方法論記事

AAV導入研究における3Dスフェロイドの評価

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DOI：

10.3791/70517

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2026年8月14日

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

この記事について

サマリー

3次元スフェロイド培養システムは、AAV遺伝子治療の開発において従来の2Dモデルよりも優れた特性を有しています。本手法により、低用量でのAAV導入の高感度な検出、生理学的妥当性の向上、および堅牢な長期モニタリングが可能になります。このプラットフォームは、多様な細胞株やAAVセロタイプにおける力価評価、ハイスループットスクリーニング、およびベクターの最適化を支援します。

要約

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、遺伝子治療製品における遺伝子導入に使用される強力なベクターです。その開発には、ベクター設計、セロタイプによる性能、調節エレメントの強度、および発現キネティクスの違いを確実に検出できるin vitro システムが必要です。また、これらのシステムは、力価評価やベクター最適化などのアプリケーションをサポートしなければなりません。本稿では、多様な細胞株においてAAVの力価、導入遺伝子の発現キネティクス、およびセロタイプ特異的な導入効率を評価するために最適化された、効率的な三次元スフェロイドプラットフォームについて説明します。超低接着プレートを用いて均一なスフェロイドを形成し、安定した構造と長期イメージングを維持できる条件下で培養します。AAV導入後、ライブセルイメージングシステムを用いて、蛍光または発光のリードアウトをリアルタイムでモニタリングします。これにより、連続的なキネティックイメージングを通じて、リポーターシグナル、用量反応性、調節エレメントの活性、および発現開始時間の定量的な評価が可能になります。本プラットフォームは、強力なベクターゲノム設計と弱い設計、および複数のAAVセロタイプを効果的に区別します。この手法は、緩徐に分裂する細胞株と急速に分裂する細胞株の両方において堅牢な性能を示します。これらの結果は、本システムが前臨床段階の遺伝子治療の評価および開発において、スケーラブルで生理学的に妥当なシステムとして有用であることを立証しています。

概要

AAVベクターは、その安全性と持続的な遺伝子発現を達成できる能力から、in vivo応用のための好ましい遺伝子導入システムの一つとなっています1。AAV遺伝子治療は、数百もの製品が開発パイプラインにあり、複数の希少疾患の治療において成果を上げています2。さらに、Cas9などのゲノム編集コンポーネントのin vivo導入といった新たな応用が進んでおり、治療が困難な適応症の治療を支援する大きな可能性を秘めています3。開発における主な課題には、高い製造コストや、製品の品質および臨床的有効性を判断するための現在のin vitroアッセイの予測能が限定的であることなどが挙げられます4。

AAV治療薬の進展は、臨床的なパフォーマンスを正確に予測できる、標準化された予測能の高い活性アッセイの欠如によって根本的に制限されています4,5。これらのアッセイは、設計されたベクターライブラリのスクリーニング、標的能を向上させるためのカプシド修飾の最適化、および組織特異的な親和性の評価など、多目的に利用されるため、開発パイプラインにおいて極めて重要な構成要素となります。また、調節配列が導入遺伝子の発現に及ぼす影響を特性評価する役割も担っています6。候補の選定に留まらず、AAV形質導入アッセイは、ロットリリース、ロット間比較試験、および安定性評価に用いられる力価試験を通じて、製造上の重要な品質管理をサポートしています6,7。

科学的な課題は、日常的な使用における実用的な実現可能性を維持しつつ、ベクターと宿主の相互作用の複雑さを捉えるアッセイを開発することにある7,8。現在のアプローチには、従来の2D単層培養において標的臓器を代表する不死化細胞株を利用することが含まれる。これらの培養条件は生理学的な妥当性に欠け、高用量の薬剤を必要とする。これにより、研究室での予測と臨床への転用可能性との間に大きな乖離が生じている。AAVR過剰発現系やCRISPR活性化システムなどの新規エンジニアリング細胞株は重要な進歩を示しているが、天然組織に特徴的な三次元構造や細胞外マトリックスの相互作用を再現することはできていない9,10,11。in vivoの微小環境をより適切にシミュレートできる次世代モデルは、この転用上の隔たりを埋める可能性がある12,13,14。

我々は最近、AAV導入アッセイのトランスレータビリティを向上させるため、AAV導入に最適化した3Dスフェロイドシステムを開発しました。このシステムは、ゴールドスタンダードである2Dアッセイと比較して、複数の細胞株およびAAVセロタイプにおいてAAV導入効率を大幅に向上させます。感度の向上とアッセイに使用する産物の節約に加え、これらのモデルは、スフェロイド内の細胞の位置に応じて変化する現実的な細胞間相互作用を提供することで、2D単層培養を改善しています。また、実際の臓器の状態を模倣した薬剤浸透の有意義な調査も可能です11,15,16。さらに、このスフェロイドアプローチは、標準的な研究室設備を使用し、特殊な培地やスキャフォールドの要件を回避できるため、より複雑なオルガノイドや共培養システムよりも実用的な利点があります。この簡便さにより再現性とスケーラビリティが確保され、ルーチンの遺伝子治療試験やベクター開発のワークフローに適しています17。

この3Dスフェロイドプラットフォームは、低用量でのAAV導入の高感度な検出や、ベクターゲノム設計の比較評価を必要とするアプリケーションに特に適しています。また、セロタイプ依存的な向性の評価も可能です。従来の2D培養において高用量のAAVを必要とする、導入効率が比較的低い細胞株に特に有用です。このような状況では、3Dプラットフォームによる感度の向上と生理的妥当性の改善が極めて重要となります。ただし、免疫成分、血管輸送、または完全な組織の複雑性を必要とする研究には、このシステムは適さない場合があります。これは、スフェロイドではin vivo 環境を完全には再現できないためです。

したがって、本稿では、AAV導入アッセイに最適化された簡便な3Dスフェロイドプロトコルを提示します。本プロトコルでは、導入効率（ここではスフェロイドあたりの総レポーター信号として定義）と導入キネティクスという、重要かつ相補的な2つの読み取り値を用います。この手法は、AAVの力価評価、ベクター設計、および中和アッセイのための、費用対効果が高く、生理学的に適切で、有益なプラットフォームを提供します。

プロトコル

本研究では、商業的または既報のソースから入手した確立済みのヒト細胞株（HEK293T、HeLa、Huh7、HEP3B、HEPG2、およびA375）を使用した。ヒトまたは動物の一次サンプルは使用していないため、倫理的な承認は不要であった。

