凍結バフィーコートサンプルからの誘導多能性幹細胞株の再プログラミング

サマリー

現在のプロトコルでは、製造元の指示に従って再プログラムが困難な患者の末梢血単核細胞(PBMC)から誘導多能性幹細胞(iPSC)を誘導するトラブルシューティング手順が詳細に記載されています。このプロトコルは凍結バフィー被毛サンプルに特有ですが、精製PBMCの再プログラミングにも適用されることがあります。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は、疾患モデル化において貴重なツールです。さらに、成人体細胞から再プログラムされる幹細胞は誘導多能性幹細胞(iPSC)と呼ばれます。iPSC技術により、特定の研究参加者や集団の評価や個別化医療への挑戦が可能になります。血液は研究目的で定期的に採取され、冷凍保存されています。これらのサンプルは、白血球と血小板を含むバフィーコート、または好酸球、好塩基球、血小板、赤血球を含まないより純粋化された白血球集団を表す末梢血単核細胞(PBMC)として処理されます。どちらも再プログラム可能な体細胞にとって入手しやすく、比較的非侵襲的な供給源です。PBMCからの再プログラミングを詳述する報告書もいくつかありますが、凍結したバフィーコートからの再プログラミングを説明しているのは1つだけです。最近の経験では、文献や製造元で利用可能なPBMC再プログラミングプロトコルが凍結されたバフィー被毛サンプルに適用すると成功しなかったことが明らかになり、ここで述べた適応やトラブルシューティングの戦略が必要とされました。iPSC技術を用いる多くの研究者にとって、特に患者サンプルが細胞数が少ない場合、長期間で取得される場合、参加者数が限られている場合、その他非常に価値の高い場合には、高い成功率を持つ徹底したプロトコルを持つことが不可欠です。ここでは、ヒト凍結バフィーコートや精製PBMCの再プログラムの可能性を高めるためのチェックポイントとトラブルシューティング戦略が特定されます。最終的に、このプロトコルにより研究者は再プログラミング成功の予測因子を特定し、iPSC導出の成功率を高めるための代替手法を策定することが可能になります。

概要

ヒト多能性幹細胞(hPSC)技術は、体内のあらゆる細胞タイプに分化できる、容易に拡張可能かつ再生可能なヒト細胞の供給源であり、患者で入手困難または入手困難な細胞や組織のタイプを研究者が調査できるようにします。さらに、誘導多能性幹細胞(iPSCs)は患者の体細胞から直接誘導することができます^。これにより、患者特異的な関心細胞の区分が可能となり、疾患モデリングや創薬において非常に貴重なツールとなります。したがって、体細胞をiPSCに再プログラムする厳密で再現性が高く成功する方法が極めて重要です。

線維芽細胞、尿細胞、血球^2,3はそれぞれ独自の限界を持ち、iPSC誘導に最も頻繁に使われる体細胞源の一部です。線維芽細胞は歴史的に3の^{再プログラムに}最も人気のある選択肢ですが、入手は容易ではなく、やや侵襲的な皮膚生検が必要です。再プログラム可能な細胞は尿サンプルから得られ、入手が容易で非侵襲的ですが、再プログラムプロセスは収集⁴回目から最大48時間以内に新鮮なサンプルから始めなければなりません。血液は低侵襲で入手可能で容易に入手できるため、再プログラム可能な細胞の優れた供給源を提供します。末梢血単核細胞(PBMCs)、リンパ球を含む単核血球、単球、自然キ^{ラー細胞など}から利用可能な多くの再プログラムプロトコルがあります。PBMCは他の血液細胞よりも密度が低いため、新たに分離した全血サンプルから密度勾配遠心分離法(⁵)で分離・精製が可能です。あるいは、遠心分離によって全血は血漿、バフィーコート、^赤血球の3つの異なる層に分離されます。バフィー被毛にはPBMC、血小板、一部の赤血球が含まれています。しかし、PBMCはほとんどのバイオバンクでは入手困難ですが、全血やバフィーコートは豊富^{で入手可能です}7。バイオバンクにバフィーコートが存在し、これらのサンプルに再プログラム可能なPBMCが存在するにもかかわらず、凍結されたバフィーコート⁸からの再プログラムを詳述したプロトコルは非常に少なく、未開発の資源となっています。

現在、再プログラミングを効率化するために、多くのプロトコル1^、8、9と市販キット¹⁰が公開されています。しかし、再プログラムが難しい患者ドナー細胞の成功最大化方法については深くトラブルシューティングしていません。一部の細胞は再プログラムされないと一般的に認められており、その場合、多くの研究者は異なるドナー細胞タイプや患者で試すことがあります。しかし、これは多くの研究者や患者集団にとって現実的な選択肢でないかもしれません。既に発表されたプロトコル^8,9とは異なり、このプロトコルにはチェックポイントと基準を含むガイドが含まれており、それに基づいて再プログラミング成功を予測し、解凍時に密度勾配遠心分離で凍結されたバフィー被毛を精製するという独自のアプローチを採用しています。

