変形性関節症患者の膝蓋下脂肪パッドから細胞外小胞の単離および特徴付け

Summary

概要 本プロトコルは、変形性関節症患者の膝蓋下脂肪パッド組織から小さな細胞外小胞(sEV)を分離し特徴付けるための標準化されたワークフローを提供します。

Abstract

細胞外小胞(EV)、特に200 nm未満の小胞と定義される小さな細胞外小胞(sEV)は、細胞間コミュニケーションの重要な媒介者として機能し、ほぼすべての細胞タイプからさまざまな生物体液に放出されます。膝蓋骨下脂肪パッド(IPFP)は、膝の変形性関節症(OA)の発症と進行と密接に関連しています。しかし、IPFPエクスプラントから直接sEVを分離する標準化された方法は限られています。OA患者から得られたIPFP組織から得られるsEVの分離および特性評価のための再現可能なプロトコルを提示します。IPFP組織培養から採取された調整培地は、低速遠心分離で細胞や残骸を順次除去し、その後超遠心分離でsEVサイズ範囲内の小胞を濃縮します。得られた小胞は、細胞外小胞(MISEV2023)推奨の研究に最小限の情報に基づいて特徴付けられ、代表的なタンパク質マーカーを異なる機能カテゴリーにまたがって特徴付けられます。CD63は膜関連テトラスパニン、ALIXおよびTSG101は内体選別複合体輸送必需(ESCRT)機構による生合成に関与する細胞質タンパク質、Calnexinは潜在能力を監視するための小胞体常在タンパク質として非小胞性汚染。このワークフローにより、変形性関節症研究における機能的アッセイやプロテオミクスプロファイリングなどの下流応用に適した明確なsEV調製が得られます。

Introduction

小さな細胞外小胞(sEV)は、国際細胞外小胞学会(ISEV)が提案した最小限の研究情報(MISEV2023)ガイドラインで提案された操作分類によれば、細胞外小胞の異質な亜型であり、通常直径200 nm未満の小胞を指します.sEVはほぼすべての細胞タイプから生体液に放出され、生理学的および病理学的文脈における細胞間コミュニケーションの媒介者として重要な役割を果たすため、注目が高ま^{っています。}

sEVの膜は複数の機能タンパク質で濃縮されています。その中でも、CD63のようなテトラスパニンは小胞膜の組織化や融合に関与^{しています。}さらに、輸送に必要な内体ソーティング複合体(ESCRT)に関連する細胞質タンパク質、例えばALIXやTSG101は、sEVの生合成と分泌に不可欠な役割を果たします。したがって、これらは孤立した小胞のエンドソーム起源を確認する信頼できるマーカーとして機能^します。

膝蓋下脂肪パッド(IPFP)は、変形性関節症(OA)の発症と進行に密接に関連する活発な関節関連組織として認識されています^7,8。炎症性および変性性条件下では、IPFP由来のsEVが炎症性メディエーターおよび病原性シグナルを運び、滑膜炎症および軟骨劣化に寄与すると仮説されています⁹。したがって、OA患者からIPFP組織から放出されるsEVの特徴付けは、疾患に関連する細胞間コミュニケーションネットワークに関する重要な洞察をもたらす可能性があります。

分子媒介因子および治療薬としてのSVへの関心が高まる中、高収率・高純度かつ再現性の高い分離アプローチの確立が不可欠です。差動超遠心法は依然として最も広く使われている精製手法^{の一つですが、}細胞培養上清液やバイオフルイドに最適化されたプロトコルは、IPFPのような固形脂肪由来組織に直接適用できない場合があります。高い脂質含有量、密度の高い細胞外マトリックス、そして変化する酵素的消化条件は、小胞の回復と純度に影響を与えることがあります。

組織外植培養は、生来の細胞構造と細胞間相互作用を保存しつつ、過剰な酵素的撹乱を最小限に抑える生理学的に関連性のあるアプローチを提供し、ほぼ在来条件下で放出されたsEVの収集を可能にします。しかし、IPFPエクスプラント培養からsEVを分離するために特別に特化した標準化されたワークフローは現時点で不足しています。

