土壌基底呼吸法は土壌管理と微生物活動の影響を測定する方法として

サマリー

ここでは、赤外線ガス分析装置(IRGA)を用いて土壌基底呼吸を評価するプロトコルを提示します。これにより、制御された条件下での土壌CO₂動態の制御された連続モニタリングと微生物活動の再現性評価が可能となります。

要約

土壌呼吸は土壌から大気へのCO₂の移動を表し、一次生産量に次ぐ陸上最大の炭素フラックスの一つです。主に土壌生物の代謝活動によって駆動されるため、土壌生物活動、炭素のターンオーバー、環境や管理関連の攪乱の影響を示す繊細な指標として広く認識されています。土壌呼吸は複数のCO₂源を統合しており、植物の根や根圏微生物からの自己栄養呼吸、有機物の微生物分解に関連する異栄養呼吸も含まれます。外部基質や最近の栄養分入力がない場合に測定される微生物の呼吸は土壌基底呼吸(SBR)と呼ばれます。

本記事では、制御された実験室条件下でSBRを定量化するための赤外線ガス分析装置(IRGA)ベースのプロトコルを紹介します。微生物代謝のみに起因する異栄養成分を単独で分離するために、標準化された水分と温度条件下で事前調整・ふるい分け・均質化された土壌サンプルを用いて植物由来のCO₂フラックスを排除し、累積的なC-CO₂の進化を定量化し、微生物のバイオマス、活性、土壌健康の強力な代理指標を提供します。このプロトコルには土壌準備、水分調整、密閉バイアル培養、IRGAベースのCO₂測定、累積呼吸量の計算が含まれます。

本研究では、赤外線ガス分析装置(IRGA)を用いてSBRを評価し、制御条件下での土壌CO₂動態のモニタリングを行いました。代表的な結果は、タベルナス砂漠の乾燥土壌における堆肥添加が微生物の呼吸を促進し、有機改良後に微生物プロセスが強く刺激されたことを示しました。これらの発見は、特に劣化した乾燥環境において、土壌管理が微生物活動に与える影響を示す指標としてのSBRの有用性を強調しています。方法論的には、IRGAベースのプロトコルは土壌炭素動態に関連する研究および教育応用のための実用的なツールを提供します。

概要

土壌呼吸は、土壌表面から大気への二酸化炭素(CO₂)のフラックスを含む中心的な生地球化学的プロセスです。これは総^{一次生産に}次いで陸上で2番目に大きな炭素フラックスと推定されており、世界の炭素サイクルに大きく寄与しています^。このプロセスは陸上生態系における炭素のターンオーバーに不可欠であり、土壌生物活動や土壌炭素隔離の動態を示す繊細な指標としてますます利用されています。^3,4。

土壌呼吸は複数の由来から導かれ、一般的には主に2つの生物学的要素に分類されます。植物の根の代謝や根圏に関連する微生物に起因する自養呼吸と、土壌^有機物の微生物分解に関連する異栄養呼吸^5,6。炭酸塩風化⁷や光分解⁸などの非生物学的要因も特定の条件下で寄与する可能性があります。微生物代謝のみに起因する異栄養成分を分離するためには、植物由来のCO₂フラックスを除外する必要があります。

この文脈において、微生物呼吸とは、好気性または嫌気性^{代謝過程の結果}として、細菌、菌類、原生動物、藻類などの微生物がCO₂を産生またはO₂を取り込むことを指します。外部基質や最近の栄養分の入力がない場合、微生物の呼吸は基礎呼吸¹⁰と呼ばれます。基礎呼吸は在来微生物群集の内因性代謝活動を反映し、微生物のバイオマス、活動性、環境や人為的刺激に対する感受性の指標としてしばしば用いられます(^11,12)。

基礎呼吸を正確に評価するために、事前調整済み、ふるいにかけられ、均質化された土壌サンプルに対して実験室ベースの測定が行われます。この前処理は根や大型動物を効果的に除去し、自己栄養呼吸を排除し、異栄養微生物活動に焦点を当てることを可能にします。ふるい分けは元の土壌構造を変えますが、試料の均一性と再現性を向上させ、微生物駆動のプロセスの単独研究を容易に^します。培養は通常、25°Cおよび土壌圃場容量の60%といった制御された環境条件下で行われ、特定の官^能基を優先しつつ微生物活動を最適化^します。この文脈では、土壌水分と圃場容量が重要なパラメータであり、微生物の呼吸は基質の拡散、酸素供給、微生物代謝を調節する水の利用可能性に非常に敏感です。このため、基礎呼吸の測定は一般的に、圃場容量の割合で表される標準化された湿度条件下で行われます。潜伏期間中に発生したC-CO₂は基礎呼吸の指標として定量化されます¹⁵。