このプロセスは、選ばれた個体から血液を採取し、PBMC(バフィーコート)またはバフィーコートのいずれかを分離することから始まります。新規実験の場合、IRBの承認と適切な同意書のもとで新鮮な採血を行う新たなドナーの募集が含まれる可能性が高いです。次のステップは体細胞増殖で、凍結された血液細胞を解凍し、造血幹細胞や赤血球前身の増殖を促進する条件下で培養^{します。これらの}血液細胞は再プログラムに最適な候補です。10〜14日後、細胞はリプログラミングの準備が整い、これは以前のプロトコルで議論されていない明確な形態によって示され、その後山中因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4¹を含む仙台ウイルスで接種されて転換されます。伝達後、細胞は山中転写因子を発現し、多能性状態に戻ります。これは再び明確な形態変化と幹細胞コロニーへの増殖によって示されます。新たに生まれたコロニーは個別に採取され、拡大され、冷凍保存されます。10回のパッセーション後、幹性マーカーの発現と3胚層への分化の可能性の確認による特徴付けにより、iPSC系統の再プログラムが成功裏に検証されました。

このプロトコルは、<1か月間保存されたクライオ保存されたバフィーコートや、解凍時に少なくとも100万個の生存細胞を持つ最大2年間保存されたPBMCに最適です。しかし、説明されたチェックポイントは、質の高い血液サンプルからの再プログラミングトラブルシューティングの指針となる可能性があります。さらに、再プログラムされたiPSCをフィーダーなしの状態に適応させる詳細は、初期の体細胞タイプに関わらず、あらゆるiPSC再プログラミングワークフローに適用可能です。

このプロトコルは、実践的なトラブルシューティングを通じて確立され、凍結したバフィー被毛からiPSCを再プログラムする方法を詳細に示し、再プログラム成功の形態学的指標を特定し、難しいサンプルの再プログラミングの実用的なガイドを提供します。最終的に、これらの戦略を実施することで、時間、コスト、試薬、サンプルの節約につながります。

プロトコル

このプロトコルは、ジョージア大学の人間研究倫理委員会の指針に従っています。すべてのヒト被験者研究は、世界医師会のヘルシンキ宣言の指針に従って実施されました。自己申告に基づき、ボランティアは嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、結核、喘息、糖尿病、急性気道感染症などの疾患を患っていませんでした。18歳から50歳までの男女問わずボランティアが募集されました。妊婦は研究から除外されました。

1. バフィーコートまたはPBMC抽出と冷凍保存

判断基準:サンプルが長期間保管される場合は、オプション2を選ぶのが最善です。PBMC精製用の試薬が入手できない場合や、サンプルが短期間保存される場合は、オプション1が適しています。

1. 選択肢1:バフィーコート抜き
   1. WHOのベストプラクティス¹² に従い、7〜10mLの全血を抗凝固剤被覆の血液採取管に採取します。サンプルを冷蔵保存してください。
   2. 全血7〜10 mLを15 mLの円錐形チューブに移管します。ブレーキを解除した状態で、200 x g のスイングバケット遠心分離機で4°Cで15分間血液を回します。これは3層で、上に黄色い血漿、中央に白いバフィー状の被覆層、下に赤い赤血球が配置されます。
   3. バフィー層を乱さずに滅菌血清学ピペットで血漿を採取します。プラズマは捨てろ。白いバフィー色の被毛層を新しい15 mLの円錐形チューブ(約1〜2 mL)に移します。
      注意:血漿は適切な生物有害廃棄物容器に処分してください。
      注意:バフィーの被毛に多少の血漿汚染があっても、解凍後の回復を助けるため問題ありません。
   4. バフィーコートにDMSOを加え、最終組成は10% DMSO v/vとなり、すぐに-80°Cのクライオビル(1mL/バイアル)で凍結します。翌日はバイアルを液体窒素に移して長期保存してください。
      注:例として、バフィーコート2mlにはDMSOを200μl加え、よく混ぜてから2つのバイアルに分けます。これにより、通常1サンプルあたり1〜3個の凍結バイアルが確保されます。
2. オプション2:PBMC浄化
   1. WHOのベストプラクティス¹² に従い、7〜10mLの全血を抗凝固剤被覆の採血管に採取します。サンプルを冷蔵保存してください。
   2. 4 mLの密度勾配溶液1を新しい15 mLの円錐形チューブに加えます。密度勾配溶液の上に慎重に4mLの血液を重ねます。
   3. 遠心分離機で400 x g の回転バケット遠心分離機を30分間RTで使い、ブレーキを切る。その結果、上層に血漿、中間層にPBMCs、残りの血液は下層に集まります。
   4. PBMCの分画を新しい15mLの円錐管に集め、ブレーキをかけた状態で350 x g のスイングバケット遠心分離機で5分間遠心分離し、1x PBSで2〜3回洗浄します。上清液は捨てる。冷凍保存をスキップしてすぐに再プログラムを始めるには、ステップ2.3.4に進みましょう。
      注意:上澄液は適切な生物有害廃棄物容器に処分してください。
   5. ペレットを凍結保存培地(90%血清、10%DMSO)に再懸浮させ、直ちに-80°Cでクライオビアル(1mL/バイアル)で凍結します。翌日はバイアルを液体窒素に移して長期保存してください。
      注:新鮮な血液からのPBMC精製には、密度勾配遠心分離の代わりにPBMCの分離血液採取チューブが使用される場合があります。市販の代替冷凍培地を用いてクライオ保存することも可能です。典型的な収量は、サンプルあたり1〜4本の冷凍バイアルです。

