ルシフェラーゼベースの生存可能性アッセイを用いたヒト大腸オルガノイドにおけるカドミウム毒性評価の標準化プロトコル

サマリー

このプロトコルは、ヒトの大腸オルガノイドの確立と、カドミウム誘発性毒性の検出のためのルシフェラーゼベースのATP生物発光アッセイの評価を目指しています。この方法は、用量および時間依存的なオルガノイド生存率の変化を定量化することで、アッセイの実現可能性と感度を評価します。

要約

カドミウム(Cd)はグループ1の発がん性物質に分類され、深刻な地球規模の環境問題を構成しています。本研究は、ヒトの大腸オルガノイドモデルを確立し、Cd曝露に対する大腸オルガノイド(CO)の毒性反応を検出するためのルシフェラーゼベースのATP生物発光アッセイの実現可能性と感度を評価することを目的としました。幹細胞はヒトの大腸直腸組織から分離され、基底膜マトリックス内の三次元培養でCOを生成しました。オルガノイドは異なる曝露期間に応じて段階的にCd濃度のシリーズで処理されました。発光性試薬を等体積比で加え、室温で揺らして溶融と試薬の浸透を促進し、その後生物発光反応を進行させるために培養しました。発光はマルチモードマイクロプレートリーダーで発光モードで記録されました。用量反応曲線のフィッティングを用いて半最大阻害濃度を算出し、生存可能性または相対生存性の変化を評価する。一次幹細胞はヒト大腸直腸組織から成功裏に単離され、COの生成に用いられました。Cd曝露は線量依存的および時間依存的なオルガノイド代謝活動の低下をもたらしました。線量反応解析により、オルガノイドの生存曲線およびIC50値が得られました。本研究は、環境重金属毒性学研究におけるヒトCOの利用に関する方法論的指針と実践的な洞察を提供します。

概要

CDは自然に存在する重金属で、グループ1の発がん物質に分類され、世界的な環境問題^{となっています。}人間のCdへの曝露は主に吸入や食事摂取によって起こります。慢性的な低用量曝露はさまざまな健康悪影響と関連していますが、その使用と環境放出を大幅に減らすことは依然として^{困難です。}従来の二次元培養は平坦な基質上で成長し、組織構造や細胞極性、腫瘍微小環境を欠いています。そのため、彼らはカドミウム曝露に対する生体内の異質性や本物の毒性学的応答を再現する能力が限定的^です。これらのシステムは細胞間相互作用、マトリックス依存的成長、または^薬剤耐性の発生の生物学的プロセスを十分にモデル化できません5。患者組織由来の三次元オルガノイドシステムは、従来の二次元^{細胞株に比べて}生理学的により関連性の高いプラットフォームを提供します6。オルガノイドは一次組織のゲノム的特徴、組織学的組織、機能状態を保持します。これにより腫瘍の成長、進化、カドミウム毒性に対する感受性をより正確にモデリングでき、疾患モデリングや毒性学研究に明確な利点をもたらします⁷。COは複雑な三次元構造、細胞の異質性、^{自己更新と}自己組織化の内在能力を有しています^8,9。COをレシピエントマウスに移植することで、腸内幹細胞の自己更新を促進し、宿主免疫微小環境を調節して保護効果をもたらすことができます^。2009年、Satoらは単一の成人Lgr5⁺腸幹細胞が自発的に自己組織化・分化し、すべての腸細胞系統を包含するクリプト-絨毛構造を形成できることを初めて示^{しました。}

腸上皮は、摂取後のCd中毒に対する最初の防御線を構成します。実際、Cdの経口バイオ利用能は通常5%未満です。CD誘発性腸毒性は、細胞間接合部の破壊、細胞外透過性の増加、炎症反応の誘導を特徴とします。さらに、Cdは腸内免疫機能を乱し、腸内細菌叢の組成および恒常性を変化させます¹¹。曝露量や期間によっては、Cdは細胞周期の調節障害を引き起こし、ある文脈では発がん性表現型を促進し、他の場合はアポトーシスを誘発します。CDは間接的に活性酸素(ROS)の産生を刺激し、酸化ストレスや酸化還元の不均衡を引き起こすことがあります。受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、接着分子、転写因子の機能は、酸化還元シグナルによって調節されることがあります。Cdはまた、シグナル伝達カスケードを乱し、ERK1/2、JNK(c-Jun N末端キナーゼ)、p38 MAPK(p38ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ)の活性化状態を複数の細胞型にまたがらせます¹²。MAPKカスケード内でERK1/2を活性化することで、Cdは細胞増殖と生存を促進し、プログラム細胞死を抑制し、異常な過剰増殖に寄与します¹³。CDは主要なエフェクタータンパク質の発現と活性を直接的または間接的に調節することができます。例えば、腫瘍抑制因子p53をダウンレギュレーションし、Bcl-2やBcl-xLなどの抗アポトーシスタンパク質を上行調節し、最終的にアポトーシスや細胞周期恒常性を破壊^します。