1. 無菌的な実験セットアップおよびクリーンベンチの初期準備

  1. バイオセーフティキャビネットを起動する。
  2. 気流を十分に安定させるため、作業開始の15分前にクラスII層流微生物安全キャビネットの電源を入れる。
  3. フード内部のすべての表面に70% (v/v) エタノールをスプレーする。
  4. 細胞上清および細胞残渣の廃棄用に、500 mLガラスビーカーに5% (v/v) 漂白剤消毒液を調製する。
  5. すべてのマイクロピペットとチップボックスを70% (v/v) エタノールで十分に消毒し、器具を洗浄する。

2. 細胞培養培地の調製

  1. 500 mLのDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 高グルコース基礎培地を用意する。
  2. 基礎培地に、10 mLの熱不活化胎児ウシ血清 (FBS)、1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液 (100 units/mL ペニシリンおよび 100 µg/mL ストレプトマイシン)、および 5 mLの 2 mM L-glutamineを添加する。
    注意：すべての手順において無菌操作を維持すること。各実験ごとに新鮮な培地を調製する必要がある。具体的な機器の仕様については、材料表 (Table of Materials)を参照すること。

3. スフェロイドの調製

  1. 上述の方法に従って、完全DMEM培地を調製する。
  2. 培養培地を37 °Cのウォーターバスで10–15分間温める。
  3. 液体窒素タンクから目的の細胞株を取り出す。
  4. 凍結保存されたHEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、A375、およびHeLa細胞を37 °Cのウォーターバスに入れ、急速に融解させる。
  5. 最後の氷結晶が溶けたら、直ちにウォーターバスから取り出す。
  6. 融解した細胞1 mLを、完全DMEM培地9 mLで希釈する。
    注：本プロトコルで使用するすべての細胞株は、同一のDMEM培地および培養条件下で維持されている。
  7. 室温で350 × g、5分間遠心分離する。
  8. 上清を捨てる。
  9. ペレットを5 mLの完全DMEM培地で再懸濁する。
  10. T75細胞培養フラスコに細胞を播種する。
  11. 播種したフラスコを、37 °C、5% CO2、湿度95%に維持された細胞培養インキュベーターに入れる。

4. 細胞増殖のモニタリング

  1. 3日ごとに15 mLの培地を添加する。
  2. HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、A375、およびHeLa細胞がコンフルエンシー70%に達した時点で継代を行い、T75フラスコから完全DMEM培地を吸引して除去する。 
  3. 細胞が入ったT75フラスコに5 mLのPBSを加え、細胞を洗浄する。   
  4. T75フラスコにPBSを添加して30 s後に、5 mLのPBSを吸引して除去する。  
  5. この洗浄ステップをもう一度繰り返す。
  6. 5 mLの0.05% trypsin-EDTAを用いて、細胞を5分間トリプシン処理する。  
  7. 細胞を完全に剥離させるため、フラスコを37 °Cのインキュベーターで5分間インキュベートする。  
  8. トリプシンを中和させるため、5 mLの完全DMEM培地を添加する。  
  9. 350 × gで5分間遠心分離し、トリプシンを除去する。 
  10. 細胞ペレットを5 mLのDMEMで再懸濁する。 
  11. 通常の細胞継代のため、細胞を1:10に希釈して分注する。 
    注：細胞を対数増殖期に到達させ代謝を活性化させるため、実験を行う前に2回継代することが推奨される。 
  12. 細胞がコンフルエンシー70%に達するまで、これらの制御条件下でインキュベーションを継続し、その後、後続の実験手順に進む。
    注：細胞の形態および増殖パターンを定期的に観察すること。最適なガス交換が行われるよう、フラスコを適切に配置すること。インキュベーション期間中は終始、無菌状態を維持することが不可欠である。

5. 細胞の回収および初期調製

  1. T75フラスコから既存の培地を吸引し、除去する。
  2. HEK293T、Huh7、HEP3B、A375、 HEPG2、およびHeLa細胞をPBSで3回洗浄し、残留培地とデブリを除去する。
  3. これらの細胞に、あらかじめ温めておいた1×トリプシン溶液を5 mL加え、付着細胞をフラスコ表面から剥離させる。
    注：酵素活性を最適に維持するため、トリプシンが予熱されていることを確認すること。フラスコを37 °Cのインキュベーターに5分間置き、細胞を完全に剥離させる。過消化を防ぐため、トリプシン処理時間を注意深く監視すること。
  4. 完全培地を5 mL加え、トリプシン酵素を不活化させる。
  5. ピペッティングにより、溶液を均質化する。
  6. 細胞懸濁液全体を、個別にラベルを貼った遠心チューブに移し、各細胞懸濁液を回収する。
    注：生存率を維持するため、再懸濁時の細胞の取り扱いは穏やかに行うこと。
  7. 室温で350 × g、5分間遠心分離し、細胞をペレット化する。
  8. 上清を捨て、新鮮な培地5 mLで細胞ペレットを穏やかに再懸濁する。

6. 自動細胞カウンターを用いた細胞数計測および生存率評価

  1. 遠心チューブ全体で細胞が均一に分布するように、ピペッティングで懸濁液を緩やかにホモジナイズする。
  2. HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、A375、およびHeLa細胞用の計数チューブを準備する。
  3. 完全DMEM培地を用いて、サンプルの1:10希釈液を調製する。例：360 µLの完全DMEM培地に40 µLの細胞懸濁液を加える。
  4. 均一に希釈するため、混合液を緩やかに4回ピペッティングする。
  5. ログインにサンプルを記録し、使用した細胞種、希釈倍率、およびサンプル名を割り当てる。
  6. サンプルをセルカウンターにセットし、希釈した細胞懸濁液の入ったチューブを割り当てられた番号の位置に配置する。
    注：セルカウンターは、細胞サンプルを吸引してトリパンブルーと混合する自動細胞計数器であり、操作者間のばらつきを低減できる。
  7. サンプルを計数する前に、細胞懸濁液を1分間静置させる。
  8. 正確な結果を得るため、計数前に細胞を均一に再懸濁する。
  9. 総細胞数を算出する。
  10. 生細胞の総濃度を用いて、実験のための細胞播種数を決定する。
  11. 生存率が > 90% の生細胞を使用する。
  12. 生細胞（未染色）と死細胞（青色染色）を区別する。
    注：すべてのサンプルにおいて、一貫した計数基準を維持する必要がある。

