行うプロトコルについて説明します。11日間にわたる連続的な蒼白深部脳刺激。

要約

ジストニアは、不規則な筋肉制御が不自然で随意運動や持続的な姿勢に影響を及ぼす神経学的運動障害です。ジストニアは基底核機能障害と関連していますが、増え続ける証拠は小脳がその病態生理に関与していることを示唆しています。このプロトコルは、ジストニックハムスターモデル(dtsz hamster)を用いたin vivoの蒼白状深部脳刺激(DBS)と、生体外高密度マイクロ電極アレイ(HD-MEA)記録を組み合わせて小脳活動を調査します。プロトコルには、(1) 電極および刺激器の埋め込みのためのDBS手術、(2) 急性小脳切断準備、(3) 高解像度電気生理学的記録、(4) データ解析が含まれます。代表的な結果は、11日間の蒼蒼膜DBS検査で分子層、プルキンエ層、顆粒層のスパイク活動が正常レベルに回復し、ジストニアにおける小脳ネットワークの関与と一致していることを示している。このプロトコルにより、DBSによる小脳活動とその調節の詳細な解析が可能となり、神経調節療法の基盤となるネットワークレベルのメカニズムを調査するプラットフォームを提供します。

概要

ジストニアは3番目に多い運動障害であり、明確な臨床症状と症状が特徴です2,3ですが、他の運動障害と混同されることもあります(4,5,6)。最も顕著な臨床的特徴には、不随意の筋肉収縮、反復動作、異常またはねじれた姿勢が含まれます。これらの特徴は、痛み、運動能力の低下、疲労などの症状を伴うことがあり、ストレス、不安、身体的疲労の時期に悪化することがある 8,9,10,11。ジストニアの病態生理は完全には解明されていません。研究は伝統的に基底核に焦点を当ててきましたが、増え続ける証拠は、小脳を含む複数の脳領域を含むネットワークレベルの概念を支持しています。14、15、16、17。本プロトコルは、小脳皮質の異なる層にわたる細胞外ネットワーク活動を調査し、ジストニアの病態生理におけるこれらの役割を明らかにし、深部脳刺激(DBS)のネットワーク全体メカニズムを理解することを目的としています。

内胆球(GPi)または視床下核(STN)を標的とした深部脳刺激(DBS)は、特に薬剤耐性のある特定のタイプのジストニアの治療によく用いられます。さらに、治療結果は異質かつ予測不可能なため、臨床症状が似た患者でも同じ治療アプローチに対して異なる反応を示すことがあります20。ジストニアの基盤となる神経ネットワークをより包括的に理解することで、治療成果を改善する可能性があります。したがって、大規模かつ実験的なアプローチが必要であり、これは動物モデルでの前臨床研究を通じてのみ達成可能です。生体内DBS実験と生外高密度微電極アレイ(HD-MEA)記録を組み合わせることで、(ほぼ)生理的神経ネットワーク活動の高解像度モニタリングが可能となり、ジストニアの病態生理やDBSのメカニズムをより深く理解できます。

基底核と小脳は、少なくとも部分的には、一次運動皮質(M1)22との接続を通じて運動制御に影響を与えます。紋路体病変と小脳の外科的切除に関する解剖学的研究がこの考えを支持しています。本研究では、ジストニアと関連する小脳異常を示すジストニアdtsz ハムスター24,25の動物モデルを用いています。高密度微電極アレイ(HD-MEA)を用いて、ジストニールおよび健康なハムスターにおける小脳皮質ネットワークの活動を調査しました。しかし、従来の電気生理学的手法では層ごとのネットワークダイナミクスを捉える空間解像度が不足しているのに対し、この手法はこの制約に対応しています。一方で、蒼白球内部における深部脳刺激が小脳皮質ネットワークに与える影響を調査しました。

HD-MEAシステムは詳細な電気生理学的記録を並行して行う利点を提供し、小脳皮質の各層(顆粒層、プルキンエ層、分子層)を横断して解析し、各層が運動シーケンスの処理に不可欠な役割を果たします。顆粒状の細胞で密に詰まった粒状層は、苔の多い繊維から感覚および運動情報を受信・中継し、さらなる処理前の初期信号統合を可能にします。プルキンエ層はプルキンエ細胞を含み、抑制性信号を深部小脳核に伝達し、粒状層と分子層が発信信号を調節します。樹状突起と介在ニューロンに富む分子層は、プルキンエ細胞とのシナプス相互作用を通じて複雑な調節を支え、運動出力を微調整します。HD-MEAは他の記録技術とは異なり、空間解像度やサンプリング面積に制限されず、ジストニア15で見られる変化した神経動態に各層の独自の貢献を捉えることができます。この手法は、単一電極や低密度記録法と比べて、より高い空間分解能と並列記録能力を提供します。補完的な金属酸化物半導体(CMOS)29,30技術とアクティブピクセルセンサー(APS)概念を組み合わせたHD-MEAシステムがあり、時間経過中の大規模なニューロン集団の電気活動を可視化するための機能的イメージングを提供します。この技術により、小脳皮質の各層の動態を監視でき、さまざまな物質で洗浄することで特定のシナプス伝達過程を調査できます。この方法は、複雑な神経ネットワーク活動や神経疾患モデルにおける層特異的変化の調査に特に適しています。