ここでは、変形性関節症患者の変形性関節症患者の乳突下脂肪パッドエクスプラント培養から、差異超遠心法を用いて小さな細胞外小胞を分離・特徴付けるステップバイステッププロトコルを説明し、下流の機能的およびトランスレーショナル研究のための再現性のある方法論的枠組みを提供します。

Protocol

本研究における変形性関節症患者のIPFP組織の使用は、河北医科大学第一病院の倫理委員会により承認されました(承認番号:[2024] 018).サンプル採取は承認された期間内に行われ、組織採取前に全参加者から書面によるインフォームド・コンセントを取得しました。

1. 培地と溶液の調合

1. 基礎DMEM/F12培地445 mL、エクソソームフリー胎児用牛血清50 mL(10%)、ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB(それぞれ100 U/mL、100 μg/mL、0.25 μg/mL)を混合して、エクソソーム欠乏完全DMEM/F12培地500 mLを調製します。0.22μmフィルターでフィルターを殺菌します。
2. ウェスタンブロットランニングバッファーは、蒸留水950mL(dH_2O)と20倍ランニングバッファー50mL(Tris/MOPS/SDS)を混合して準備します。
3. ウェスタンブロットトランスファーバッファーを、800 mLのdH₂Oと100 mLの10xトランスファーバッファーおよび100 mLの絶対エタノールを混合して準備します。
   注:この急速転送バッファーは、室温での高電流湿式転送(400 mA)に特化して最適化されています。発熱が低いため、45分未満の輸送期間には氷浴は不要であり、10〜250 kDaの範囲のタンパク質に対して高い輸送効率を維持することが示されています。
   注意:絶対エタノールは可燃性です。換気の良い場所で取り扱い、熱源から離れてください。
4. 洗浄バッファーは、pH 7.5–7.6の20 x TBS(200 mM Trisおよび3 M NaCl)を50 mLと、Tween-20 20 mLと950 mLのdH₂Oを混合して準備します。
5. ルミノール/増強剤溶液と過酸化水素バッファーを等量混合して化学発光作業液を準備します(膜1平方センチメートルあたり約0.1mLの作業液が必要です)。
   注意:化学発光基材は刺激になることがあります。手袋と目の保護具を着用してください。化学廃棄物は地域の機関規制に従って処分してください。

2. IPFP組織の調製および調製培地の収集

1. 新たに採取したIPFP組織(約10g)を、遠心分離機管内で優しく手動攪拌して、1回の洗浄につき50mLのプレ冷却PBSを3回洗い、残留血液を徹底的に除去します。
2. IPFP組織を2mm x 2mm x 2mmの程度の破片に無菌ハサミかメスで細かく刻みます。
3. IPFP組織片をT175フラスコに移します。エクソソームが枯渇したDMEM/F12完全培地50 mLを加えます。37°Cで5%のCO₂を含み、48時間、優しく攪拌して培養します。
4. DMEM/F12の完全培地(すなわち調整培地)を氷上の50mLチューブに採取します。組織の破片を除去するために70μmのストレーナーでろ過します。

3. 差動超遠心分離によるsEVの分離

注意:以下のすべての手順は4°Cまたは氷の上で行ってください。

1. 組織の破片を除去するための初期低速遠心分離
   1. 調温された培地を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上澄液を慎重に採取し、新しい50mL遠心分離機チューブに移します。
   2. 上清液を3,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上澄液を採取し、新しいチューブに移し、ペレットが乱されないようにします。
2. 中間遠心分離とろ過。
   1. 上澄液を10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
   2. 上清液を採取し、0.22μmの真空フィルターでろ過して、より大きな小胞や汚染物質を除去します。
3. 最初の超遠心分離:sEVペレット。
   1. ろ過した上澄液を40 mLのポリカーボネート遠心分離機管に移します。
   2. 110,000 x g で4°Cの定角ローター(kファクター=70)を用いて70分間、試料を超遠心分離します。ピペットで上清液を慎重に除去します。
   3. ペレットを10mLの予備冷却された滅菌PBSに再懸浮させます。再懸濁液を0.22μmのシリンジフィルターでろ過し、残った骨材を除去します。
4. 第2回超遠心分離:sEV精製
   1. 固定角度ローター(kファクター=70)を用いて、110,000 x g で4°Cで70分間懸吊を再度超遠心分離します。
   2. 上澄液は慎重に捨て、sEVペレットはチューブの底に残します。最終的なsEVペレットを200μLの滅菌PBSで再懸浮します。
   3. 繰り返しの凍結融解サイクルによる損傷を防ぐため、sEVサスペンションを20μLの分割に分けてください。アリクォートは長期使用のために-80°Cで保存してください。