7. スフェロイドの播種とサイズの最適化

  1. 細胞懸濁液をピペッティングして均質化する。
  2. HEK293T、Huh7、HEP3B、HEPG2、またはHeLa細胞を用い、異なる細胞密度で播種する。
  3. まず、超低接着（ULA）96ウェル丸底プレートの各ウェルに、200 µLの溶液で1 x 104個の細胞を播種する。
  4. 1 x 104 cells / wellを2倍段階希釈し、実験に必要な細胞密度にするまで希釈する。
  5. 最上段を除いたすべての行（1B-1H）に、1容量の完全培地を加える。
  6. 1A行（最上段）に、2容量の1 x 104 cells /wellを加える。
  7. 1A行から1B行へ1容量を加え、同様に順次希釈して1A行を段階希釈する。実験レイアウトの例については、以下のSupplementary Figure 1を参照すること。
    注：プレートの側面を軽く叩き、均一に再懸濁させる。
  8. ULAプレートを遠心分離機で350 × gで5分間遠心し、細胞を中心部に集めて細胞間接触を促進させる。
    注：ここに記載以外の細胞株を使用する場合、細胞株によって増殖率やスフェロイド形成率が異なるため、パラメーターの最適化が必要な場合がある。
  9. 初期のスフェロイド形成を促すため、最初の24–48時間はプレートを動かさないようにする。スフェロイドを3日間成熟させ、直径約400 µmに達するようにさせる。
  10. スフェロイドのサイズの均一性を確認する。細胞が均一に再懸濁されていること、およびプレートに歪みがないことを確認する。
    注：サイズの不揃いなスフェロイドがあるプレートは使用しない。各ウェル内でスフェロイドの直径が比較的均一であることを確認する。
  11. スフェロイドの形態を観察する。
    注：良好に形成されたスフェロイドは、縁がはっきりした球状に見える。
  12. 緩い細胞凝集塊ではなく、細胞間接着が強固な成熟スフェロイドを作成する。
  13. 播種密度の向上または形成時間の延長を行う。スフェロイドが緻密でない場合は、播種密度を上げるか、形成時間を延長させる。
  14. 播種密度を下げるか、遠心時間を延長することで、小さな凝集塊が複数形成されるのを最小限に抑える。

8. 生細胞リアルタイムスフェロイドモニタリング

  1. 細胞懸濁液を遠心分離した後、自動ライブセルイメージング装置を備えた37 °Cのインキュベーター（5% CO2、95%湿度）にプレートを移す。
  2. 実験に応じて、スフェロイドのライブセルイメージングのパラメータを設定する。
    注：以下に記載するパラメータは、テストしたすべての細胞株で使用したものである。
  3. 画像取得ソフトウェアにログインする。
  4. 以下のコマンドを選択する：|Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New。
  5. |Select Scan Type|：Spheroidを選択する。|Select the channels of interest|：Phase + Brightfield（スフェロイドの成長を追跡するため）、およびGreen/Red（AAV導入を追跡するため。取得時間はそれぞれ300 msまたは400 ms）を選択する。
  6. 希望の倍率（10x）を選択する。
  7. プレートのモデルと、ドロワー内での位置を選択する。
  8. イメージングを行うウェルの位置と、ウェルあたりの希望画像数を選択する。
  9. 実験の説明（名称、細胞の種類、細胞数）を入力する。
  10. 解析設定では、 Defer Analysis Until Laterを選択する。
  11. タイムラインを右クリックし、 Set Selected Scan Group Intervalオプションを選択する。
  12.  6 hごとにスキャンを追加し、 無期限にスキャンするように設定する。希望の開始時間を設定する（自動イメージング装置内でのインキュベーションから少なくとも1 h後とする）。
  13. イメージングソフトウェアにログインし、毎日スフェロイドの成長を確認する。
  14.  View Recent Scans オプションを選択し、目的の実験をダブルクリックする。画像チャンネルパネルで|Select Brightfield |を選択し、 |Measure image| 機能の ツールを使用して、スフェロイドの直径を測定する。
    注：目的の細胞から緻密なスフェロイドを形成させるには、最適な成熟期間の調整が必要な場合がある。
  15. スフェロイド形成が最適化した日にプレートを取り出し、AAV導入に使用する。

9. AAV導入

  1. AAVセロタイプ3および目的のトランスジェンを購入または製造する。
  2. 490 mLのDMEM培地に10 mLのFBSを添加し、AAV導入用の2% FBS添加DMEM培地を作成する。
    注：カプシドまたはゲノム調節因子のスクリーニングには、代表的な結果のセクションで示されているように、GFPトランスジェンが非常に有効である。目的のAAVを、抗生物質を含まない2% FBS添加DMEM培地で希釈する。
  3. 連続希釈用に指定の96ウェルラウンドボトムプレートで希釈する。
  4. AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、およびAAV9をタイトレーションするため、開始MOIから1:10の希釈系列を作成する。
  5. 以下のSupplementary Figure 2にある実験レイアウトの例を参照すること。考察セクションに示されている通り、AAV導入に必要なMOIを算出する。
  6. 33 µLのAAVストックを297 µLの培地に加え、合計330 µLのMOI 1 × 106液を得る。
  7. 33 µLの液を297 µLの2% FBS添加DMEM培地に加えることで、MOI 1 × 106から始まる10倍段階希釈を行う。
    注：細胞生存率の低下を防ぐため、高濃度のMOIは避けることが推奨される。細胞種やAAVセロタイプによって最適MOIが大きく異なるため、実験条件の最適化が必要な場合がある。すべてのウイルスゲノムが感染性を持つわけではなく、機能的タイターはvg/mLの値と異なる可能性がある。

10. AAVの投与量

  1. マルチチャンネルピペットを用いて、準備済みのスフェロイドプレートからすべての培地を吸引する。
  2. マルチチャンネルピペットを使用し、希釈プレートから目的のMOIの溶液100 µLを処理プレートに移し加える。
  3. プレートをイメージング装置に戻し、72 hにわたって緑色蛍光強度を追跡して、導入のモニタリングを開始する。
  4. 3日以上のモニタリングを行う場合は、栄養を補充するために、3日ごとに1ウェルあたり100 µLの完全DMEM培地を加える。