この研究は、刺激システムのカプセル化、組織準備、データ収集、大規模な電気生理学データセットの解析に関する技術的課題に取り組んでいます。本研究により、高度に複雑な神経処理の in vitro研究の選択肢を提示します。これは、一方でジストニック神経ネットワークにおける病態生理学的動態のより細分化した理解に寄与し、他方でDBSの治療機序に関する知見を提供します。

プロトコル

ジストニックDTsz ハムスターを使い、シリアンゴールデンハムスターを制御して実験を行います。本研究では合計4つの実験群が調査されました:(1) 非ジストニーニック対照ハムスター(野生型、WT)、(2) 在来未処理のdtszハ ムスター、(3) dtsz-Sham(着床は受けたが能動刺激なし)、(4) dtsz-DBS(スライス準備前に11日間連続生 体内DBS)。すべての動物実験は、EU指令2010/63/EUおよび動物保護に関する連邦法(ライセンス7221.3-1-029/20)に従って実施されました。

1. 動物

  1. GV Solas33 の標準的な環境で、14時間のライト/10時間の暗いサイクルで飼育し、水と食べ物(標準的なダイエットハムスター、アルトロミン)を自由に提供します。
  2. dtsz ミュータントハムスターのジストニーク症状のスクリーニングは、20歳±1歳と27歳±4日目で行われます
    注:この標準化された軽度ストレス処置は、ハムスターを自宅のケージから取り出し、新しい空のケージに移し、その後腹腔内または皮下注射で生理食塩水を投与し、短期間の睡眠剥奪を行います。この軽度の不安を引き起こす刺激の連続は、再現可能な潜伏期間でジストニーク発作を確実に誘発し、実験群に組み込む前の表現型スクリーニングに用いられます。非ジストニア性の対照ハムスターも、グループ間の比較可能な実験条件を確保するために同じ手順を受けます。
  3. 鎮痛については、dtsz-Sham群およびdtsz-DBS群の動物を100 mg·kg-1 の口口(p.o.)メタミゾールで治療します。以下に説明する外科的手順に従って両群を埋め込みます。

2. STELLA刺激システムのカプセル化

  1. STELLA刺激システムは、慢性的な着床時に液体の浸透から保護するために生体適合性のあるアプローチでカプセル化されています。電子機器はカスタム3DプリントされたPETGカプセルに収められています。
    1. 蓋とカプセルの間をシリコンで密閉してください。
    2. さらに、ケーブル出口のハウジングをシリコンで密封してください。
    3. 乾燥後にシリコンに隙間が見えたら、手順1と2を繰り返します。
    4. シリコーンが完全に固化した後、100:35の混合比(重量)でエポキシ樹脂を準備します。
    5. 真空(Vevor RS-1.5)で樹脂の気泡を取り除きます。
    6. 型組み立て前に、カスタムシリコーン型の接合面に薄いワセリンを塗布し、密封性を高め、エポキシ硬化後のデモールドを容易にします。刺激カプセルをシリコーン型に入れ、エポキシ樹脂でゆっくりと型を詰めて、刺激器とケーブルの接合部が完全に覆われるまで続けます。充填時には気泡を避けましょう。
    7. 樹脂が硬化したら、カプセルを型から取り出し、細かいヤスリや研磨ツールでエポキシ表面を滑らかにして鋭いエッジを取り除きます。
    8. 硬化したエポキシカプセルの上に、液体シリコーンに浸して薄いシリコーンコーティングを施します。プラスチックピペットを使って、接続部付近のケーブル周りに追加のシリコーンを塗布してください。過剰なシリコーンの蓄積は、硬化前にスティックで除去し、コーティングの厚みを防ぐ必要があります。
    9. 最後に、埋め込みや実験使用前に適切な刺激出力を確認するためにカプセル化後機能テストを実施します。STRA刺激システムをリンガー溶液に組み込み、磁気BIST機能を起動します。正しいLED点滅パターン(2 × 2)を確認し、適切な刺激出力とショート、オープンサーキット、低バッテリー状態の欠如を示します。

3. 刺激システムを埋め込むための外科的手技

  1. 外科用器具(図1)およびSTELLA(ソフトウェア定義型インプラント型モジュールプラットフォーム)刺激システムを準備する34.
    1. 図1の金属器具を200°Cで約5分間滅菌します。例:FST滅菌器250で。器具を取り外した際には熱いことに注意してください。
    2. STELLA刺激システムを2つのDBS電極で70%エタノールで消毒します。乾燥刺激システムをFalcon(50mL円錐形チューブ)にリンガー溶液を入れて一晩置きます。
  2. 動物の準備(生後25〜32日)
    1. 麻酔チャンバー(自作)をハムスターケージに入れます。ハムスターはしばらくすると自発的にチューブの中に入るようになります(図2A)。
    2. ハムスターがチューブ内に入ったら、チューブの端を閉じ、揮発性イソフルランの排出にチューブを1〜2分間接続します(4%イソフルランによる麻酔誘導)(図2B)。
    3. 動物を円筒から優しく取り出します。動物を温度管理されたものに置く
      表面(約38°C)で呼吸マスク(GM-4;3%イソフルランで麻酔維持、指間反射による麻酔深度試験)を装着します。
    4. 適切なヘアクリッパーで手術部位を剃りましょう(図2C)。湿った綿棒でその部分を洗浄し、0.25%ブピバカインを500μLを皮下注射(s.c.)して、骨膜の局所麻酔をさらに施します。頭皮を開ける前に少なくとも5分は待ちましょう。
    5. 動物を慎重に立体誘導フレームに移し、耳棒で固定してブレグマとラムダの高さを同じにします(麻酔を維持するためにイソフルランは1.5〜2.5%に減らします)。
    6. 涙の代替品(TVM Ocry-Gel)で目を守りましょう。