4. ウェスタンブロット解析によるsEVの特徴付け

1. sEVタンパク質サンプルを準備してください。
   1. sEVペレット(ステップ3.5.2のもの)をプロテアーゼ阻害剤を補足した80–120μLのRIPA溶解バッファーと混合します。
      注意:推定タンパク質0.5〜1.0μgあたり約1μLのRIPAバッファー比率を目指してください。ウェスタンブロット解析時の効率的な電気泳動分離と高品質なシグナル検出を確保するために、最終タンパク質濃度は少なくとも1.0 μg/μLが推奨されます。
      注意:RIPAバッファーには洗剤や刺激物が含まれています。個人用防護具を使いましょう。
   2. 混合物を短時間ボルテックスし、サンプルを氷の上で15〜30分間ゆっくり揺らしながら孵化させます。
      注意:この段階での徹底的な混合は、膜の完全な破壊と最適なタンパク質放出のために非常に重要です。不十分な渦巻きは、不完全な溶解や複製間でのタンパク質濃度の不均一を引き起こす可能性があります。
   3. 溶解液を12,000〜14,000 x g で遠心分離し、10〜15分間処理します。上澄液を慎重に採取してください。
   4. 高感度ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイを用いて、sEV解体の総タンパク質濃度を測定します。
      注:細胞外小胞サンプルでは、検出範囲が小さい(0.5–20 μg/mL)により高感度BCAアッセイが推奨されており、精製されたsEV製剤から得られる通常低いタンパク質濃度を正確に定量できます。キットプロトコルに従ってアッセイを行いましょう。
2. ウェスタンブロット分析。
   1. タンパク質サンプルを5×SDS-PAGサンプルローディングバッファーと混合します。
      注:CD63検出には、還元しない5倍ローディングバッファー(βメルカプトエタノールなし)を用いてサンプルを準備し、70°Cで10分間培養してください。これらの条件は立体構造的なエピトープを保存し、このテトラスパニンタンパク質の熱誘発的な集合を防ぎます。ALIX(ALG-2相互作用タンパク質X)、TSG101(腫瘍感受性遺伝子101)、Calnexinなどの他のマーカーについては、10%β-メルカプトエタノールを含む還元5倍ローディングバッファーを用いてサンプルを準備し、95°Cで5分間加熱して完全なタンパク質変性を確保します。
   2. 準備済みのサンプル(通常は総タンパク質の20〜40μg)をプレキャスト勾配ゲル(4%〜12%)にロードします。
   3. 製造元の推奨に従って、タンパク質分子量マーカーを割り当てられた井戸に注入します。
   4. ゲルをランニングバッファーに100Vの一定電圧で流します。
   5. 1〜1.5時間、またはローディング染料がゲルの底に到達するまで続けます。
      注:稼働時間は電気泳動系やゲルの割合によって異なる場合があります。
   6. 400 mAの湿式トランスファーシステムで30分間、ゲルからPVDF膜へタンパク質を移します。
      注意:転送時間は使用される転送バッファーのブランドによって異なる場合があります。
   7. タンパク質を含まないブロッキングバッファーで、0.2%トゥイーン-20(TBS-T)を含むトリスバッファーで、室温で30分間優しく攪拌しながらブロッキングします。ブロッキングバッファーは血清タンパク質、ビオチン、リン酸化タンパク質を含まず、非特異的結合や背景干渉を最小限に抑えるために配合されています。
   8. タンパク質ベースの安定剤と抗体保存添加剤を含む血清フリー抗体希釈バッファーで希釈した特異的一次抗体を4°Cで1晩(12〜16時間)穏やかに攪拌しながら培養します。
   9. 膜を洗浄バッファー(TBST、0.2%トゥイーン-20を含む)で、シェーカーで優しく攪拌しながら洗います。
   10. 適切な二次抗体を室温で1時間、穏やかに攪拌しながら培養します。
   11. 洗剤バッファーで再度洗い、シェーカーで優しく攪拌します。
   12. 化学発光基質を使ってタンパク質バンドを視覚化します。
       注意:化学発光基質は皮膚や目に刺激を与えることがあります。適切な手袋と安全メガネを着用してください。基質は施設の有害廃棄物ガイドラインに従って処分してください。