2. 体細胞増殖用のサンプルを準備する

1. メディア準備
   1. 膨張培地(EM)⁹ を45mLのEM塩基を分割して準備します。127.8 μL L-アスコルビン酸(100 mMストックから50 μg/mL)と450 μLのペニシリン-ストレプトマイシン(100倍ストック)を加えます。
   2. EM+サイトカイン¹³ 〜4 mL EMを準備し、2 μL幹細胞因子(SCF)(100 μg/mlストックから50 ng/mL)、2 μLインターロイキン-3(IL-3)(20 μg/mLストックから10 ng/mL)、16 μLエリスロポイエチン(EPO)(500 U/mLストックから2 U/mL)、4 μLインスリン様成長因子1(40 μg/mLから40 ng/mL)、 および4μLデキサメタゾン(1mMストックから1μM)を投与しました。調理当日にEM+サイトカインを使用してください。
      注:代替の商業用膨張媒体システムが使用される場合があります。
2. 選択肢1:フローズン・バフィー・コートからのPBMC浄化
   意思決定基準:ステップ1の選択肢1(バフィーコートの抽出)を選択した場合、ステップ2の選択肢1(凍結バフィーコートからのPBMC精製)を選びます。
   1. 密度勾配解2を回収し、室温まで戻します。ボトルを逆さまにしてよく混ぜます。3 mLの密度勾配溶液2を15 mLの円錐形チューブに無菌移送します。
   2. さらに15mLの円錐形チューブを12mLのダルベッコリン酸バッファー生理食塩水(DPBS)で準備します。
   3. 液体窒素から凍結したバフィーコートの小瓶を回収してください。解凍の準備が整うまで氷を冷やしておいてください。37°Cの水浴で水をかき混ぜて、サンプルを優しく解凍します。小さな氷の結晶だけが残ったら取り除いてください。
   4. バイアルの内容物をDPBSを含む円錐形のチューブに慎重に(ドロップ方向に)移します。バイアルを1 mLのDPBSですすいで、採取した細胞を含む円錐形チューブに加えます。
   5. スイングバケット遠心分離機を使い、200 x g のRTで10分間遠心分離機を使います。上清液を慎重に除去し、細胞ペレットを4 mL DPBSに1%の胎児用牛血清(FBS)で再懸濁させます。
   6. バフィーコートの混合物を密度勾配溶液の上に優しく重ね、混ざり合わないように注意してください。800 x g のスイングバケット遠心分離機で、ブレーキを外した状態でRTで20分間遠心分離機を操作します。
   7. ピペットで、プラズマと勾配の界面を乱さずに上部プラズマ層を除去・廃棄します。ピペットで界面のPBMC層を除去し(図1A)、クリーンな15 mLチューブに移します。
      注意:他の層は適切な生物有害廃棄物ビンに処分してください。
   8. PBMCを3 mL EMで200 x g で遠心分離し、RTで10分間洗浄します。上清液を慎重に除去し、ペレットを2 mL EM+サイトカインに再懸濁します。12ウェルプレートのうち1つのウェルにプレートを付けます。
   9. プレートをインキュベーターに37°C、_CO25 %、_O22220%で置きます。
3. オプション2:凍結PBMCの解凍
   意思決定基準:ステップ1の選択肢2(すなわちPBMCの浄化)が選ばれた場合、または凍結されたバフィー被毛が生存率が低い(例:1か月以上保管される)懸念がある場合(図1B)、ステップ2の選択肢2(すなわち凍結PBMCの解凍)を選びます。
   1. 15 mLの円錐形チューブに12 mLのDPBSを準備します。
   2. 液体窒素から凍結されたPBMCのバイアルを回収してください。解凍するまで氷を冷やしておきましょう。37°Cの水浴で水をかき混ぜて、サンプルを優しく解凍します。小さな結晶だけが残ったら外してください。
   3. バイアルの内容物を慎重に(滴下方向に)円錐形のチューブに移します。バイアルからすべての細胞を取り出す際は、1mLのDPBSでバイアルを洗い流してください。
   4. スイングバケット遠心分離機で200 x g のRTで10分間遠心分離機を使います。上清液を慎重に除去し、ペレット(図1C)を2 mL EMに再懸浮させ、その後10 μLを取ってトリパンブルー排除試験を行い、細胞数¹⁴を得ます。
      注意:上澄液は適切な生物有害廃棄物容器に処分してください。
   5. 1.0 x 10⁶–2.0 x 10⁶ cells/mLを2 mL EM + サイトカインを12ウェルプレートの1ウェルにプレートします。プレートをインキュベーターに37°C、_CO25 %、_O22220%で置きます。

3. 体細胞の増殖(解凍後1日目)