Cdの細胞毒性効果を評価するCOモデルでは、ATP含有量測定がオルガノイドの生存可能性を評価するために広く用いられています。エネルギー代謝の中心分子であるATPは、オルガノイドの全体的な代謝状態と生存可能性を直接反映します。CO中のカドミウム曝露時、Cdは主にミトコンドリア機能障害を引き起こし、酸化ストレスを悪化させ、オルガノイドエネルギーの恒常性を乱します。これらの出来事はATP産生を損ない、最終的にオルガノイドの生存能力を低下させます。したがって、ATPレベルの変化はカドミウム誘発性細胞毒性の堅牢な機能的指標となります。従来の細胞毒性アッセイには、比色MTT/CCK-8アッセイ、ライブ/デッド染色法、フローサイトメトリーに基づく解析が含まれます。これらの手法と比較して、ATPベースのアッセイは三次元オルガノイド系において明確な利点を提供します。オルガノイドの構造的複雑さと顕著な空間的異質性のため、従来の染色やイメージング手法は、組織浸透力の不足や定量的精度の低下によりしばしば制限を受けます。これに対し、ATPアッセイはルシフェラーゼを媒介した生物発光反応に依存し、オルガノイド構造を破壊することなく直接定量が可能です。ATP測定は高い感度と広いダイナミックレンジを示します。これにより、初期代謝抑制からオルガノイド死に至るまでの連続的な生物学的応答を検出でき、異なるカドミウム濃度における正確な線量反応解析が可能となります。ATPレベルはオルガノイドの全体的な機能状態を包括的に反映しており、形態評価や単一分子マーカーに依存するアプローチを上回ります。したがって、このアッセイは高スループット毒性スクリーニングに特に適しており、安定性と再現性の向上を提供します。

ATP生物発光を用いてCOのCd曝露感度を評価する基本的な原理は、ホタルルシフェラーゼがATP、^{Mg 2}⁺、O₂の存在下でD-ルシフェリンを酸化させ、オキシルシフェリンを生成して光子を放出するという点にあります。放出される光の強度は、定義された線形範囲内の試料中の測定可能なATP含有量に比例します。したがって、発光は細胞の代謝活動や生存可能性の間接的な定量的代替として機能します。オルガノイドは細胞外マトリックスに埋め込まれ、多層的な三次元構造を持っています。これに対応するため、ATPアッセイ試薬は最適化された溶解バッファー組成と手順を備えています。これらの最適化により、内部オルガノイド細胞の破壊が改善され、ATPの放出が促進され、生物発光信号が安定化します¹⁵。重要なのは、ATPの生物発光は正確な細胞数ではなく代謝活動を報告することです。例えば、ミトコンドリア阻害剤は細胞が生存している間でも短期間で細胞内のATPレベルを著しく低下させることができます。逆に、初期の細胞死の形態では、比較的高いATPレベルが一時的に維持されることもあります。

カドミウム(Cd)毒性評価において優れた生理学的関連性を示しているにもかかわらず、大腸オルガノイドモデルにはいくつかの実用的な制約があります。従来の二次元(2D)細胞株と比べて、オルガノイド培養はより時間がかかりコストがかかります。さらに、動物由来マトリックスへの依存によりバッチごとの変動が生じ、大規模かつ高スループットの毒性スクリーニングでの有用性が制限されます。これらのモデルは重金属が腸上皮に直接作用する毒性学的効果を評価するのに非常に適していますが、体内での全身毒性や複雑な毒性化学反応の評価モデルを完全に置き換えるにはまだ十分ではありません。