4. STELLA刺激システムを埋め込む

  1. 頭皮の内側に長さ2cmの皮膚切開をします。リトラクター(図1、No. 14および 図2D)が皮膚を引き離します。刃で骨膜を局所的に削り、引っかいて頭蓋骨を準備します。綿棒で出血の可能性があることを止めましょう。
  2. コットンチップのアプリケーターで3%のH2O2 を塗布し、ラフ化します。
  3. リンガー溶液の刺激システムを使い、DBS電極をパラフィルムで保護します。
  4. 頭に切ったばかりの皮膚に鈍いハサミを差し込み、首と脇腹に向かって皮下で5cmの皮膚ポケットを作ります。
  5. ファルコンから取り出して皮膚消毒に浸した刺激装置を挿入する。
  6. 綿先端のアプリケーターで約500μLの抗生物質(10 mg·g·1 フシジジック酸)を皮膚ポケットに塗布します。
  7. 頭蓋骨に7mmの穴を2つ(FST#19007-07で)開け、DBS電極をAP(−0.6 mm)およびML(± 2.2 mm)にドリルします(bregma)。
  8. さらに2つの穴(9mm;FST#19007-09)は各電極穴の横方向に設置しています。準備済みの穴に4本のネジ(DIN 84 A2 M1x2)をねじ込みます(図2D参照)。
  9. DBS電極(SNEX-100)を2つ埋め込み、DVはブレグマによると6.0mmです。ご自身の立体定位フレームの電極ホルダーによって、どちら側に先に埋め込まれるかが決まります(電極間の距離は4.4mmです)。
  10. 電極をUV光硬化結合(ヘリオボンド)で2つのネジに固定します。両方の電極を埋め込むと、最終的に紫外線硬化結合の層が塗布されます。最後に、電極はコンポグラスフロー(図2E)でセメント固定されます。
  11. DBSグループの刺激器を少なくとも3日間の回復後に磁気的に作動させ、連続11日間のDBSを行ってください。本研究では、臨床で使用される刺激パラメータ(130Hz、50μA、60μs)を用いました。
  12. 毎日、磁石でハムスターの脇腹をスワイプして刺激装置の光パターンをチェックします(図2F)。

5. 急性小脳スライスの準備

  1. 各動物ごとに人工脳脊髄液(ACSF)1リットルとショ糖0.5リットルを準備してください(詳細は 表1 および 表2 を参照)。
  2. 脳抽出およびスライス中は約4°Cのショ糖溶液を使用し、連続炭化を施します。さらに、急速な解剖時に組織温度を低く保つために、氷のように冷たいスラッシー・ショ糖を準備してください。
  3. 解剖ツール、ショ糖溶液、ペトリ皿、振動装置( 図3A参照)で作業場を準備します。
  4. 動物の生贄はDBS終了後約15分以内に行われなければならず、その直後に小脳摘出を開始します。揮発性イソフルランによる深い麻酔で動物の首を切断します。頭を氷のように冷たいスラッシーショ糖を詰めた高いペトリ皿に入れます。
  5. 脊髄管を通る内側切開を避けることで脳を切り離し、小脳組織を損傷から守ります。
  6. 脳を新しいペトリ皿に移し、氷のように冷たいスラッシーショ糖を入れ、切片時に小脳が滑らないように底にろ紙を貼ります。
  7. まず、刃で冠状切断で橋橋を切断します(図3B)。次に、刃物で小脳半球を矢状切開で切除します(図3C参照)。
  8. ビブラトームプレートに瞬間接着剤を一滴塗って準備します。小脳の虫を慎重にペトリ皿から取り除きましょう。パラサジタル断面をフィルターペーパーに軽く塗って乾かし、この面を接着します(図3D)。
  9. ビブラトームプレートをトレイに入れ、ショ糖(半分スラッシー、半分溶液)を十分に注ぎ、虫を完全に沈めます。炭酸(CB)を一緒にガスで補給するのを忘れないでください。
  10. 厚さ200μmの副矢状小脳スライスを、一定速度0.08mm·s-1 で切断します(図3E)。スライスをACSFで保存し、室温で常にCBガスを加流したビーカーに入れます(図3F)。
  11. スライスを室温の炭酸ACSFで約40分間回収させた後、HD-MEAに移し、記録前の再加熱と安定化期間として機能します。この期間中は、ACSFを室温に保ち続けてください。