1. 各ウェルから使用済み培地1mLを慎重に取り除きます。使用済み培地は別の井戸や遠心分離機管に回収され、細胞が失われていないか確認できます。
2. 使用済み培地を1mLの新鮮EM+サイトカインに置き換えます。
3. ステップ3.1と3.2を繰り返し、PBMCの形態に大きな変化が見られるまで2日に1回写真を撮り、明るく丸い大きさの細胞と小さな細胞(図2A、オレンジと青の矢印)が現れます。これらは赤芽細胞であり、再プログラムされる細胞タイプです。これには約10〜14日かかります。
   注意:これらの形態を示さない細胞は、通常、大きな丸い細胞を欠いています(図2B)、再プログラムに成功する可能性は低く、死んでいる可能性があります(図2C)。

4. トランスダクション(解凍後10〜14日)

1. 仙台ウイルスを準備せよ
   1. ロット特異的タイター値を用いて、製造元の推奨に従ってKOS: c-Myc: Klf4を用いて、感染多重率(MOI)を5:5:3で2.0×10個⁵ 細胞のトランスダクションに必要な各ウイルスの体積を計算します。この計算の方程式は、製造元が提供する製品文書に記載されています。
   2. 冷凍庫からウイルスを取り出し、解凍まで氷に保管してください。ウイルスを一つずつ、37°Cの水浴でゆっくりと攪拌して優しく解凍します。
   3. 3つのウイルスすべてを適切な体積で混合し、2.0×10⁵ 細胞を5:5:3のMOIで伝達するアリコートを準備します。アリコートは-80°Cで冷凍し、使用準備が整うまで保存します。
      注意:仙台ウイルスに接触した廃棄物はすべて徹底的に漂白してください。
      注:製造元の指示では、添加されたウイルスの体積を決定するためにMOI計算による実際の細胞数を推奨していますが、このプロトコルの目的上では2.0 × 10⁵ の近似が成功しています。アリクオートはコスト効率が高く、ウイルスの凍結・解凍サイクルを短縮できます。
2. トランスダクションの日(d0)
   1. 前日にPBMCを投与しない場合は、使用済みの培地1mLを取り除き、新鮮なEM+サイトカイン1mLに置き換えます。ウイルスを氷で溶かし、直接井戸に加え、培地を回します。
   2. プレートをパラフィルムで包み、350 x g のスイングバケット遠心分離機でRTで90分間遠心分離します。プレートをインキュベーターに37°C、_CO25 %、酸素20%を一_{晩置きます} 。
      注意:仙台ウイルスに接触した廃棄物はすべて徹底的に漂白してください。
3. トランスダクションから1日後(d1)
   1. 細胞を15mLの円錐形チューブに集めます。2 mLの電磁液でよくすがい、顕微鏡ですべての細胞が採取されているか確認してください。遠心分離機セルを300 x g でRTで10分間使用します。
   2. 上清液を慎重に除去し、2 mLのEM+サイトカインで再懸濁します。12ウェルプレートの新しいウェルに入れ、37°C、_CO25%、酸素20%のプレートをインキュベーターに戻_します。
      注意:仙台ウイルスに接触した廃棄物はすべて徹底的に漂白してください。

5. 誘導細胞をフィーダー細胞に再プレートする

1. フィーダーセルの準備
   1. 43.5 mLに、5 mL FBS(最終濃度10%)、0.5 mLの最低必須培地非必須アミノ酸溶液(MEM-NEAA)(100xストックから)、50 μL 2-メルカプトエタノール(55 μM、55 mMストックから)、0.5 mLの抗生物質-抗菌剤(100xストックから)を加えます。
   2. ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートを、600μLゼラチン(2%のストックから0.1%)を12 mL DPBSに加え、1ウェルあたり2 mLを分散して準備します。室温で20分間培養します。
   3. 放射線照射されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の凍結バイアルを回収し、37°Cの水浴でゆっくりと溶かしてやさしく解凍します。
   4. 10 mL DPBSを含む15 mLの円錐形チューブに滴りずつ加え、さらに1 mL DPBSを含んでバイアルをすいでいます。遠心分離機で200 x g のRTで5分間加熱します。
   5. 上澄液を慎重に除去し、細胞ペレットを1 mLの線維芽細胞培地に再懸濁させます。細胞数¹⁴を得るためにトリパンブルー排除試験を行うために10μLを除去します。
   6. 6ウェルプレートからゼラチン溶液を取り出し、照射したMEFを2.5×10⁴ cells/^cm²でプレートします。インキュベーターで37°C、_CO25%、酸素20%で6〜48時間培養します。
      注意:フィーダーセルプレートは、再メッキの前に準備する必要があります。最良の結果は、照射されたMEFを約2日間インキュベートしてから再プレートした場合に見られますが、少なくとも6時間の培養でも十分です。
2. 再誘導細胞
   1. iPSC培地90 mL DMEM/F12に、10 mL FBS(最終濃度10%)、1 mL MEM-NEAA(100xストックから)、1 mL L-グルタミン(200 mMストックから2 mM)、1 mLペニシリン-ストレプトマイシン(100xストック、100 μLの2-メルカプトエタノール、55 μMストックから55 μM)、および100 μL線維芽細胞成長因子2(FGF2)(10 μg/mLストックから10 ng/mL)を準備します。各給餌時に新鮮なL-アスコルビン酸(50 μg/mL)を加えます。
   2. トランスデューション後3日目に、トランスデューション済みのウェルからすべての培地と細胞を15mLの円錐形チューブに採取します。さらに1mLのEMをよくすいで、遠心分離機でスイングバケツ遠心分離機で300 x gのRTで10分間洗い流します。
   3. ペレットを6mLのiPSC培地に再懸浮させます。プレートの3つのウェルから放射線照射されたMEFで媒体を吸引します。
   4. この3つの照射されたMEF(2ml/ウェル)ウェルに細胞をプレートで導入しました。インキュベーターで37°C、_CO25%、O222220%で培養します。