11. 生細胞イメージング、導入モニタリングおよびデータ解析

  1. 処置群に目的のAAVおよびMOIを添加した後、プレートを機器に戻します。
  2. 6時間ごとに導入効率の記録を開始する。
    注：最適なGFP発現を得るには、通常3〜5日かかります。これは、使用されるプロモーターおよびゲノム構成によって異なります。
  3. 目的の細胞およびレポーター遺伝子に特化した解析定義を作成し、データを解析します。
    注：あるいは、プレートを標準的な37℃の条件下で保持します。 °インキュベーターで培養し、qPCR、ウェスタンブロッティング、またはELISAを用いて導入効率を評価する。
  4. 明視野解析を実行して一次スフェロイドを検出することにより、解析パラメータを定義します。
  5. セグメンテーションパラメータを次のように最適化してください。
    1. 分析タイプ： "スフェロイド明視野像"
    2. セグメンテーション手法： "適応的しきい値"
    3. しきい値範囲：0.3–0.8（最初は自動調整を推奨）
    4. トップハットフィルター：200–500 µm（不均一な照明を除去する）
  6. 明視野パラメータを次のように最適化します。
    1. 代表的な画像をロードする 異なるタイムポイントから。
    2. テスト閾値範囲 （0.2–0.9）で最適検出条件を検討する。
    3. サイズフィルターを調整する 期待されるスフェロイドのサイズ範囲に基づいて。
    4. セグメンテーションの検証 視覚的なオーバーレイ検査により。
  7. AAV導入効率の評価に向けて、以下のようにグリーンチャネルを最適化します。
    1. バックグラウンドレベルの決定 未処理ウェル（MOI=0）の。
    2. 閾値の設定 2–3× 背景ノイズを上回る。
    3. 最も高いMOIで処理したサンプルを用いて試験を行う。
  8. 露光時間の最適化 信号を維持しつつ、飽和を回避するため
    注：AAV導入においては、導入効率の指標として、スフェロイド1個あたりの総蛍光信号を報告してください。

12. データ解析

  1. 背景ノイズではなく画像上の細胞を選択できるように、フィルターとマスクを調整して適切なパラメーターを選択します。
  2. ソフトウェアをトレーニングするための代表的な画像を選択します。
  3. 最適化したパラメーターを、研究内のすべての画像に適用します。
  4. 個々の値またはグループ化した形式でデータを抽出し、さらなるデータ提示のために統計解析システムに転送します。

13. 発症時間の算出

  1. MOIごとの最初のGFPシグナル検出までにかかる時間を算出します。
  2. 未処理ウェル（MOI = 0）の平均値 + 3標準偏差（SD）で補間を行います。
  3. ライブセルイメージングソフトウェアから、各タイムポイントにおける各スフェロイドの緑色蛍光強度を統計ソフトにコピーします。
  4. 繰り返し系の平均を算出します。
  5. 未処理スフェロイド（MOI = 0）を含むすべてのウェルの平均シグナルとSDを算出します。
  6. 非対称シグモイド（5PL）曲線フィッティングを用いて、各MOIのオンセット時間を補間します。
  7. 例として、Table 1では以下の補間値が使用されました：
    1. scGFPの場合： 254,955 (mean) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (interpolation signal)
    2. ssGFPの場合： 2,417,941(mean) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (interpolation signal)

14. 蛍光測定機能付きプレートリーダーを用いて蛍光を測定します。

  1. プレートリーダーに接続されたコンピュータで、蛍光プレートリーダー用ソフトウェアを起動します。
  2. ナビゲート 〜へ ファイル > オープン プロトコルを選択し、プレートの種類（例：96ウェル、384ウェル）を選び、正しいウェルレイアウトが選択されていることを確認します。 
  3. 蛍光検出のインテグレーションタイム（積分時間）を設定します。これにより、リーダーが各ウェルから蛍光を収集する時間が決定されます。
  4. 調整 翻訳するソーステキストをご提示ください。 利得 または 感度 設定
    もし その アッセイ 必要条件 より高い または 下げる 信号 検出
  5. GFPの蛍光パラメータを、励起波長：485 nm、蛍光波長：528 nmに設定します。
  6. ソフトウェアの「Run」をクリックして測定を開始します。
  7. 測定 蛍光 から それぞれ ウェル
    注：ラン終了後、ソフトウェアに生の蛍光値が表示されます。平均値を算出し、バックグラウンドを差し引くことで、グラフを作成することが可能です。
  8. エクスポート 結果 内（に） the 推奨される 形式 （翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文を入力してください。） さらに 解析 または 報告。
    注：サンプルプロトコルが変更された場合は、Fileを使用してください。 > 「名前を付けて保存」を行い、オリジナルを後で利用できるように保持した状態で、固有のバージョンを作成します。

15. 発光トランスジェンの導入

  1. 上述の詳細と同じ播種およびAAV投与プロトコルに従います。
  2. ULAプレートで既に育成したHeLaスフェロイド100 µLに対し、ナノルシフェラーゼ導入遺伝子を搭載したAAV1、AAV2、AAV5、AAV8、およびAAV9を、0–106の範囲の異なるMOIで100 µLずつ添加します。
  3. プレートを通常の37 °Cインキュベーターでインキュベートし、導入後3日目に導入効率を評価します。

16. 生細胞アッセイ検出用の細胞外発光抑制剤および発光基質の調製

  1. 3日目（エンドポイント）に、インキュベーターからアッセイプレートを取り出す。
  2. 細胞に細胞外発光抑制剤と基質を直接添加する。
    注：培地の除去は不要である。
  3. 細胞外抑制剤を−20 °Cの保存庫から取り出し、室温で解凍させる。
  4. 短時間遠心し、チューブの蓋や側壁に付着した液体を集める。
  5. 細胞外抑制剤1 容量と完全DMEM培地14 容量を混合し、必要量の再構成済み15X細胞外発光抑制剤を調製する。
    1. 例えば、実験に1.0 mLの試薬が必要な場合は、933 µL のDMEMに67 µLの抑制剤を添加する。1プレートあたり、1 mLのDMEMを準備し、67 µLの抑制剤を添加する。
  6. ステップ16.5で調製した抑制剤を、滅菌済みの試薬リザーバーに移す。
  7. マルチチャンネルピペットを使用し、AAVを導入したウェルに抑制剤を10 µLずつ分注する。
  8. Live Cell Substrateを−20°Cの保存庫から取り出し、混合する。
  9. 短時間遠心し、チューブの蓋や側壁に付着した液体を集める。
  10. 必要量の再構成済み3.6X Live Cell Reagentを調製する。
  11. 1プレートあたり、4 mLのDMEMを準備し、144 µLの基質を添加する。
  12. ステップ16.11で調製した基質を、滅菌済みの試薬リザーバーに移す。
  13. マルチチャンネルピペットを使用し、AAVを導入した同一のウェルに基質を50 µLずつ分注する。
    注：複数のアッセイプレートを同時に処理する場合は、試薬の量を調整する必要がある。
  14. プレートを室温で300 rpmで5分間振盪する。
  15. 発光検出試薬の添加から2時間以内に、in vivoイメージングシステムを用いてプレートを測定する。
    注：発光強度は2時間かけて徐々に減衰する。