6. BioCAM DupleX MEAシステムのCorePlateTM シングルウェルの記録準備

  1. 実験開始の少なくとも30分前に、BioCAM DupleXのBrainwave 5ソフトウェア(BW5)を起動してください。
  2. CorePlateTM シングルウェルに組織スライスを置いて録音する前に、録音セットアップにシングルウェルを挿入して背景ノイズレベルを評価してください。高品質録音のための最適なノイズレベルは9〜20μVであるべきです。
  3. 金メッキパッドは100%エタノール(図4A-1)、電極アレイを70%エタノール、そして柔らかいブラシ(図4A-2)で洗浄します。最後に、MilliQの水で電極アレイを洗い流します。
  4. HD-MEA/CorePlateTM シングルウェルを記録システムに接続します(図4D-1)。
  5. 約2 mLのACSFをピペットでウェルに注入します。電極や地面に気泡がないか確認してください(図4D-2参照)。
  6. ライブ取得を開始し、BW5で少なくとも30秒間録画してください。

7. ピーク間振幅の解析

  1. ノイズインターフェースを解析するには、録音された*.bxrファイルを開きます。これは電極と増幅回路の抵抗性成分によって生成される30秒間の本質ノイズ記録を含んでいます。
  2. 「アクティビティマップ」を選択し、「メトリック」の下から ピーク間振幅を選択します。スケールは500μVに設定されており、電極アレイ全体の信号変動を可視化できます(図5A)。
  3. 「アクティビティマップ」ウィンドウで、マウスポインターを記録された電極の上に置くと、「Well Wide Mean」振幅値が表示されます。
  4. あるいは、「グラフエクスポート」の欄にExcelファイル(*.xlsx)を作成することで平均振幅値を求めることもできます。その後、そのExcelファイルを開き、平均振幅値[=Average(Number1;ナンバー2;...)]。

8. 基準ノイズ(信号標準偏差)を解析する

  1. 「再生」をクリックしてベースラインノイズを解析し、*.brwファイルを生成します。次に、「アクティビティマップ」を選択し、「 メトリック」 の「標準偏差」を選択します。スケールは自動的に30μVに設定され、電極アレイ全体の信号変動を可視化できます(図5B)。
  2. 「アクティビティマップ」ウィンドウで、マウスポインターを記録電極の上にカーソル合わせると、「Well Wide Mean」標準偏差が表示されます。
  3. あるいは、「チャートエクスポート」を使って平均標準偏差を算出し、*.xlsx Excelファイルを作成することもできます。次に、Excelファイルを開いて平均標準偏差を計算します [=Average(Number1;ナンバー2;...)]。

9. 信号品質の評価:

  1. 信号対雑音比(SNR)を計算します
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5:良好な品質
    SNRが2から5の間で:中程度の品質
    SNR < 2:品質の低さ

10. データ取得のためのCorePlateシングルウェルにおけるスライス位置

  1. パスツールピペットを用いて、スライスを電極アレイに位置させ、関心のある領域を記録電極で覆うようにします(図4 B-1)。井戸から溶液を除去します(図4 B-2)。立った顕微鏡で写真を撮ってください。
  2. スライスアンカーで組織を固定します(図4C)。
  3. 3mLのパスツールピペットを使い、スライスにACSFを1滴加えます。
  4. 液体はパスツールの小容量ピペットで取り出します。残りの液体をねじった紙で取り除きます(これを7〜10回繰り返します)(図4C-2)。
  5. 記録中の灌流には、室温でACSFを使用し、投与量を2 mL·min-1に設定してください。流入位置は組織スライスの上にあり、流出は井戸壁にあります(図4D)。
  6. 流入と流出の接地をさらに推奨し、灌流によるノイズを最小限に抑えるために、ワイヤーを介して記録システムに接続することで実現できます(図4D-1)。
  7. 騒ぎを減らすために顕微鏡と部屋の照明を消してください。

11. CorePlateTM シングルウェルを用いたネットワーク活動の記録

  1. 録音パラメータを20,000Hzのサンプリング周波数に設定し、100Hzのハイパスフィルターを適用します。
    1. BrainWave 5ソフトウェアで「ファイル」に移動し、新しい録音セッションを開きます。
    2. 「ソース」をクリックしてください。
    3. 開いてチップ パイロットを開き、以下の調整を選択してください:
      サンプリングレート:20,000 Hz/電極での自発的な神経活動記録。
      ハードウェアのハイパスフィルターカットオフ:100Hz。
      光補償率:短時間(直接光刺激)。
  2. チップのキャリブレーションチャネルと生トレースの種類を選択するために。
    1. 開くと制御 信号、選択:内部チップキャリブレーションで出力チャンネルを選択し: 1.1。
    2. 「+」と 「チャート」をクリックしてください。
    3. 開く: チャート設定。
    4. 生の痕跡を選びます: 生とスパイク。

12. 顕微鏡画像を活動マップに挿入し、位置合わせ

  1. 「+」をクリックしてください。
  2. 「オーバーレイと注釈」は、BW5の活動マップに顕微鏡画像を挿入するためのものです:
  3. ウェル層へ行く:
    1. レイヤー 管理 と小脳画像を選択します。
    2. 選択した画像レイヤーを揃えてください: スタートをクリックします。
    3. 数字の列の後に画像の四隅をクリックして適用してください。