5. ナノ粒子追跡解析(NTA)によるsEVの特徴付け

1. 製造元の指示に従ってナノ粒子追跡解析装置とシリンジポンプモジュールを起動し、測定前にシステムを少なくとも30分間平衡させます。
2. EVサンプルを氷の上で優しく解凍し、無菌で粒子を含まないリン酸塩緩衝生塩水(PBS)で希釈して、推奨される測定範囲(約1×10⁸ 〜1×10⁹ 粒子/mL)内で最適な粒子濃度を達成します。
3. 希釈したサンプル1 mLを滅菌シリンジに注入し、気泡が入らないようにゆっくりと測定チャンバーに注入します。
4. カメラのレベルとピントを調整して、ブラウン運動を示す個々の粒子を明確に視覚化します。
5. シリンジポンプを使って、一定流量条件下で各サンプルに60秒の動画を3本録画し、粒子分布の均一性を確保します。
6. NTAソフトウェアで検出閾値を12、ぼかしサイズを自動、最大ジャンプ距離を自動に設定して録画動画を解析します。
7. ソフトウェアの自動分析機能を使って粒子のサイズ分布と濃度プロファイルを生成します。
8. 生データ、粒子サイズ分布グラフ、濃度測定値をエクスポートして、さらなる統計解析に用いてください。
9. 測定チャンバーを無菌無粒子水で徹底的に洗浄し、その後70%エタノールを注入し、再び無菌粒子無添加水で洗浄してサンプル間の交差汚染を防ぎます。

6. 透過電子顕微鏡(TEM)によるsEVの特徴付け

1. カーボンコーティングされた200メッシュの銅グリッドを使用してください。利用可能な場合、グロー放電システムを用いてグリッドに30秒間グロー放電を行います。
2. 無菌でろ過されたPBSに再懸浮した10μLのsEV懸濁液をグリッドに塗布し、室温で2〜5分間培養します。
3. 余分な液体は、フィルターペーパーでグリッドの縁に優しく触れて拭き取ります。
4. グリッドを洗うには、サンプルを含んだ表面を3滴の超純水の上に順番に置きます。
5. 2%リン酸溶液(pH 7.0)を10 μLのグリッドに塗布し、室温で1〜2分間培養します。
   注意:リン酸は腐食性の酸性試薬であり、皮膚、目、呼吸器に刺激を引き起こす可能性があります。適切な個人用防護具(手袋や目を保護するなど)を着用し、施設の安全ガイドラインに従って取り扱ってください。承認された有害化学廃棄物の手順に従って、染色廃棄物や汚染物質を処分してください。
6. フィルターペーパーで余分な染みを落とし、グリッドを室温で少なくとも10分間完全に自然乾燥させます。
7. 80 kVの加速電圧で動作する透過電子顕微鏡を使ってグリッドを観察します。
8. 適切な倍率で代表的な画像を取得し、小胞の形態を評価します。

Results

ヒト膝蓋下脂肪パッド(IPFP)組織から小さな細胞外小胞(sEV)を多モード特性解析により成功裏に分離することが確認されました。

透過電子顕微鏡(TEM)により、分離された小胞は特徴的なカップ状の形態と明確に定義された脂質二重層膜を示し、sEVの構造的特徴と一致していることが明らかになりました(図1)¹¹。

図1:小さな細胞外小胞(sEV)の透過電子顕微鏡(TEM)。 ...