このプロトコルは、事前に調整された土壌中の基底呼吸を通じた微生物活動を評価することを目的とした制御された実験室培養研究に特に適しています。特に、有機改良剤やその他の攪乱などの異なる管理手法を受けた土壌を、均質化されたサンプルを標準化された温度・湿度条件下で比較するのに有用です。植物由来のCO₂投入を除外するため、この方法は圃場条件下での土壌呼吸の全量よりも、土壌呼吸の異栄養成分を評価するのに最も適しています。

土壌呼吸を定量化するためのいくつかの解析技術が開発されており、それぞれ感度、スループット、操作複雑さに異なりました(^9,16)。古典的なアプローチには、アルカリ吸収の後に滴定、導電法、ガスクロマトグラフィー、赤外線ガス分析が含まれます。アルカリ系法は堅牢で比較的安価ですが、時間的解像度が限られ、CO₂の不完全な吸収や漏れの影響を受けることがあります。伝導法は連続測定を可能にしますが、温度やイオン強度の影響を受けることがあります。ガスクロマトグラフィーは正確なヘッドスペースCO₂定量を提供し、他のガスの同時測定を可能にしますが、専門的な機器と訓練を受けた人員を必要とし、処理量が制限される可能性があります。対照的に、赤外線ガス分析装置(IRGA)は、制御された培養条件下でCO₂濃度を迅速かつ繰り返し監視できるため、微生物呼吸の時間分解測定に特に有用です。しかし、IRGA測定は再現性を確保するために適切な校正とインキュベーション条件の慎重な制御が必要であり、信号ドリフト、水蒸気干渉、高濃度CO₂での信頼性低下の影響を受ける可能性があります。最近の開発により、赤外線およびNDIRベースの土壌呼吸システムの入手可能性が拡大しており、実験室や現場での低コストチャンバーベースおよびセンサーベースのプラットフォームも含まれます ^24,25。密閉バイアル培養では、培養中の過剰なCO₂蓄積を避けるため、ヘッドスペースと土壌の比率および測定間隔を期待される呼吸速度に合わせて調整する必要があります。最近のIRGAベースのプロトコルも、制御された潜^{伏条件下での}土壌呼吸の標準化実験室測定を支援するために発表^{されており、土壌}呼吸測定の標準化された方法論的指針も最近のFAOプロトコル²⁸で提案されています。このより広い文脈では、基礎呼吸も長期農業実験における土壌健康評価の一要素とみなすことができます。これは微生物の代謝活動とCの鉱化を反映し、CO₂のフラッシュ、過マンガン酸酸化性炭素、土壌有機炭素などの指標は土壌機能の相補的側面を捉え^{ています。}本研究では、培養土壌サンプルからの基礎呼吸率を定量化するためにIRGAを用いました。この方法は、培養期間中のCO₂排出を繰り返し監視し、定められた湿度および熱条件下での微生物代謝活動の評価を容易にします。以下のプロトコルは、異なる管理条件下の土壌における基礎土壌呼吸測定に用いられる実験室手順を説明しています。