17. 生物発光イメージング

  1. CCDカメラを冷却（−90 °C）させるため、イメージングの少なくとも30分前に生物発光イメージングシステムの電源を入れておく。
  2. プレートがイメージング可能な状態であることを確認する（例：生物発光読み取り用の生細胞イメージング基質が添加されていること）。
  3. 光の反射や散乱を防ぐため、プレートの蓋を取り除く。
  4. 下方からイメージングを行う場合は、プレートの底面を清浄にする。
  5. ステージ上のイメージングチャンバーにプレートを設置する。
  6. カメラの直下にプレートが中央に来るように配置する。
  7. ルミネッセンスのイメージングパラメータを設定する： オート露出にするか、露光時間（通常1–60 s）、ビニング（mediumを推奨）、f値（最大感度を得るために1に設定）を指定する。
  8. 解剖学的参照用の写真を撮影する。
  9. ルミネッセンス画像をキャプチャする。

18. 生物発光イメージングデータの解析

  1. ROIツールを使用して、ウェルまたは関心領域を囲みます。
  2. 比較のため、サンプル間でROIのサイズを一定にしてください。
  3. 生物発光の全光量（photons/second）を測定します。
  4. 放射効率を測定します。
  5. 統計解析のため、データをスプレッドシートにエクスポートします。
  6. 画像ファイルと解析結果を保存します。
  7. プレゼンテーション用に、画像をTIFFまたはJPEG形式でエクスポートします。

結果

本研究では、3DスフェロイドがAAV導入効率の評価、セルフコンプリメンタリー（sc）型およびシングルストランド（ss）型などのベクターゲノム設計の区別、ならびに導入キネティクスの評価のためのツールとして利用可能であることを示します。プロセスの概要をFigure 1. に示します。簡潔に述べると、まず細胞を2D培養で拡大し、超低接着（ULA）プレートに播種してコンパクトなスフェロイドを形成させます（Figure 1A）。次に、プレートを遠心分離して凝集を促進し（Figure 1B）、ライブセルイメージングシステムに移してスフェロイド形成をリアルタイムでモニタリングします（Figure 1C）。3日目に、さまざまなMOIでAAVをスフェロイドに導入します（Figure 1D）。導入キネティクスはライブセルイメージングを用いて経時的に追跡し（Figure 1E）、エンドポイント解析はプレートベースの蛍光または発光読み取りを用いて行います（Figure 1F）。

図2に、6種類の異なる細胞株から作製したスフェロイドの形態を示しており、密度、円形度、形状に幅があることがわかります。すべての細胞株は、実験に使用する前に完全DMEM培地で数代継代して培養しました。細胞が対数増殖期に達した後、HEP3B、HEK293T、A375、HeLa、HEPG2、およびHuh7細胞を回収し、ULAラウンドボトムプレートを用いて、1ウェルあたり10,000 cellsの細胞密度から開始して2倍段階希釈を行いました（プレートレイアウトは付随 図1に、代表的な結果は付随図2に示しています）。スフェロイドのサイズは、スフェロイド構造と優れた導入効率を維持したまま、50 µmまで小さくなる可能性があります。細胞播種後、ULAラウンドボトムプレートを350 × gで5分間遠心分離し、細胞をウェル中央に集積させてスフェロイドへと自己組織化させました。この工程は、自然に凝集しない細胞にとって特に有用です。リンパ球などの凝集耐性が高い細胞の場合、遠心時間を5分から15分に延長することが可能です。良好に形成されたスフェロイドは、HEK293TやHuh7細胞で見られるように、円形でコンパクトな表現型を示しますが、形成不十分なスフェロイドは緩やかに凝集しており、培地交換時に崩壊しやすい傾向があります。

次に、プレートをライブセルモニタリング装置を備えた37 °Cのインキュベーターに移します。本研究で報告した各細胞株におけるスフェロイド形成を評価するため、プレートを6時間間隔で毎日モニタリングします。ほとんどの細胞株では、スフェロイドとして自己組織化するまでに3日間を要します。図2に示すように、播種から3日後、各細胞株は異なる形態学的特徴とさまざまな凝集レベルを示しました。肝細胞株（Huh7、HEPG2、およびHEP3B）は、他の細胞株よりも緻密で密度の高いスフェロイドを形成しました。HEK293Tは、明らかな壊死コアを持つ非常に円形に近い球状の外観を形成した一方で、A375は不規則な形状の細胞凝集体（以前に変形スフェロイドと記載されたもの）を形成しました18,19。これらの形態的な違いは、疾患の病態生理学的状態の指標であると考えられており、2D培養システムと比較した3Dモデルの有用性をさらに支持するものです18,19。このスフェロイド構築プロトコルは、テストした6つの細胞株において高い再現性があり、ここに示すすべての形質導入に適用されました。