13. 録画前のデータ圧縮設定

  1. データを圧縮するには、RECORDERの最初のページへ行ってください:
    1. コックピットモード:上級
    2. 生の圧縮:ウェーブレット圧縮+イベント:スパイクを保存してください。
    3. 録画を始める前に10分間再生してください。
  2. 録音が終わったら、金メッキパッドを100%エタノールで洗浄してください。次に、井戸に純水を満たし、30秒ほどブラシで洗います。
  3. 次に、井戸に70%エタノールを注ぎ、電極アレイを約30秒間優しくブラッシングします。最後に、井戸に純水を満たし、30秒ほど優しくブラッシングします(この工程を2〜3回繰り返します)。
  4. CorePlateTM シングルウェルは適切な容器で乾燥したまま保ちます。

14. 記録データのオフライン解析

  1. BW5で希望のファイルを開いてください。
  2. 小脳皮質を解剖学的層の割り当て(分子層、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層)に応じて電極を選定し、3つのグループに分けます。
    注:各層における関心領域(ROI)内の電極数は、各層で検出された自発活動に依存し、記録ごとに変動しました。通常、1枚のスライスから1回のROIあたり25〜250電極が分析されました。2つの解剖学的層にまたがる領域にある電極は、層の割り当ての曖昧さを避けるために除外されました。さらなる評価のために、特定の小脳層に明確に帰属する電極のみが含まれました。
    1. 選定とグループ分け: ユニットグループに行ってください。
    2. ユニットグループ管理で「+」をクリックしてグループを作成し、名前を付けてください。
    3. グループにさらに電極を含めるには、電極を選択し、「選択ユニットの追加または削除」をクリックしてください。
  3. スパイク検出法(精密タイミングスパイク検出、PTSD)を用いて生の痕跡を解析します。これは、ピーク・トゥ・ピーク振幅があらかじめ定められた閾値を超える相対最大値と最小値の検出に焦点を当てており、正確かつ正確なスパイク識別を保証します。
    1. データ処理: スパイク検出 に行き、モードを 高度に設定してください。
    2. データを使用:RAWから。
    3. アルゴリズム:PTSD(正確なタイミングスパイク検出)。
    4. 標準偏差係数:8.0。
    5. 最大寿命:2.0 ms。
    6. 不応期:1.0 ms。
    7. スパイク割り当て:負のピーク。
    8. ピーク前の波長:1.0ミリ秒。
    9. ピーク後の波長:1.5ms。
  4. スパイクのソートに行き、モードを高度に設定してください。次のパラメータを調整します:
    1. ピーク前の波長:0.5 ms。
    2. ピーク後の波長時間:1.0ミリ秒。
    3. 特徴抽出アルゴリズム:ルジャンドルモーメント。
    4. 特徴の数:3。
    5. クラスタリングアルゴリズム:K-Means と Silhouette。
    6. クラスターあたりの最低ピーク数:20。
    7. クラスターの最大数:3。
    8. アウトラインの閾値:2。
  5. Excelへのデータエクスポート。
    1. 「チャート作成」をクリックしてください。
    2. チャートエクスポートに行ってください。
    3. スプレッドシートを選択してエクスポートします。

結果

蒼白DBSは、群間で皮質層のスパイク数を正常レベルまで増加させました。

小脳皮質の3層(分子層(ML)、プルキンエ細胞層(PL)、顆粒細胞層(GL))のスパイクの総数を、野生型(WT、N = 8)、dtsz( N = 8)、dtsz-Sham(N = 7)、dtsz-DBS(N = 7)の4つの実験群に分けて解析し、これらの動物から得られたスライスを分析しました。

ジストニーク組織(dtsz)は有意に少ないスパイクを生じさせたが、蒼白DBSは健康な対照群と同等のレベルまでスパイク数を増加させた(表3)。Kruskal-Wallis H検定はこれをさらに裏付け、dtsz DBS群のMLスパイク数がdtsz およびdtsz-Sham群と比べて統計的に有意に増加していることを示しました(χ2(3) = 20.728, p = 0.001; 図6A)。dtsz-DBS群もPLのスパイク増加が同様に見られました(χ2(3) = 16.855, p = 0.001; 図6B)GL(χ2(3) = 13.164、 p. = 0.004; 図6C)は、WT群と同等の値に達しました(表3)。