Discussion

このプロトコルは、ヒト膝蓋下脂肪パッド(IPFP)組織から小型細胞外小胞(sEV)を分離するための再現性が高く実用的なワークフローを提供します。これは、エクスプラント培養と差別超音波遠心分離を用いて行われます。分離された小胞は、透過電子顕微鏡(TEM)、ナノ粒子追跡解析(NTA)、確立されたEVマーカーのウェスタンブロット検出などの補完的な特性評価手法によって検証されました^。TEMは特徴的な形態を持つ膜結合小胞の存在を確認し、NTAはsEV集団と一致するサイズ分布を示し、ウェスタンブロット解析ではCD63、Alix、TSG101の存在が確認され、Calnexinの不在が確認され、細胞内小器官からの汚染は最小限であることが示されました。これらの発見は、構造的に健全かつ分子的に検証されたIPFP組織から分離するこのプロトコルの有効性と信頼性を示しています。

このプロトコルの重要な方法論的特徴は、酵素的消化ではなく組織エクスプラント培養を用いてEV採取を行うことです。コラー...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 mL PET遠心分離機チューブ	ヒマック(エッペンドルフ・ヒマック・テクノロジーズ)	5720411148	ポリエチレンテレフタレート、26 x 90 mm
70 & micro;m セルストレーナー	北京蘭傑克科技	560049	組織デブリ除去のために
アンチアリックス抗体	上海アブウェイズ・バイオテクノロジー	CY7215	sEV陽性マーカー
抗カルネキシン抗体	上海アブウェイズ・バイオテクノロジー	CY5839	陰性マーカー(ER汚染)
抗CD63抗体	アフィニティ・バイオサイエンス	DF2305	テトラスパニンマーカー
抗TSG101抗体	上海アブウェイズ・バイオテクノロジー	5985年暦	sEV陽性マーカー
BCAタンパク質アッセイキット	上海亞美バイオテクノロジー	ZJ102	タンパク質定量のために
細胞培養フラスコ(T175)	NESTバイオテクノロジー	560229	IPFPのエクスプラント培養のために
遠心分離機チューブ(50 mL)	バイオファイル	560041	初期の低速ステップについて
エクソソーム枯渇胎児牛血清	サイアゲン・バイオサイエンス	FBSNE-01061	組織培養用
HRPヤギ抗ウサギIgG	上海アブウェイズ・バイオテクノロジー	AB0101	WBの二次抗体
即時タンパク質ローディングバッファー(変性、還元、5回)	上海亞美バイオテクノロジー	LT101	タンパク質変性のために
マイクロBCAタンパク質アッセイキット	サーモ・サイエンティフィック	23235	タンパク質定量のために
Millex-GPフィルターユニット(0.22 & micro; m)	北京蘭傑克科技	560360	無菌、小胞ろ過用
ナノ粒子追跡アナライザー	マルバーン・パナリティカル	ナノサイト NS300	サイズおよび濃度解析のために
オムニフラッシュ氷なし迅速転送バッファ	上海亞美バイオテクノロジー	PS201S	ウェスタンブロットタンパク質転送のために
リン酸(2%)	シグマ・オルドリッチ	P4006	TEMネガ染色の場合
タンパク質ローディングバッファー(変性、非還元、5&倍)	上海亞美バイオテクノロジー	LT103	タンパク質変性のために
タンパク質フリー迅速ブロッキングバッファー(5×)	上海亞美バイオテクノロジー	PS108	では、膜をブロックします。
RIPA溶解バッファー	北京ソーラーバイオ科学技術有限公司	R0010	sEVタンパク質抽出のために
TBS(20回以上)	北京ソーラーバイオ科学技術有限公司	T1080	洗浄バッファーの準備用
透過電子顕微鏡	日立	HT7800	形態的特徴付けのために
Tris/MOPS/SDS電気泳動バッファ	上海亞美バイオテクノロジー	PS120	タンパク質分離のために
トゥイーン-20	北京ソーラーバイオ科学技術有限公司	T8220	洗浄バッファーの準備用
超遠心分離機	ヒマック(エッペンドルフ・ヒマック・テクノロジーズ)	CP100NX	高速絶縁システム
超高感度化学発光検出キット	上海亞美バイオテクノロジー	SQ201	タンパク質バンドの可視化のために
ユニバーサル抗体希釈バッファー	上海亞美バイオテクノロジー	PS119L	一次抗体/二次抗体について