細胞濃度、スフェロイド形成時間、および緑色/赤色自家蛍光の状態を最適化した後（以下に記載） 付随図3）、ライブセルイメージングシステムおよびプレートリーダーを用いて、スフェロイドにおけるAAV導入効率の検討を行った（AAVタイトレーションのプレートレイアウト例を～に示す）。 付随図 4). 図3 4種類の異なる細胞株（HEK293T、Huh7、HEP3B、およびHEPG2）に適用した、最適化済みスフェロイドプロトコルを示しています。スフェロイド形成の3日目に、異なるベクターゲノム設計を持ち、GFPでタグ付けされた2種類のAAV2ベクターを、さまざまな感染多重度（MOI）でスフェロイドに導入しました。これら2つのAAV導入遺伝子設計は、高活性（scGFP）および低活性（ssGFP）のGFPバリアントを表しています。細胞への導入後、プレートをライブセルイメージングシステムに設置し、AAV導入をリアルタイムでモニタリングしました。72時間後の時点で、ライブセルイメージングソフトウェアを用いて緑色蛍光強度を検出しました。 図3, 青線はsc-GFPゲノムを、赤線はss-GFPゲノムを表している。スフェロイドはAAV導入に対して高い感受性を示し、sc-GFPでは非常に低いAAVタイターにおいても、また異なる細胞株間においても強い導入が検出された。さまざまな細胞株およびMOIにおけるAAV導入をリアルタイムで撮影した代表的なビデオを以下に示す。 補足動画1, 補足動画2, 補足動画3, 補足動画4, 補足動画5, および 補足動画 6一方で、ssGFP AAVのスフェロイドへの導入はより低いレベルで観察されたが、これはこの種の制御エレメントに予想される、より弱く緩やかな導入を再現している。20,21これは、強力および微弱なAAV導入の両方に対する3Dスフェロイドの有用性に加え、sc-GFPのような強力な導入遺伝子と、ss-GFPのような活性の低い遺伝子との識別における有用性を示すものである。MOI 10において、scおよびssの導入遺伝子間で相対蛍光強度に100倍の差が観察された。6 HEK293T細胞において、およびHEP3Bなどの導入効率の低い細胞株において3倍の差が認められた。

次に、HEK293TスフェロイドおよびHuh7スフェロイドの両方において、さまざまなセロタイプのAAV導入効率を用量依存的に検討しました。図4に示すように、3Dスフェロイドは4種類の異なるセロタイプのAAV-scGFP導入が可能でした。導入から72時間後、蛍光プレートリーダー（図4A,B）およびライブセルイメージングソフトウェア（図4C,D)）を用いてscGFPを測定しました。これら2つの装置を用いて、4種類すべてのセロタイプを検出することに成功しました。正規化後のシグナルに有意な差は見られませんでしたが、ライブセルイメージングシステムは蛍光プレートリーダーよりもS/N比の範囲が広いことが示されました。その結果、両方の細胞株においてAAV2が最も高い導入効率を示し、次いでAAV1であり、一方でAAV5およびAAV9は有意に低い導入効率を示しました。

次に、スフェロイドプロトコルを用いてルミネッセンス導入効率を評価しました。これを検証するため、ここで説明した最適化プロトコルに従ってHeLa細胞を3Dスフェロイドとして培養しました。3日目に、ナノルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする5種類の異なるAAVセロタイプをHeLaスフェロイドに導入しました。AAV導入から72時間後、細胞にLive Cell基質を添加し、室温で5分間インキュベートしました。次に、生物発光イメージングシステムを用いてルミネッセンスの測定およびイメージングを行いました(図 5A)。このシステムを用いることで、すべてのAAVセロタイプで効率的な導入が観察されました。異なるAAVセロタイプ間の導入効率の鋭敏な識別が認められ、本プロトコルが蛍光読み取りのみに限定されないことが示されました。図 5で観察された傾向と一致して、HeLa細胞におけるAAV-ナノルシフェラーゼの導入では、AAV-GFPベクターの結果と同様にAAV2が最も強力なセロタイプであることが示されました。同様に、蛍光およびルミネッセンスベクターの両方において、AAV9セロタイプで最も低い導入効率が観察されました(図 4 および 5)。AAV-ナノルシフェラーゼ導入の代表的な画像を図 5Bに示します。

3Dスフェロイドプロトコルでは、導入効率だけでなく、導入のキネティクス（速度論）的なモニタリングが可能になります。図6 異なるMOI（0-10）で導入した際の、AAV2-scGFPおよびAAV2-ssGFPによる3D HEK293Tスフェロイドの導入キネティクスの代表的な結果を示す。6) (図6A-G）。AAV2-scGFPの導入は、MOIが10という低濃度においても検出可能であることが分かりました。1ライブセルイメージングシステムを用いた結果、未処理の細胞と比較して、約34時間後にGFP信号の増加が検出された。AAV2-ssGFPの信号は、AAV2-scGFPの信号よりも大幅に弱く、かつ緩やかであった。導入速度をさらに比較するため、GFP信号が検出可能になる開始時間を算出した。その結果、scGFPはssGFPよりも平均して4倍速く細胞に導入されることが観察された。個々の開始時間は、〜に報告されている。 表1これらの速度論的測定は、アッセイの最適化に有用な、導入効率の別の側面を示しています。

細胞培養ワークフロー図。IncuCyteを用いたスフェロイド形成、導入、および解析。
図 1: 3D培養を用いたAAV導入の概要。 (A) 細胞を2D培養で増殖させ、超低接着（ULA）プレートに播種してスフェロイドを形成させる。(B) プレートを遠心分離して凝集を促進させ、(C) IncuCyte S3システムに移してスフェロイド形成をリアルタイムでモニタリングする。(D) 3日目に、異なるMOIでAAVをスフェロイドに導入する。(E) 生細胞イメージングを用いて導入キネティクスを経時的に追跡し、(F) プレートベースの蛍光または発光読み取りを用いてエンドポイント解析を行う。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

細胞培養スフェロイドの比較。実験セットアップにおける6種類の異なる細胞株の顕微鏡画像。
図 2: 複数細胞株におけるスフェロイドの形態学的特性解析。HEP3B、HEK293T、A375、HeLa、HEPG2、およびHuh7細胞から作製したスフェロイドの代表的な画像は、サイズ、形態、および緻密さに変動があることを示しているが、反復試行間で高い再現性を示している（スケールバー、50 µm）。すべての細胞株は1 x 104 cells/wellで3日間播種された。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

GFP標識細胞における遺伝子発現解析。MOI対蛍光強度、複数細胞株、グラフ、画像。
図 3: 各種細胞株におけるセルフコンプリメンタリー（scGFP）およびシングルストランド（ssGFP）ベクターのAAV導入効率の比較。(A>) HEK293T、(B>) Huh7、(C>) HEP3B、および(D>) HEPG2の3Dスフェロイドを自己構築し、異なるMOIのAAV2-scGFP（青）およびAAV2-ssGFP（赤）を導入した。導入後72時間で全緑色蛍光強度を定量化した。ライブセルイメージングシステムを用いて、各AAVの最高MOIで処理したスフェロイドの72時間時点における代表的な画像を示している。スケールバーは200 µmを表す。エラーバーはSDを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