プロトコル

1. 準備

1. サンプル採取:
   1. 土壌層ごとに、表層調査の場合は0〜10cmの範囲でサンプルを採取してください。
      注意:微生物汚染を避けるために消毒済みの道具と手袋を使用してください。
   2. サンプルを等温バッグに入れ、冷蔵箱に入れて実験室へ運びます。
   3. 土壌の前処理がすぐにできない場合は、サンプルを4ºC(できれば48時間以内)に保ってください。
   4. サンプルを常温に2時間以上平衡させてから処理と培養を行います。
2. 材料準備および土壌前処理:
   1. 実験室の材料は10%の漂白剤または70%エタノールに30分間浸し、その後蒸留水で十分にすすいで自然乾燥させてから使用してください。
      注意:これらの化学物質を扱う際は手袋、白衣、眼鏡を着用してください。
   2. サンプルを室温で2時間放置して安定化させます。
   3. 2mmまで試料を篩してください。根や粗いゴミはピンセットで捨てます。
   4. 各サンプルの後は消毒液でふるいを洗い、ペーパータオルで拭き取ります。
3. 土壌水分(存在する水分量)と圃場容量(土壌を保持できる水)を決定します¹⁷。
   1. 土壌水分計算:セラミックカプセル内で20gのサンプルを24時間¹⁸ 秒間オーブン乾燥(105ºC)で測定します[式1]。
      [式1]
   2. 「リチャーズ」圧力膜装置を用いて現場容量を測定する¹⁹。
      1. プラスチックリングで区切られた装置のセラミックプレートの上に土壌サンプルを置きます。
      2. 水分を十分に満たして最低24時間入れてください。その後、残りの24時間に−0.33バール(−33kPa)の圧力をかけます。次に、式1に従って再び土壌水分を測定します。
4. 土壌密度(g·^mL-1)を決定します。オーブン乾燥した土壌サンプルをタールで塗った既知の容量の瓶に詰め、土の重さを記録します。土壌密度は瓶の重量と体積の比率です。
5. 培養のためのサンプル準備:
   1. インキュベーターの温度を25°Cに設定してください。 UNE-EN ISO 16072:2002(土壌品質:微生物呼吸測定のための実験室方法 https://www.iso.org/standard/32096.html)は、研究間の比較可能性のために温度を推奨しています。
   2. 水分条件の推定:各サンプルが初期土壌水分含有量^20,21から圃場容量の60%に達するために必要な蒸留液の量を計算します。これは実験開始時の水分レベルであり、潜伏期間中の水分調整は不要です。
   3. 土壌量の選択:使用する土壌の量は有機物含有量によって異なる場合があります(有機物含有量が高いほど実験に必要な土壌量は少なくなります)²¹.ただし、基準量としては20gが推奨されています。
   4. サンプルを100mLのガラスバイアルに入れ、フィールド容量の水分率60%まで変質水を加えます。バイアルをセプタウムで封し、インキュベーターに入れます。

2._CO2 濃度測定

1. 測定間隔:
   1. バイアルヘッドスケープ内の過剰なCO₂蓄積を避けるため、土壌の予想される呼吸速度に応じて特定の間隔で_CO2 測定を行います。
   2. 微生物活動の抑制を防ぐために、10%(100,000 ppm)を超える濃度は避けてください。濃度がこの閾値を超える場合は測定間隔を短縮します。最初の1週間は毎日、その後は3〜4日ごとに測定を行い、後述の代表例を示します。
2. 赤外ヘッドスペースガス分析装置(IRGA)によるCO2濃度(%)の測定
   1. 各測定セッション前に、メーカーの指示に従って、またはゼロ標準(CO₂フリー空気または窒素)と測定範囲内の既知のCO₂濃度のスパン標準を用いてIRGAを校正してください。機器の安定性を確認し、メーカーの指示に従って基準ドリフトの補正を行います。試料測定前に校正パラメータを記録しましょう。
   2. 材料リストに記載されているIRGA装置では、1本の毛細管を持つ針を器具に接続します。
   3. ネドルをセプタムからバイアルに挿入し、ガスのアリコートを抽出し、CO₂濃度(%)を記録します。
   4. 信号が安定するまでサンプルごとに繰り返し読み取りを行います。
3. 試料再調整
   1. バイアルは測定後、空気を新たにし嫌気性状態を防ぐため、ほこりや空気の流れから守られた清潔な場所(できれば層流チャンバー内)に30分間開けておくと良いです。このエアレーション工程では、土壌を混ぜたり攪拌したりしないでください。
   2. セプタムでバイアルを再封し、インキュベーションチャンバーに戻します。
4. CO2の補正
   1. 土なしの同じ操作条件のバイアルを追加して、空洞を考慮します。
   2. 環境の_CO2 条件を除去するために、サンプル数にブランクの値を差し引く。
      注意:開封したバイアルの近くで息を吐くときは注意してください。これが結果に偏りをつけることがあります。