6. コロニー出現までの維持

1. トランスダクション後4日目、5日目、6日目には、各ウェルに1mLの新鮮なiPSC培地を毎日添加します。これにより、新たに再プログラムされた細胞が給餌器に定着する際に不必要な乱れを抑えつつ、新鮮な栄養素も供給できます。
2. トランスデュクション後7日目には、すべての古い培地を取り除き、1ウェルあたり2mLの新しいiPSC培地に置き換えます。コロニーが出現し始めるまで、隔日でiPSC培地を摂り続けてください。
3. hES培地78 mL DMEM/F12に、20 mLのFBSフリーサプリメント(20%)、1 mL MEM-NEAA(100x)、1 mL L-グルタミン(200 mMストックから2 mM)、1 mLペニシリン・ストレプトマイシン(100x)、100 μL 2-メルカプトエタノール(55 mMストックから55 μM)、および100 μL FGF2(10 μg/mlから10 ng/mL)を準備します。各給餌時に新鮮なL-アスコルビン酸(50 μg/mL)を加えます。
4. 小さなコロニーが出現し始めたら、2日おきにhES培地を摂食して移植細胞を維持し続けます(図3A)。
   注:コロニーはトランスダクション後7日目には現れ始めます。トランスデュクションから3週間までに群落が出現しなければ、コロニーが出現する可能性は低いです。

7. コロニーが大きくなったら摘む(図3B)

注:時には、形質転換細胞が幹細胞のようなコロニーを形成しない形態変化を経験することもあります(図3C)。この菌株は成功するiPSC系統に繋がると考えられていません。

注:コロニー発生からiPSCラインは、ラボの好むhPSC培養条件に合わせて適応する必要があります。このプロトコルでは、iPSCラインがフィーダーなしの条件下に適応し、ビトロネクチン(VTN)コーティングされたプレート上で培養され、化学的に定義され市販されているhPSC培地で供給されていることを示します。コロニーが新しい環境にうまく適応できていない場合は、hES培地でフィーダー細胞に乗せるなど、より穏やかな移行が必要になるかもしれません。

1. VTNコーティングされたプレートは解凍して十分に混ぜて準備します。24ウェルプレートの場合、120μLのVTNを含むDPBS12mL(500μg/mLのストックから5μg/mL)を準備し、0.5mLのVTN溶液を1ウェルごとに分散します。室温で1時間孵化します。
2. hPSC培地は、4°Cで1本解凍して調合します。解凍後、10 mLのhPSCサプリメントを500 mLのhPSC基礎培地1本に加えます。
3. 24ウェルプレートのウェルからVTN溶液を除去し、各ウェルに0.5 mLのhPSC培地と0.5 μL Y-27632(10 mMストックから10 μM)を加えて選別準備を行います。
4. 新しいプレート、6ウェルにトランスデュークされた細胞やコロニー、滅菌注射器、p200ピペットとチップを無菌状態で解剖顕微鏡に持っていきましょう。
5. 誘導された細胞と浮出したコロニーを含むプレートを解剖顕微鏡に置き、顕微鏡を使って1つの菌株を特定して採取します。プレートの蓋を持ち上げて井戸を露出させます。
6. 無菌的に注射器を開けて針を露出させます。顕微鏡の誘導に従い、針の先端を使ってコロニーの輪郭を針でなぞり、周囲のフィーダー細胞からコロニーを切り離します。
7. 針先でコロニーをいくつかの同じ大きさの小片に切り分けます。もしコロニーの破片がまだプレートから外れていなければ、針の側面を使ってプレートからすくい取ったりこすり落としたりして浮かせてください。
   注意:針は適切な鋭利器の容器に捨ててください。
8. p200では顕微鏡を使って選んだコロニーを移動させます。ピペットで浮遊コロニーを吸引し、準備済みの24ウェルプレートのウェルに移します。他のコロニーやフィーダーセルを使わずにコロニー全体を井戸に入れるようにしましょう。
9. プレートをインキュベーターに37°C、_CO25 %、_O22220%で置きます。
10. 摘んだコロニーには毎日1mLのhPSC培地を供給し、合流するまで続けます。
    注:コロニーは遺伝的に異なる可能性があります。24ウェルプレートの各井戸には、選ばれたコロニーは1つだけ含まれていなければなりません。各選抜されたコロニーには独自の識別子が与えられ、以降は他の選抜されたコロニーとは異なる細胞株として扱われます。厳密な再プログラミングを行うには、少なくとも24のコロニーを選び、少なくとも3つのコロニーを拡張・特徴付けしてください。