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図1。手術器具の概要。画像には、 深部電極や刺激装置の埋め込みを伴う手術用および顕微外科用器具が並べられたトレイが並んでいます。これらのツールは使用順に整理されており、手続きの効率性を高めています。これらは組織に貼り付けられ、清潔さを保ち、処置中にアクセスしやすくします。この取り決めは、精密さ、無菌性、複雑な手術ワークフローへの対応力に焦点を当てています。(1) 鈍い/鈍いハサミ、(2) 縫合用のハサミ、(3) 鋭利/ハサミ、(4) 針ホルダー、(5) 縫合用ピンセット、(6) 曲がったささくれ型ピンセット、(7) ギザギザ型ピンセット、(8) 標準的な短柄ピンセット、(9) 標準的なピンセット、長型、(10) マイクロヘラ、(11) 再利用電極、(12) ネジ、(13) ドリルアクセサリー、(14) リトラクターの先端/クランプ、(15)) ガラス空腔ブロックを0.9%のNaClとキシロカインで充填する。詳細は資料リストをご覧ください。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2。DBS電極と刺激器の埋め込みのために、動物を麻酔し立体誘導装置内に位置づける実験装置。(A) 動物を特注の誘導室に優しく入れて麻酔を開始する。(B) 誘導室は呼吸マスクに接続されており、適切な麻酔投与(イソフルラン4%の誘導)を確保しつつ、取り扱い時の安全性を確保します。(C) 麻酔後、動物は呼吸マスクを装着した加熱プレートに移され(維持時はイソフルラン3%で)、低体温症を防ぎ、髭剃り中の連続麻酔を確保します。(D) 動物は慎重に立体走位フレーム内に配置されます。縦方向の切開を行い、クランプを使って皮膚を引っ込めます。4つの点はネジの位置を示しています。マークされた部分にネジを挿入し、電極配置用の2つの追加点をマークします。(E) 電極をGPiに挿入し、接着剤で固定した後に立体定位ホルダーを取り外します。より良い固定のために、電極の周囲にセメントを塗布します。手術部位を閉じるために中断した縦縫合線を用い、(F)刺激剤を動物の皮下側腹部に置きます。動物は手術後も生き残り、矢印は刺激装置の位置を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3。脳の切片と切断の図。(A) 解剖手術用の外科器具。(1*)自家製の寒天ペトリ皿、(2つ星)、寒天柄皿、(3つ星)炭酸乳頭の固定クランプ、(4つ星)紙フィルター、(5つ星)、刃、(6つ星)瞬間接着剤、(7つ星)ビブラトームプレート/ホルダー、(8つ星)曲がった鉗子、(9つ星)ハサミ、鋭い/鈍器。(B)脳サンプルの準備:解剖後、脳を切断し、破線は冠状面切断の向きを示します。(C) パラ矢状面切断:指定された矢状面に沿って脳を切断します。(D) 組織固定:得られた脳組織は接着剤でプレート/ホルダーに固定され、正確な切片のために固定されます。(E) バイブラトーム切片:付着組織を装着したプレートをバイブラトームに移し、超薄いスライス(200μm)を得ます。(F) 最終スライス:精密な矢状体傍小脳スライスが作成され、電気生理記録の準備が整います35。詳細は資料リストをご覧ください。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4。良好な細胞活性を得るための手順の例。(A) 清掃:この工程では、HD-MEAの表面を清掃し、汚れがアタッチメント(接点パッド、A-1)や記録過程(平らな部分、A-2)に干渉しないように準備します。(B)スライス位置:組織スライスはHD-MEA(B-1)に慎重に配置され、効果的な電極接触(B-2)のために適切なアライメントを確保します。ピペットの細い先端(矢印)を使って残ったACSFを取り除き、アンカーを挿入できるようにします。(C) スライスの取り付け:スライスはアンカーを使ってHD-MEA上にしっかりと位置付けられます。この段階では、ACSFを一滴滴置き、ピペット(C-1、矢印)とねじった精密ワイプペーパー(C-2)を使って余分な液体を慎重に除去することが非常に重要です。これにより、スライスが安定し、電極と良好に接続されて正確な記録が可能となります。(D) 灌流:最後に、灌流システムを接続し開始し、実験中に組織スライスの生存可能性を維持するために開始されます。この場合、流入はスライスの上に、流出は壁(D-2)に近い位置に置かれます。また、録音中のノイズ(矢印で示される)を最小限に抑えるために、地面からすべての気泡を取り除くことも不可欠です。追加の接地は、インフローおよびアウトフローチューブ(D-1)の両方に取り付けられています。赤いスケールバーの長さは1.5mmです。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-5
図5。Brain Wave 5ソフトウェア(BW5)を用いたHD-MEA記録における振幅および標準偏差の指標を用いて信号品質を評価すること。(A) ピーク間振幅計を選択し、固有の電極振幅値を抽出します(スケール:500 μV)。(B) 電極間の基準ノイズを定量化するために標準偏差計量を選択し(スケール:30 μV)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-6
図6:小脳皮質層((A)分子層(ML)、(B)プルキンエ細胞層(PL)、(C)顆粒層(GL))に及ぶ軟蒼DBSのスパイク活動への影響。ボックス・ウィスカープロットは、平均値と中央値をそれぞれ横線と横線で示し、25パーセンタイルと75パーセンタイルを示しています。それぞれのグループは、ワイルド型(WT、n = 22スライス)、手術なしdtsz(n = 20スライス)、dtsz DBS非活性(Sham、n = 20スライス)、dtsz-DBSアクティブ(n = 20スライス)です。統計的有意性はKruskal-Wallis検定を用いて決定され、その後Dunnのペアワイズ比較(*p .< 0.05)この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

名称分子量 [g/mol]最終濃度 [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
グルコース180.160.01
CaCl2 (水不使用)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
pH7.35から7.40(HClで調整可能)
浸透圧 [mosmol/kg]290から300

表1:人工脳脊髄液(ACSF)溶液: 小脳スライス実験のためにACSFを準備するために使用された成分の組成および最終モル濃度。pHはHClで7.35–7.40に調整され、浸透圧は290〜300 mOsm·kg-1の間で維持されました。

名称分子量 [g/mol]最終濃度[mol/L]
サッカロース342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (水不使用)110.980.0005
MgCl295.210.007
グルコース180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
pH7.35から7.40(HClで調整可能)
浸透圧 [mosmol/kg]320から330