HEK293TおよびHuh7細胞におけるAAVセロタイプ別の蛍光強度グラフ。MOIおよび時間を変数とする。
図4: 3DスフェロイドにおけるAAV導入により、異なるAAVセロタイプの活性が区別される。(A,C>) HEK293Tおよび(B,D>) Huh7由来の3Dスフェロイドに、さまざまなMOIでAAV1、AAV2、AAV5、AAV9のscGFPトランスジーンを導入した。蛍光強度単位を、蛍光プレートリーダー(A,B>)およびライブセルイメージングシステム(C,D>)を用いて72 hで測定した。エラーバーはSDを示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

AAV導入効率のグラフとヒートマップ。MOI対総フラックス。ウイルスベクター解析。
図 5: 発光レポーターを用いた3DスフェロイドにおけるAAV導入。HeLaスフェロイドに、ナノルシフェラーゼレポーター外来遺伝子をコードするAAV1、AAV2、AAV5、AAV8、およびAAV9を、MOIを段階的に上げて導入した。導入後72時間、発光イメージングシステムを用いたエンドポイント読取により、発光を可視化し測定した。（A）総フラックス値。（B）スフェロイドプレートの発光イメージによる代表的なエンドポイント読取の結果は、MOIおよびセロタイプ間での信号分布を示している。各AAVベクターは、水平方向に2つのレプリケートで実施した。エラーバーはSDを表す。こちらのリンクから、この図の拡大版を表示できます。

遺伝子発現解析；MOI対時間のグラフ；sgGFP蛍光強度；実験結果。
図 6: 3Dスフェロイドにおける導入キネティクス評価。HEK293Tスフェロイドに、7段階のMOI範囲でAAV2-scGFP（青）およびAAV2-ssGFP（赤）を導入した（A–G）。Monitor spheroid formation/growth systemを用い、72時間の期間にわたって6時間間隔で全緑色強度を測定した。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

MOIscGFP (時間)ssGFP (時間)
1>72hrs>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

表1：GFP検出の開始時間。

補足図 1： スフェロイド滴定用のプレートレイアウト。 (A) 10,000から78 cellsの範囲の初期播種密度から作製された、HEK293T、Huh7、HEP3B、およびHEPG2スフェロイドの希釈スキームを示す代表的なプレートレイアウト。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

付随図 2： さまざまな播種密度におけるスフェロイド形成。 10,000から78個の範囲の初期播種密度から作製された、3日目のHEK293TおよびHuh7スフェロイドの代表的な顕微鏡画像。スケールバーは50 µmを示す。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図 3： 3Dスフェロイド形成に使用した細胞株の情報。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図4：AAV連続希釈のプレートレイアウト。 (A) AAV1、AAV2、AAV5、およびAAV9に使用した、MOI 106から開始するAAV連続希釈スキームを示す代表的なプレートレイアウト。行Hに示されているのは、未処理のスフェロイドである陰性対照である。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足動画 1： MOI 106におけるHEK293TスフェロイドへのAAV2-scGFP導入のリアルタイムライブセルイメージング。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足動画 2： MOI 106におけるHuh7スフェロイドへのAAV2-scGFP導入のリアルタイム生細胞イメージング。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足動画 3： MOI 106におけるHEP3BスフェロイドへのAAV2-scGFP導入のリアルタイム生細胞イメージング。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足動画 4： 用量依存性試験の一環として、MOI 106でHEK293TスフェロイドにおけるAAV2-scGFP導入をリアルタイムライブセルイメージングで観察した様子。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足動画 5： MOI 104におけるHEK293TスフェロイドへのAAV2-scGFP導入のリアルタイム生細胞イメージング。ここをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足動画 6： MOI 101におけるHEK293TスフェロイドへのAAV2-scGFP導入のリアルタイム生細胞イメージング。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 1：AAV トランスダクションに必要な MOI の算出。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本稿では、AAVの開発および力価試験のための効率化されたin vitro 3Dプラットフォームを提示します。このプラットフォームは、ヒト組織の構造をより密接に模した三次元細胞培養を用いることで、形質導入の強化、高感度化、および翻訳予測性の向上を実現しています。本システムは、複数の細胞株において、シングルストランドおよびセルフコンプリメンタリーベクターを含む、AAVセロタイプや調節エレメント間の形質導入効率の差を正常に識別することに成功しました。なお、形質導入効率を導入遺伝子陽性細胞の割合として定義することが多い従来の2Dアッセイとは異なり、3Dスフェロイドシステムでは単一細胞レベルでの定量が容易ではないことに留意してください。したがって、本研究における形質導入効率は、導入細胞の割合と細胞あたりの導入遺伝子発現レベルの総合的な寄与を反映する、バルクのレポーター信号強度（蛍光または発光）として定義しています。スフェロイドの高い感度により、必要となる産物量を大幅に削減でき、AAVの研究開発においてコスト効率が高く、汎用性があり、生理学的に妥当な手法となります。

このアプローチは、従来の2D細胞培養アッセイにおける主要な課題を解決します。従来の2Dアッセイは人工表面への接着に依存しており、細胞組織化が不十分であるため、臨床現場におけるベクターの性能予測の精度が低くなる可能性があります 。3Dスフェロイドシステムは組織構造や薬物分布パターンをより適切に模倣できるため、実際の生物学的条件により近いベクター挙動のデータを提供します22,23。本プロトコルでは簡便な超低接着プレートを使用するため、標準的な研究室環境で容易に再現可能です。

この適応性の高いシステムは、AAVの中和試験やAAVの浸透研究、さらに異なる細胞環境がAAVの形質導入に及ぼす影響を調べるための、より複雑な共培養実験の開発に利用できる可能性があります。加えて、ハイスループットな薬剤およびベクターのスクリーニングプラットフォームをこのスフェロイドプラットフォームに容易に統合できるため、より標的を絞った製品開発に向けたベクター探索ワークフローの自動化とコスト削減が可能になります。

スフェロイドの大きな実用的利点は、細胞の継代なしに数週間にわたって連続的に成長させることができるため、AAV活性の長期的な研究が可能になることです。この安定した培養システムは、重要な細胞間相互作用とマトリックス成分を維持し、2D培養で必要となる繰り返し細胞回収による中断を回避します24。維持された細胞環境は、AAVの細胞への結合および侵入を評価するために不可欠な、天然のタンパク質組織化と膜構造をサポートします25。