3. 土壌基礎呼吸(SBR)の計算

1. バイアル内のヘッドスペース体積(Vhs)は、土壌(バルク密度)と添加された水分をバイアル全体の体積から差し引いて求めます[式2]。
2. 土壌の体積をバルク密度測定で推定し、添加水分による水量を計算します。この補正済みヘッドスペース体積を、その後のすべての計算に用いてください。
3. バイアル内のヘッドスペース体積の測定(Vhs):バイアルの体積から土壌および水分の体積を引いたものを指します[式2]。
   [式2]
4. バイアル中のCO₂体積の推定
   1. バイアル内のCO₂体積は、バイアルの体積の有効ヘッドサプスを考慮したIRGAの_CO2 濃度(%)から取得します[式3]。
      
      [式3]
5. 土壌サンプルから吐出されるCO₂モルの推定値:
   1. 土壌試料から吐出されるCO₂モルは、理想気体の法則方程式(P ∙ V = n ∙ R ∙ T)[式4]で解き、先に計算されたVを[式3]に置き換えて得ます。
      [式4]
6. CO₂フラックスの推定(mg C-CO、₂ ^kg-1 、乾燥土壌¹日目)
   1. CO2%の個別測定を加え、最終的な_CO2フラックスは[式5]を用いて推定されます。以下の点を考慮します:i) 土壌水分を考慮した正しい試料重量;ii)_CO2 1モルが12gのC(12000 mg C)を占めることを考えます。
      
      [式5]
      ここで:
      P = バイアル内のガス圧。これは大気(atm)に相当するはずです。あなたの位置情報に合った値を正しく設定してください。
      Vhs = バイアル内のガスヘッドスペース体積(L)
      [% CO₂ ]= IRGAで測定された_CO2 濃度
      R = 気体定数 = 0.082 L·atm·K⁻¹·mol⁻¹
      T = ケルビンの抱卵温度
      乾燥土 = 乾燥土壌質量(kg単位)
      t = 潜伏時間(日数)
      プロトコルの概要ワークフローは図1に示されています。

図1:IRGAベースの土壌基底呼吸プロトコルのワークフローは、土壌サンプリングや前処理からインキュベーション、IRGA測定、計算までです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

この記事で示された結果は、肥沃度の低い土壌に堆肥を施して肥沃度と微生物活性を高める実験に対応しています。元の土壌は「タベルナス砂漠」(スペイン南東部)で調査され、半乾燥気候で土壌が未発達な地域^です。約40kgを1つの農地上部30cmから採取し、実験室に持ち込み2mmを篩にかけて細粒土の比率を得ました。これは6つのポット(10リットル容量)に配布され、そのうち3つは10%の用量(水:水)で、下水汚泥と作物残渣から得られる堆肥を用いて改良されました。

サンプルは定期的に混合・湿料(圃場容量の60%)で、堆肥を土壌に溶込ませるようにしました。実験開始から1か月と3か月後、各鉢を採取しました。土壌の主な特徴は表1に示されています。

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ディスカッション

土壌呼吸は微生物活動や有機物分解の敏感な指標であり、土壌管理の影響に関する注目すべき情報を提供します ^23,24。本記事で述べた実験的アプローチは、制御された^{実験室条件下}でCO₂排出測定を通じて土壌微生物活動を定量化するシンプルかつ強力な枠組みを提供し、Garcíaら(2003)²¹を基に更新されました。繰り返し測定によるインキュベーションセットアップにより、累積および日々のCO₂フラックスを解析でき、土壌呼吸の時間的動態や生態系の機能に関する貴重な洞察を提供します^29,3。

前節で述べた実験は、堆肥添加による有機物の増加に対する乾燥土壌の微生物学的応答を評価するものでした。結果は、有機物...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 mm sieve
気密フラスコまたはセプタ付きのびん（100 mL）
分析バランス
バー圧力プレート抽出器	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	田圃容量を計算するため
脱イオン水または滅菌済みの蒸留水
インキュベーター機器	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
消えないマーカー
IRGA CO2濃度計	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
断熱バッグと箱			土壌を研究エリアに輸送するため
実験室オーブン			105ºCの設定が可能なものである必要がある
層流チャンバー	CRUMA	HZ-1	ステップ2.3でオプション
セプタストッパーでびんを密閉する
土壌サンプル			研究エリアから代表的な方法で収集する
滅菌試薬			塩素系漂白剤（10%）またはエタノール（70%）を使用可能