ラットにおける中脳動脈の選択的かつ永久的な閉塞:運動記憶および空間記憶障害の研究における実験的アプローチ

サマリー

本研究の目的は、ラットにおける頭蓋切除術と選択的中大脳動脈閉塞を恒久的かつ選択的に行う再現可能な方法を確立し、運動記憶および空間記憶障害の実験研究に応用することでした。

要約

臨床的に重要な意義を持つ虚血性脳卒中(IS)は、新規補助療法の開発を可能にする実験的アプローチを必要としています。脳の血管解剖学が人間に似ているため、ラットはISの実験モデルとして広く用いられています。しかし、選択的動脈閉塞を優先したアプローチで、人間により近い虚血環境を生成できる方法の必要性は依然として存在します。この文脈で、本研究の目的は、ラットにおける頭蓋切除術の後に中大脳動脈(MCA)の永久的かつ選択的閉塞を行う再現可能な方法を確立し、モデルを標準化し、運動記憶および空間記憶障害の研究における応用における技術的課題を減らすことでした。ウィスターラット(N=28)は、頭蓋切除術のみ(SHAM)を受けるグループと、選択的MCA閉塞(MCAO)を受けた2つのグループに均等に分けられました。術後7日目と8日目には、それぞれ姿勢検査と物体位置認識記憶テストが実施されました。安楽死後、脳標本を採取し、ニッスル染色した組織学的切片が準備されました。この方法の実現可能性と有効性を示すため、術前準備、麻酔、体位調整、頭蓋切除術、MCAO、閉鎖を含む詳細な手術プロトコルが策定されました。適用された方法では、姿勢テスト(p = 0.015)および物体位置認識記憶テスト(p < 0.001)でMCAO群に欠陥が示されました。組織学的解析により、外嚢に加えて外包皮質だけでなく、海馬に関連する領域(外包皮質)、内嗅皮質、梨状皮質に関連する損傷が認められ、より深い脳構造は保存されました。このプロトコルは、ラットにおける選択的MCA虚血を誘発する再現性かつ効果的な方法であることが証明され、虚血性脳卒中の病態生理学的および治療メカニズムを調査する実験研究において有効かつ技術的にアクセスしやすいツールとなっています。

概要

虚血性脳卒中(IS)における梗塞部位を取り巻く虚血性半影は、治療が適時に行われれば回復し、運動障害や記憶障害の予防または軽減を目指します。¹.しかし、化学的血栓溶解や機械的血栓切除術などの治療法は、多くの人口にとって臨床実践において依然として利用困難^{であり、より}広く利用可能な治療法を調査するための実験モデルの必要性を支持しています。動物実験は再現性と側副循環の解析能力から不可欠^{であり、ラ}ットはISモデルで広く用いられています^。ヒトのIS⁵と密接な相関および血管径のため、中大脳動脈(MCA)は動脈閉塞の実験的研究における主要な標的血管^です。

脳虚血を誘発するために最も広く用いられている動物モデルの一つは、フィラメントベースの腔内閉塞術に続いて再灌流を行う^9,10です。それにもかかわらず、MCA内でフィラメントの正確な位置、ウィリス円の隣接血管の誤閉、手術に必要な外頸動脈結紮による副次的影響、閉塞の持続時間などがメタ解析で矛盾した結果を生み出^{しています。}

臨床現場では、ほとんどのIS患者は脳再灌流を達成できず、視床下部損傷やECA閉塞に伴う後遺症も見られず、選択的虚血を誘発し、その後の再灌流を伴わない実験的アプローチの必要性が浮き彫りになります。代替案としては、頭蓋切除術による永久MCA閉塞術(MCAO)があります。MCAの直接可視化により、選択的閉塞はECA結紮に伴う損傷や前脈絡膜動脈、視床下部動脈、後部脳動脈への損傷^{を防ぎ、空}隙梗塞により近い虚血性効果をもたらします。