表2:ショ糖溶液。 小脳スライス準備時に使用されたショ糖溶液の組成および最終モル濃度。pHは7.35〜7.40に調整され、浸透圧は320〜330 mOsm·kg-1の間で維持されました。

グループ:WTDTSZ dtSZ-シャムdtSZ-DBS
n22202020
分散係数
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
スパイクの数
ML287240±32605163434±19998年234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

表3:小脳層および実験群のスパイク指標の要まとめ。WT– 野生型でジストニア性のないコントロールハムスター;DTSZ - ネイティブのDTSZハムスターズ;DTSZ-DBS - DTSZハムスターは11日間連続刺激を受けました。DTSZ-Sham - 手術を受けているDTSZハムスターで、活発なDBSはありません。ML – 分子層;PL – プルキンエ細胞層;GL. – 顆粒細胞層。

ディスカッション

私たちは、DTSZ ハムスターの病態生理的ジストニーク神経ネットワークにおける深部脳刺激(DBS)のメカニズムを調査するための方法論的アプローチを記述しました。重要なステップには、正確な電極埋め込み、迅速な小脳スライス準備、安定したHD-MEA記録条件の確保が含まれ、信頼性の高いデータ取得を確保します。手術手順、小脳切片の準備、記録および解析技術を示し、 生体外小脳活動とそのDBSによる調節を探ります。HD-MEAを用いた電気生理学的測定により、小脳の自発活動をリアルタイムで記録でき、時間的および空間的解像度が高く、ジストニア治療における蒼白の深部脳刺激のメカニズムを調査するために必要と考えます。

ジストニアは現在、基底核、小脳、皮質回路間の機能不全な相互作用から生じる異常な運動出力を特徴とするネットワーク障害として知られています(37,38)。小脳異常はジストニアに有意な役割を果たすことが示されており、臨床および実験研究の両方で支持されています15,22,39。さらに、セバスザルの小脳皮質に逆行性狂犬病ウイルス(RV)を注射した解剖学的研究では、基底核の視床下核が小脳皮質40に大きく投射していることが示されています。これらの発見は、DBS 40,41,42の治療メカニズムを研究する際に、基底核ネットワークと並んで小脳回路を探ることの重要性を強調しています。この方法は、運動障害における神経相互作用や神経調節効果の研究に特に適しています。

蒼白球DBSのネットワーク全体のメカニズムに関しては、研究により蒼白球(GPi)の内節のDBSが基底核内だけでなく、皮質-線状体ネットワーク43、視床44、小脳15などの相互に関連する領域にも広範な脳活動変化を引き起こすことが示されています.これらの観察は、蒼白DBSが基底核-小脳ネットワーク全体の活動を調節し、ジストニアにおける治療効果に寄与するという仮説を支持しています。これは、DBSのメカニズムを調査するための前臨床研究の必要性と、ネットワーク全体の電気生理学的変化を記録するHD-MEA記録の利点を示しています。さらに、Kotyraら(2025年)の研究は、ジストニック運動ネットワーク内で長期的なGPi-DBSによって誘導される持続的な神経可塑性再構築の存在を支持しています。in vivoの研究では、d-szハムスターにおける蒼白刺激がジストニアの重症度を徐々に軽減し、刺激を停止した後も有益な効果が持続していることが示されました。これにより、DBS誘発効果は急性刺激のみに限定されないことが示唆されます45。さらに、最近の電気生理学的研究では、長期DBS後のシナプス可塑性とスパイクパターンのネットワーク全体での調節が示されており、小脳活動の増加15、運動視床ニューロンへの興奮性入力の強化、皮質M1へのよりクラスター化された興奮性入力が含まれる。

代表的な結果は、ジストニーハムスターの小脳皮質の分子層、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層におけるスパイク活動の正常化によって示されるように、深部脳刺激(DBS)がネットワーク全体に与える影響を示しています(図6)。dtsz DBS群で観察されたスパイク活動の増加は、野生型対照群と同等のレベルに達しました。このスパイク活動の正常化は、ジストニア治療におけるDBSの治療的可能性を支持しています。特に、dtsz-Sham群はWT群と比較して全ての小脳層で中間的なスパイク値を示し、電極埋め込み単独が小脳ネットワークの活動に影響を与える可能性を示唆しています。この解釈は、ジストニアにおける臨床的に記述された微小病変効果と一致しており、電極埋め込み自体が刺激開始47日前に一時的に症状を改善することがあります。dtsz ハムスターは発作性全身性ジストニアの主要な特徴を再現していますが、ヒトジストニア症候群全体で観察される臨床的異質性を完全には反映していません。したがって、これらの発見をヒトジストニアに適用する際には注意が必要です。

本研究は刺激器カプセル化、DBS手術、スライス準備、大規模な電気生理学的データ解析に関連する技術的課題に取り組んでいます。CMOSベースのHD-MEA技術の組み合わせは、高度に複雑な神経細胞相互作用の in vitro 研究のための堅牢なプラットフォームを提供します48。私たちの結果は、ジストニアの病態生理学的動態をより微妙に理解し、DBS療法のネットワークレベルのメカニズムに関する貴重な洞察を提供します。特定の脳領域とその相互作用の詳細な機能分析を促進することは、ジストニック神経ネットワークにおける病態生理学的動態のより細分化した理解に寄与し、一方でDBSの治療作用機序への洞察を提供します。