8. 拡大

1. hPSC維持
   1. 摘んだコロニーは大きく丸く、縁が光るようになったら分裂の準備が整います(図4A)。コロニーは摘むと複数のピースに分かれます。もし一つの井戸に複数のコロニーがある場合は、それらが互いに接触し分化し始めるまで大きくなる前に分割してください。
   2. VTNコーティングされた6ウェルプレートを準備する:6ウェルプレートの場合、120μLのVTN(500μg/mLのストックから5μg/mL)を含むDPBS12mLを準備し、1mLのVTN溶液を1ウェルあたり分散します。室温で1時間培養します。VTN溶液はDPBSに置き換えられ、37°C、5%_CO2 で1か月間保存できます。分割されるウェルでは、DPBSを吸引し、1 mLのhPSC培地に置き換えます。
   3. ウェルから培地を吸引してスプリットし、その後1 mL DPBSで一度洗浄します。DPBSを吸引し、500 μL 0.5 mM EDTA解離バッファー(500 mL DPBSに0.9 g NaClを含み、フィルターを滅菌して調製)を加えます¹⁵。37°C、5%_CO2 で2分間孵化し、コロニーが緩み始め、各コロニー内の細胞が円を描いて離れ始めるまで培養します。
   4. インキュベーターからプレートを取り出し、EDTA解離バッファーを吸引します。p1000ピペットを使い、1mLのhPSC培地で細胞を上下に優しくピペットし、コロニーが完全に剥離し、わずかに砕けるまで採取します。培地1mLと細胞を新しい6ウェルに移し、1mLの新鮮なhPSC培地を含みます。この最初の分割は1:1の分割比で行われ、元のプレートからのすべてのセルが新しいプレートに持ち込まれます。
   5. 細胞をインキュベーターに37°C、_CO25%、O22220%で置_きます。 井戸が合流して分割できるまで、iPSCを毎日供給してください。
      注:幹細胞形態の悪化(図4B)は、分割プロトコルの早期分割、EDTA潜伏時間の短縮、分割比率の調整などで軽減できます。
   6. 10cmの皿に広げてください。
      1. 細胞が6ウェルプレートの各ウェルに結合したら、10cmの皿にVTN(7 mL DPBSと70 μL VTN(500 μg/mLのストックから5 μg/mL)を1時間培養)を塗布します。
      2. 分割プロトコルを繰り返し、今回は6ウェルから10cm組織培養皿へ拡大します(分割比率1:1)。10cm皿あたり7〜10mLのhPSC培地を使用します。
      3. 10cmの皿の細胞が合流したら、この分裂(通過)プロセスを繰り返します。各箇所で箇所番号をメモしてください。分裂比率は細胞の形態や密度によって異なります。典型的な比率は1:10で、元のプレートのセルの10分の1が新しいプレートに持ち込まれます。
2. フリーズバックとストック調理
   1. 約3回の通過後、4つの10cm組織培養皿に拡張し、初期の通過ストック用にします。10cm皿の細胞が一つに合流したら、冷凍の準備が整います。
   2. クリオバイアルを用意して冷凍庫に入れて冷ます。ラベルには細胞株、クローン、パッセージ番号、凍結日が含まれていることを確認してください。
   3. 冷凍培地を準備します:90%のhPSC培地と10%のDMSOです。1バイアルあたり1mL(10cm皿あたり冷凍バイアル3本)が必要です。
   4. 通常通り、各10cm皿ごとに4 mL 0.5 mM EDTA解離バッファーを用いて分割プロトコルを実施します。
   5. EDTA潜伏後、吸引してEDTAを吸い込みます。皿に10mLのhPSC培地を優しく加えます。
   6. 培地をピペットで優しく洗い流して、皿から細胞を洗い流します。細胞は皿の床から簡単に剥がれて培地に混ざります。ピペットは2〜5回のみで、コロニーを優しく分解しつつ、単細胞への解離を防ぎます。
   7. 200 x g のRTで5分間遠心分離。上清液を吸引し、細胞ペレットを凍結培地に再懸浮させます。
   8. 断熱してすぐに-80°Cで冷凍してください。 凍結バイアルを液体窒素タンクに移して長期保存します。
   9. 特性評価が完了したら、同じ方法でさらに株を凍結します。

9. iPSCの特徴付け:

1. 語幹指標の発現。少なくとも10通の拡張後、24ウェルのコロニーが分割準備が整ったら、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、ステナネスマーカーNANOGのために免疫組織化学で染色します。コロニーが仙台ウイルス(SeV)陰性になるには少なくとも10回の通過が必要であり、免疫蛍光(図4C)で確認できます。
2. 多能性能力の検証:三つの胚層分化。iPSC多能性は、3つの胚層それぞれへの成功した分化によって確認されます。各分化は、良好なhPSC形態を示す10cmの合流皿から始まります(図4A)。
   1. エクトダーム¹⁶
      1. 分化開始前日(1日目):マトリックスコーティングされた24ウェルプレートに、密度2.6 ×^{10 5} cells/^cm ²のhPSC培地に種子iPSCを、Y-27632(最終濃度10 μM)およびXAV-939(最終濃度2 μM)を用います。
      2. 0日目–1日目:LDN(最終濃度100 nM)、SB(最終濃度10 μM)、XAV(最終濃度2 μM)を1 mL/ウェル分化塩基で供給します。
      3. 2日目から7日目:LDN(最終濃度100 nM)およびSB(最終濃度10 μM)を含む1 mL/ウェル分化塩基を供給します。D3からは、隔日で授乳します。
      4. 8日目:4%パラホルムアルデヒドで固定し、外胚葉マーカーPAX6¹⁷ の免疫組織化学で染色し、多能性マーカーNANOGの喪失を確認しました(図4D)。
   2. 中胚葉¹⁸:
      1. 分化開始前日(1日目):マトリックス被覆された24ウェルプレートに、密度2.5×10⁵ セル/^cm2 で、hPSC培地にY-27632(最終濃度10μM)を投与します。
      2. 0日目:DMEM/F12をL-アスコルビン酸(最終濃度64 μg/mL)、ナトリウムセレナイト(最終濃度13.6 ng/mL)、ホロトランスフェリン(最終濃度10 μg/mL)、化学的に定義された脂質濃縮液(100x)、CHIR(最終濃度5 μM)を投与。
      3. 1日目: DMEM/F12をL-アスコルビン酸(最終濃度64 μg/mL)、ナトリウムセレンナイト(最終濃度13.6 ng/mL)、ホロトランスフェリン(最終濃度10 μg/mL)、化学的に定義された脂質濃縮液(100x)、ヘパリン(最終濃度0.6 U/mL)を投与します。
      4. 2日目:4%パラホルムアルデヒドと染色で免疫組織化学で定着し、BRACHYURY-T¹⁹ を検出し、多能性マーカーNANOGの喪失を確認しました(図4E)。
   3. 内胚葉²⁰
      1. 分化開始前日(1日目):マトリックス被覆された24ウェルプレート上で、密度1.0×10⁵ セル/^cm2 のhPSC培地でY-27632(最終濃度10μM)を用いています。
      2. 0日目から4日目: d0日、DPBSで洗浄し、RPMIでL-グルタミン代替品(100x)、FBS(最終濃度0.5%)、アクティビンA(最終濃度100 ng/mL)を投与します。d0からは毎日同じ媒体で給餌します。
      3. 5日目:4%パラホルムアルデヒドで固定し、内胚葉マーカーSOX17²¹ を免疫組織化学で固定し、多能性マーカーNANOGの喪失を確認しました(図4F)。
         注:鑑別は既に発表されたプロトコルに従って行われました。私たちの経験では、マトリックスコーティングは互換性があります。

結果

このプロトコルの成功は様々な段階で追跡可能です。 表1は 、このプロトコルが実施されたサンプルの概要を示しています。開始サンプルは、1週間保存されたバフィーコートまたは、解凍後に良好なサンプル品質を持ち、細胞増殖後に6〜7回の再プログラムに成功した形態的外観を持つPBMCのクライオ保存サンプルです(表1、カテゴリー1)。同様の条件下で採取・保存されたさらに2つのバフィー被毛サンプルは、同様の品質と形態を示しましたが、再プログラムされるのではなく、他のアッセイの確立のために採取されました。あるいは、長期間(>6年)保存された冷凍バフィー被毛から始めると、解凍時の質にかかわらず、体細胞拡張後に再プログラム可能な形態を示さず、再プログラムに成功しません(表1、カテゴリー2)。資源を節約するために、展開後に再プログラム可能な形態を示さないサンプルはトランスデューションしないべきです(表1、カテゴリー3)。

ディスカッション

iPSC技術は、疾患メカニズムの発見、個別化医療、「皿中の臨床試験」など、生物医学分野で非常に大きな可能性を秘めています^22,23。血液サンプルからのiPSC再プログラミングのための効率的かつ適応可能なプロトコルは、iPSC技術の大きな可能性を引き出す鍵であり、これらは簡単に採取でき、バイオバンクで容易に入手可能であることが多いです。精製されたPBMCからの再プログラミングを詳細に扱う多くのプロトコルがありますが、このプロトコルは精製度の低い血液サンプル、例えば凍結バフィーコートからの再プログラムを詳細に扱い、再プログラミングのタイムライン上のチェックポイントを特定して成功を容易に評価し、時間と資源の無駄を最小限に抑えています。