最近の研究では、ISの動物モデルは虚血領域と不利な臨床アウトカムとの相関がより密接であるべきであることが示されています(^14,15)。結果への影響を最小限に抑えつつ、虚血を標的誘導できる技術的代替案の開発が最も適した戦略と思われます。この文脈の中で、本プロトコルの目的は、ラットにおける頭蓋切除術の再現性を確立し、その後に恒久的かつ選択的なMCAOを行う方法を確立し、モデルの標準化と技術的課題の軽減を目的とし、運動記憶および空間記憶の欠損研究に活用することでした。このアプローチは、高い生存率を示し、長期評価が可能となった古典的研究^{16、17、18、19}から応用されたものです。

下脳静脈(ICV)を解剖学的ランドマークとして用い、このプロトコルは歴史的にこのアプローチの主要な制約とされてきた技術的困難を解明し、急性期および慢性期の両方における選択的脳虚血の調査を可能にします。運動機能および空間記憶が評価され、提案された病変モデルによる欠損の検証に加え、虚血性脳領域の組織学的解析も行われました。

プロトコル

このプロトコルは、国家動物実験管理評議会(CONCEA)が定めた実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインに従い、西パラナ州立大学(UNIOESTE)動物実験倫理委員会(CEUA)によって承認され、プロトコル番号25-23が実施されました。

1. 術前準備

1. 手術器具、ガーゼ、コットンパッドを準備し、立体顕微鏡を位置づけます(図1)。
2. 手術台や器具は70%エタノールで清掃してください。

2. 麻酔

1. ケタミン(3.75 mL)、キシラジン(2.5 mL)、塩化ナトリウム0.9%(3.75 mL)の混合物で麻酔を誘導します。体重100gあたり0.2mLを腹膜内に投与します。後足や尾のつまみで麻酔の深さを確認してください。
2. 必要に応じて、過剰摂取を防ぐために最大用量の3分の1に相当する追加用量を投与してください。
3. 予防的抗生物質であるエンロフロキサシン(20 mg/kg)および鎮痛薬トラマドール塩酸塩(12 mg/kg)を腹腔内に投与します。
4. 直腸温度を測定し、全身温を温熱パッドで維持し、処置中は± 2°Cで維持してください。

3. ポジショニング

1. ラットを顕微鏡ステージの綿パッドの上に横デキュビトゥス(横置き)置きます(図1A)。小さな柔らかいロールで頭部を支え、180度に合わせて頭蓋骨の左側外側面を露出させます。ヘッドを粘着テープで固定します(図2A)。
2. 潤滑剤の点眼薬を塗り、まぶたをテープで閉じます。
3. 直腸温度を再確認し、必要に応じて加熱源を調整してください。

4. 頭蓋切除術

1. 外眼角と耳管の間に(約1.6 cm×0.5 cm)をミニトリコトマイザーまたはカミソリの刃でトリクロトミー(図1B)で行います。
2. 剃った部分を2%のクロルヘキシジンスクラブと0.2%の水性クロルヘキシジンで消毒します。
3. 直線ハサミで1cmの皮膚と皮下切開を行い(図1C)、外眼角の後方および耳管の前方に0.3cmの縁を保ちます(図2B)。
   注意:この層はAdson鉗子(図1D)または止血鉗子で引き戻してください。
4. 電気焼灼を用いて表層側頭血管の中央側頭枝を特定し凝固させます(図1E)。
5. より自由なエレベーター(図1F)で頬骨弓を触診し、側頭筋膜を縦方向に切開します。
6. 側頭筋を頭蓋と尾側から切り離し、側頭骨と前頭骨、咬筋の一部を露出させます。頬骨弓を縦方向に隔離し、約0.5cmの節を除去します(図2C)。
   1. 注意事項:
      1. 圧迫または電気焼灼を用いて上顎血管の前方深側頭枝からの出血を制御します。
      2. 側頭下顎関節の損傷を防ぐために後方斜切開は避けてください。
      3. アーチの下にある眼窩外涙腺の損傷を避けてください。
      4. 眼窩を開けないように。
7. 低速回転モーターに取り付けられた直径3.5mmの円形ダイヤモンドコーティングバリを使い、頬骨弓切除部位のすぐ後方に側頭骨をドリルします(図2D)。熱害を防ぐために0.9%の生理食塩水で断続的に灌漑してください。硬膜に小さな骨片を残し(図2E)、ハルステッド鉗子で優しく除去します(図1H)。
   注意:より小さいドリルビットを使った頭蓋切除術は代替手段ですが、硬膜や脳損傷のリスクが高まります。