3DスフェロイドはAAV導入効率の評価において大きな可能性を示していますが、天然組織と比較して構造が簡略化されているため、in vivo モデルと比較すると翻訳上の欠点もいくつか存在します。スフェロイドには、ベクター輸送を担う血管系、免疫原性を評価するための免疫細胞、および血液脳関門のような組織特異的なバリアなど、AAVの性能に大きな影響を及ぼし得る重要な生理学的構成要素が欠けています26。これらの制限は、スフェロイドが従来の2D培養とin vivo動物モデルの中間的な複雑さを提供しているものの、包括的なAAV評価に必要な生理学的微小環境を完全に再現するには不十分であることを示しています。

ここで提示するスフェロイドのプロトコールは、一度に1種類の細胞を用いる方法について記述しています。このプロトコールを拡張して、基本的な三次元構造へと凝集する2〜3種類の追加細胞を含めることも可能です。オルガノイドやマイクロ流体デバイスなどのより複雑な3Dモデルは、組織のようなパターンで配置された10種類以上の異なる細胞を含み、特定の臓器の細胞多様性と組織化を再現する多細胞システムです。このような高度な3Dオルガノイドには、多種の細胞27、ハイドロゲル埋蔵培養、吊垂滴法、およびマイクロ流体プラットフォーム11,27,28が含まれます。これらの手法は、AAV生物学の理解をさらに深めるのに役立つより複雑な組織構築を可能にしますが、より専門的な試薬や装置、および相当な技術的専門知識を必要とする傾向があります。一方で、超低接着プレートで形成される3Dスフェロイドは大幅に簡便であり、コスト効率と再現性に優れているため、多くの研究室に適しています。

本プロトコルを適切に実施するための重要なステップには、高い細胞生存率の維持が含まれます。細胞の状態が悪化すると、スフェロイドの形成や導入効率が損なわれる可能性があるためです。また、スフェロイドの凝集性を高めるには、超低接着プレートの使用と遠心分離の最適化も極めて重要です。弱いシグナルや飽和を避けるためには、細胞種およびAAVセロタイプごとにMOIを最適化することが不可欠です。さらに、適切な検出方法の選択も重要であり、特にキネティック解析においては、連続的なライブセルイメージングシステムとの互換性が求められます。3DスフェロイドにおけるAAV導入を正確に解釈するためには、いくつかの技術的な検討事項が重要となります。

導入シグナルが弱い、あるいは認められない場合は、ウイルスタイターの低さ、不適切なMOI、またはインキュベーション時間の不足が原因である可能性があり、これらはウイルスタイターの確認、MOIの最適化、およびインキュベーション時間の延長（通常3～5日間）によって対処できます。蛍光または発光シグナルが弱い場合は、トランスジーンの発現レベルが低いか、3D構造内への試薬の浸透が不十分であることが考えられ、露光設定の最適化や基質の拡散に十分な時間をかけることで改善できます。HeLa細胞などの特定の細胞株における大きな課題は自己蛍光であり、これにより蛍光ベースのアッセイにおいて背景シグナルが高くなり、感度が低下することがあります。この制限に対処するため、我々は発光ベースのnanoluciferaseレポーターシステムを導入しました。これにより、S/N比が向上し、自己蛍光のある背景下でもより正確な導入検出が可能になります。さらに、不適切な閾値設定や培地由来の蛍光によって背景シグナルが生じることがあるため、未処理のウェル（MOI = 0）を用いてベースラインを定義し、制御する必要があります。最後に、高いMOIでは、過剰なウイルス量または検出器の限界によりシグナルの飽和が起こる場合があります。これは、MOIの範囲を狭め、検出器の露光設定を最適化して、測定値を線形ダイナミックレンジ内に維持することで軽減できます。

全体として、この3Dスフェロイド手法は、AAVの形質導入、効力、およびキネティクスを評価するための効率的で再現性のあるシステムを提供します。従来の2Dアッセイとin vivo研究のギャップを埋めることで、より的確なベクター開発を可能にし、臨床的に意義のある遺伝子治療戦略の進展を支援します。

開示事項

著者に開示すべき事項はありません。

謝辞

著者らは、AAV nanoluciferase製造用プラスミドおよび生細胞用基質試薬を提供してくださったMorten Seirup氏とTrish Hoang氏に感謝いたします。本プロジェクトは、米国エネルギー省とFDAの間の機関間協定に基づき、Oak Ridge Institute for Science and Educationが運営する、米国食品医薬品局（FDA）CBERでのORISE Research Participation Programへの任命により支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
37℃インキュベーターThermoFisher Scientific#51025983標準的な培養条件
A375細胞ATCCCRL-1619細胞株
AAV1プラスミドAddgene112862AAVプラスミド
AAV2プラスミドAddgene104963AAVプラスミド
AAV5プラスミドAddgene104964AAVプラスミド
AAV8プラスミドAddgene112864AAVプラスミド
AAV9プラスミドAddgene112865AAVプラスミド
BioTek GEN5 プレートリーダーAgilent Technologies該当なし蛍光または発光のエンドポイント読み取り
遠心分離機ThermoFisher Scientific#TSO-MX1Rスフェロイド懸濁液の維持
Corning™ 細胞培養用リン酸緩衝生理食塩水 (1X)Fisher Scientific#MT21040CMX細胞洗浄用PBS
高グルコースDMEM、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸ThermoFisher Scientific#10569010完全増殖培地
細胞外NanoLuc阻害剤 PromegaN235BあらゆるNanolucを消光する® 細胞外環境から届くシグナル  
ウシ胎児血清 (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mL成長因子を添加する
HEK293T細胞ATCCCRL-3216細胞株
HeLa細胞ATCCCRM-CCL-2細胞株
HEP3B細胞ATCCHB-8064細胞株
HepG2細胞ATCCHB-8065細胞株
Huh7細胞エージェントベースモデルT8973細胞株
IncuCyte S3 倒立顕微鏡Sartorius提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。スフェロイドの形成および成長のモニタリング
IVIS Spectrumイメージングシステムスペクトル・インビボ該当なしルミネッセンスのエンドポイント読み取り
Nano-Glo® 生細胞アッセイ PromegaN2013生細胞検出用ルミネッセンス基質試薬
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122細菌汚染の防止
通気孔付きT75組織培養フラスコFisher Scientific#NC0509296 細胞培養用フラスコ
トリプシン-EDTA (0.05%)ThermoFisher Scientific#25300120細胞の酵素的剥離
超低接着プレートCorning#7007スフェロイド形成を促進するための細胞接着の防止

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