成功する再プログラミングのための最初の重要なステップは、高品質な開始サンプルを持つことです(図5...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cm標準組織培養皿	ファルコン	353003
12ウェルプレート	ファルコン	353043
15 mL円錐形チューブ	フィッシャー	7200886
24ウェルプレート	コーニング	7200740
4%パラホルムアルデヒド溶液	サーモ・サイエンティフィック	J19943-K2
6ウェル板	フィッシャー・サイエンティフィック	FB012927
accuSpin1R	フィッシャー・サイエンティフィック	75003449
アクティビンA	バイオテクネ	338年AC
AF488-donkey αヤギ	インビトロジェン	A11055
AF555-donkey &α;RBT	インビトロジェン	A31572
AF647-donkey & alpha;m	インビトロジェン	A31571
AF647-donkey & alpha;RBT	インビトロジェン	A31573
抗生物質・抗菌薬(100倍)	フィッシャー	15 240 096
バシックス・ポリスチレン血清学的ピペット	フィッシャー	14955233 14955234 14955235 14955236
BD結核シリンジ	フィッシャー	14-826-87
BDバキューチインガラス単核細胞調製(CPT)チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	02-685-125	PBMCによる血液採取チューブの分離
BD K2EDTAを用いた真空プラスチック血液採取チューブ:血液緩和閉鎖	フィッシャー・サイエンティフィック	02-657-32	抗凝固被覆血液採取チューブ
B-メルカプトエタノール	フィッシャー	21 985 023
牛ゼラチン	シグマ	G1393
ブラキュリー-T抗体ポリクローナルヤギIgG	R&D	AF2085
セルドロップBF	デノヴィックス	セルドロップBF
遠心分離機5702	エッペンドルフ	EP022628102-1EA
化学的に定義された脂質濃縮物	フィッシャー	NC9022744
キル99021	R&D	4423
CO2インキュベーター	三洋	MCO-20AIC
冷凍保存保存システム	カスタムバイオジェニックシステム	V-1500AB
クライオスターCS10	幹細胞技術	100-1061	代替凍結媒体
CytoTune-iPS 2.0 仙台再プログラミングキット	フィッシャー	A16517
デキサメタゾン	シグマ	D2915
DMEM	フィッシャー	11965118
DMEM/F12	フィッシャー	11330057
DMSO	フィッシャー	BP231-1
DPBS 1X W/O CA MG	フィッシャー	MT21031CM
EDTA	フィッシャー	AM9262
エリスロポエイチン(EPO)	バイオテクネ	287-TC-500
エッセンシャル6 ミディアム(E6)	フィッシャー	A1516401	微分ベース 
エッセンシャル8中型(E8)	フィッシャー	A1517001	hPSC基礎培地
EVOS FL顕微鏡	熱力学	AMF4300
胎児用牛血清	VWR	45000-734
FGF BASIC(FGF2)	バイオテクネ	233-FB/CF
ゲルトレックス	フィッシャー	A1413202	マトリックスコーティング
Gibco MEM 非必須アミノ酸溶液(100X)	フィッシャー	11140050
グルタマックス	フィッシャー	35050061	L-グルタミン代替品
ヘパリン	幹細胞技術	7980
ヒストパク1077	シグマ	10771	密度勾配解 1
ホロトランスフェリン	シグマ	T0665
ヒト幹細胞因子(SCF)	ペプロテック	300-07-100UG
インスリン・ライク・グロングファクター1(IGF1)	ペプロテック	100-11-100UG
インターロイキン-3(IL-3)	ペプロテック	200-03-2UG
アイソテンプ210水浴	フィッシャー・サイエンティフィック	210
ノックアウト血清置換薬(KSR)	フィッシャー	10828028	FBS無料サプリメント
L-アスコルビン酸	シグマ	A4544-100G
LDN193189	ステムジェント	04-0074
L-グルタミン	フィッシャー	25030081
リンポレップ	幹細胞技術	7801	密度勾配解2
マトリゲル	コーニング	CB-40234	マトリックスコーティング
マウス胚性線維芽細胞	フィッシャー	A34964
ナノグ多クローナルヤギIgG	R&D	AF1997-SP
NUNCバイオバンキングおよび細胞培養用低温チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	12-565-163N
ペニシリン/ストレプトマイシン	フィッシャー	15140122
精製抗Pax-6抗体ウサギ多クローナルIgG	バイオレジェンド	901301
QBSF-60 血清フリー培地	クオリティ・バイオロジカル	160-204-101	電磁ベース
リカバリーセル培養凍結培地	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	12648010	代替凍結媒体
rhビトロネクチン(VTN)	フィッシャー	A31804
RPMI 1640 ミディアム	フィッシャー	11875093
SB431542	R&D	1614
仙台ウイルス HN モノクローナル抗体マウス IgG2a	インビトロジェン	14649482
セレンナイトナトリウム	シグマ	S5261
Sox17抗体ポリクローナルヤギ IgG	R&D	AF1924
StemSpan赤血球拡張サプリメント	幹細胞技術	2692	代替商業用拡張ミディアムサプリメント
StemSpan SFEM II メディア	幹細胞技術	9605	代替の商業拡張媒体
超低温冷凍庫	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	TSX60086A
ユニバーサルピペットチップ - フィルター付き	VWR	76322-132<> 76322-134<> 76322-150< > 76322-156
XAV939	バイオテクネ	3748/10
Y-27632 ジハイドロクロライド	バイオジェム	1293823