5. MCA閉塞(図3)

1. 6mm×0.25mmの超細針で硬膜を開けます。
   注意:隣接する皮質血管を損傷させないようにしてください。
2. 頭蓋切除術の窓の下にある下脳静脈(ICV)と、その上に垂直に交差するMCAを特定します(図3A、C)。頭蓋切除術の中心にある基部かつ最も厚いMCA枝を特定します。
3. 吸収性の8-0をパスしてください細い針ホルダーを使ったMCA周囲のポリプロピレン縫合(図3B および 図1I)。血管を閉塞するために3つの結び目を結びます(図3C)。
   注意:ナイロン、綿、シルクなどの他の非吸収性縫合糸も使用可能です。
4. 下流の血流がないか確認してください。もし追加のMCA枝があれば、それも結紮してください。
5. 生理食塩水で虫歯を洗浄し、必要に応じて電気焼灼や優しい圧迫による止血を行います。
   注意:組織学的または神経炎症性のアーティファクトを防ぐために脳組織の凝固は避けてください。

6. 閉鎖

1. 可能であれば硬膜の近似をしてください。
2. 深部筋層を再近似し、側頭筋膜を吸収可能な4-0縫合糸で縫合します(図3D)。
3. 吸収性の4-0ポリグラクチン910縫合糸で皮下層と皮膚層を連続したパターンで閉じます。
   注意:縫合部の露出を避けてください。連続縫合が推奨されます。
4. 手術部位を0.2%水性クロルヘキシジンで洗浄してください。
5. 麻酔から回復するまで動物を温めておいてください。ケージに戻す前に温度を監視してください。皮膚切開から創傷閉鎖までの手術期間は、通常30分から45分の範囲です。
6. 手術翌日に予防的な抗生物質の2回目の投与を行います。

結果

合計28頭の雄のウィスターラット(生後10〜12週、平均体重349g)が、無作為かつ均等に2つのグループに分けられました:MCAO(記載済みプロトコルに提出)とSHAM(頭蓋切除段階のみに提出)。本研究では、静脈出血(2匹のMCAO)または頭蓋切除術中の軽微な皮質損傷(1匹のSHAM)により術中除外・手術中に置換された動物を対象にしました。術後5日目にさらに1頭のMCAO動物が死亡しました。モデルの全体的な死亡率は3.6%でした。最終的に分析されたサンプルは27頭の動物で構成されていました。運動記憶および空間記憶のパフォーマンスは、それぞれ術後7日目と8日目に評価されました(図4、 図5)。

術後7日目に姿勢検査を用いて運動機能評価を行いました。ラットは尾で吊り下げられ、反対側の前肢の動きが評価されました(図4A)。神経学的欠損のない動物...

ディスカッション

MCAOモデルは1975年から脳虚血の実験的パラダイ^{ムとして用}いられており、年月を経て改良され、神経損傷の誘発に有効であることが示されています ^{8,22,23,24,25,26,27,28}.MCAへの直接的な神経外科的アクセスが技術的に困難だったため、血管内フィラメント閉塞技術が広く用いられ、現在では脳虚血研究で最も一般的なア...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Adson toothed forceps	ABC ステンレス	L47-P4-164	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
Castroviejo 針ホルダー	Golgran	135-3	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
電気焼灼	Chunguang 医療	128	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
Freer エレベーター	ABC ステンレス	47P4-819	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
Halsted 湾曲	ABC ステンレス	AI1055	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
マイクロドリル	爪ドリル	ZS-710	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
ミニトリコトマイザー	Kemei	KM-666	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
プロレネ	Ethicon	8730H	8-0サイズの縫合糸
ステレオマイクロスコープ	Alltion	ASM-112	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
ストレートはさみ	ABC ステンレス	L23-W4	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
外科用圧迫材	Cremer	158595	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
外科用ガーゼ	Cremer	198669	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
温度計	G-Tech	DMT-2027	他のオプションが異なる会社から利用可能かもしれません
Vicryl	Ethicon	VCP346H	4-0サイズの縫合糸