本研究では、技術的な問題により背景雑音の増加とHD-MEA記録中の安定した信号取得の妨げが生じました。一般的なトラブルシューティングには、騒音源への対処、適切な接地の確保、組織と電極の安定した接触の維持が含まれます。騒音レベルが高い場合や測定値が不安定な場合は、まず接地、ケーブル接続、近くの電気機器をチェックする必要があります。電極配列上の気泡は組織と電極の接触や記録安定性を損なう可能性があるため、慎重に除去する必要があります(図4)。さらに、アンプからコンピュータへの高品質なUSB-C-to-USB-Cケーブルによる安定したデータ伝送が保証されなければなりません。持続的なノイズを持つ電極は、さらなる解析から除外すべきです。HD-MEAによる細胞外信号の記録はネットワーク活動の高い空間分解能と、重ね合わせされた顕微鏡画像と組み合わせて小脳皮質の各層に割り当てられる一方で、検出された細胞外活動が割り当てられた層以外の軸索の交差によって生じた可能性を否定できません。さらに、統計解析はスライスレベルで行われ、各スライスは標準化された実験条件下で独立した電気生理学的記録を表していましたが、一部のスライスは同じ動物に由来していました。

DBS中は電極の緩みや刺激装置の技術的な欠陥によりさらなる問題が発生することがあります。これらの問題を最小限に抑えるために、適切な電極固定を行い、処置中は無菌状態を維持してください。これは本研究の全試験の5%で起こった。電極の緩みを最小限に抑えるために、接着剤やデンタルセメントで固定する前に頭蓋骨表面を乾燥させ、接着力を高め滑りを防ぎます。無菌性を確保し機械的汚染を避けるために、刺激装置、電極先端、モノフィラメント糸はピンセットまたは止血ピンセットでのみ扱う必要があります。また、手袋は動物を扱う前にエタノールで消毒し、乾燥させて感染リスクを最小限に抑える必要があります。小脳のスライスを迅速に準備することは、高品質な電気生理記録に不可欠です。しかし、これにより埋め込まれたDBS電極の位置は事後的に確認できませんでした。異なる刺激パラメータがdtsz-Hamsterのジストニア重症度に与える影響を調査した別の研究では、同じ刺激電極と外科的技術が用いられました。ここでは、37件の試験の94%で正しい電極位置を確認することができました。

結論として、このプロトコルはDBSの電気生理学的メカニズムを研究するための強力なプラットフォームを提供し、その作用機序に関する貴重な洞察を提供します。dtsz ハムスターは、ジストニーニズ表現型に対する蒼白DBSへの前臨床研究と、神経ネットワーク活動の 生前高解像度記録を独自に可能にしています。私たちの結果はジストニアにおける小脳関与の概念を支持し、神経調節療法の理解と最適化におけるネットワークレベルの分析の重要性を強調しています。

開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

本研究はドイツ研究財団(DFG)の協働研究センター(SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580)によって支援されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conical tubeGreiner Bio-OneFalcon-type conical tube
Agar Petri dishHandmade 
Anaesthesia UnitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Blade (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5CMOS-HD-MEA platform
Breathing maskNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195For cement
Capsule Dispenser Gun Dentsply Sirona296-0003For cement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Clamp (3*)DIEFFENBACH12-1003-04stainless steel 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
Drill accessory (13)FST19007-07Tip: 7mm
Drill accessory (13)FST19007-09Tip: 9mm
Eco wipes - wipe dispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco wipes - wipe rollsDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElectrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Excavator (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Forceps (5)FST18025-10Stainless Steel 10cm
Forceps (6)AesculapBD311R9cm
Forceps (7)FST91100-12Stainless Steel 12cm
Forceps (8)FST11231-20Stainless Steel 11cm
Forceps (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Heated surgical table+integrated gas exhaustBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
Ice MachineScotsmanAF 80 AS / WS
Inflow and outflow needlesBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraneSedana medicalN001254
Mili-Q Water FilterElgaPURELAB flex 3
Needle Holder (4)FST12501-13Tungsten Carbide 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptic solution 
Paper Filter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anchor3Brain3Brain
Retractor Tip (14)FST18200-102.5mm
Reused Electrode (11)MicroprobesSNEX-100For Coordinates
RingerB. Braun3570030
Scissor (1)FST14078-10Stainless Steel 10cm
Scissor (2)AesculapBC144R
Scissor (3)FST14058-09Stainless Steel 9cm
Scissor (9*)FST91401-12Stainless Steel 12cm
Screw (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (software defined implantable modular platform) stimulation system非商用; ロストック大学の開発open source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)battery-driven DBS stimulator
Sterelizer 250FST18000-45
StereotaxicNarishigeModel SR-AR
Super glueUHU64212
Tear cream (Panthenol Nose Cream)Jenapharm5541249
Vibratome LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
Weigh BoatCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeigherVoltcraftTS-5000/1
Compounds used for solutions preparation
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Potassium Chloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-80-7
SucroseSigma-Aldrich57-50-1

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