本研究では、ヒト大腸直腸組織を原料として用いて大腸幹細胞を単離し、in vitroでCOを確立しました。オルガノイドは様々な濃度と曝露時間でCdにさらされました。その後、発光検出モードでマルチモードマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定しました。細胞生存率またはIC50値は、特定のマイクロプレートリーダー用の運用ソフトウェアを用いて計算・可視化されました。

プロトコル

この実験は蘇州職業保健学院倫理委員会によって承認されました(承認番号:SWYXLL202516)および医療倫理基準に従って実施されました。本研究のすべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. ヒト大腸直腸組織の単離およびCOの確立

1. 組織サンプルの輸送と保存
   1. 実験前に、基底膜マトリックスを4°Cでゆっくり解凍し、必要な培地を室温に平衡させます。
   2. 臨床処置で得られたヒト大腸直腸組織を、事前に冷却された組織保存液(2〜8°C)に直ちに置きます。
      注意:輸送中は組織が完全に浸かっていることを確認してください。サンプルを検査室に移してください。
2. バイオセーフティキャビネットの下に、組織を6cmの培養皿に入れて評価します。上皮部分は保持しつつ、メスと鉗子を使って目に見える脂肪組織や筋肉層を慎重に除去してください。
3. 組織を3 mLのリン酸塩緩衝生塩水(PBS)と300 μLの抗生物質を補足した6cmの皿に移します。組織を2mm×5mmの断片に切り分けます。
4. 組織断片を50mLの遠心分離機チューブに移します。
5. チューブに予備冷却されたPBS10 mLと0.5 M EDTA(最終濃度~10 mM)200 μLを加えます。
6. チューブを室温のシェーカーに置き、0.072gで15分間優しくかき混ぜます。
7. 鉗子を使って組織を培養皿に移し、顕微鏡で観察します。地下室の構造が見えるようになったり、剥離し始めたら次のステップに進みましょう。
   注:EDTA処理後にクリプト構造が顕微鏡観察で見えるようになると、消化は一般的にクリプトの分離に十分なレベルに達しており、クリプトは緩んだ上皮組織の断片から剥がれ始めます。完全なクリプトは通常、明確な腺体または管状の形態と識別可能な中央腔を保持しますが、過度の消化は多数の解離した単細胞や壊死した破片を生じさせます。
8. 多数の無傷の骨髄が見え、組織片が緩く半透明になったら消化を終了し、優しいピペッティングで骨幹を容易に排出できます。
   注:EDTAの長期培養はクリプトの完全性を乱し、細胞残骸の蓄積を増加させ、腸幹細胞の生存率を低下させ、その後のオルガノイド形成効率を低下させます。
9. 抗生物質補充のPBSを15mL追加してEDTAの消化を止めます。優しく混ぜてください。
10. 300 × g で4°Cで3分間遠心分離します。
11. 上清液を取り除きます。
12. 1mLの全細胞培地を加え、懸濁液を1.5mLのマイクロ遠心分離管に移します。
13. 懸濁液を300× g で3分間遠心分離し、上澄液を捨てます。
14. 基底膜マトリックス500μLを1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに加え、よく混ぜます。
15. 混合時の室温への曝露を最小限に抑え、基底膜マトリックスは氷の上に置いて早期固化を防ぎます。
16. 24ウェルプレートの各ウェルに25μLの混合物を滴り加えて液滴を形成します。
17. 24ウェルプレートを逆さにし、37°Cで5%のCO₂を含んで20分間培養します。
18. 各ウェルに600μLのCO培養培地を加えます。
19. 市販の大腸オルガノイド培養培地および解離試薬を入手し、製造元の指示に厳密に従って使用してください。
20. 完全な細胞培養培地を準備するには、DMEM基礎培地500 mLに胎児用牛血清(FBS)50 mLおよびペニシリン・ストレプトマイシン5 mLを補足します。溶液を優しく逆さまに混まらせます。

2. Cd曝露COの感度アッセイ

1. 96ウェルプレートでのCOの板付けと培養
   1. 各ウェルから培地を廃棄し、500μLのオルガノイド解離液を加えます。ピペットを上下に優しく動かして、地下室の膜マトリックスを分散させます。
   2. 処理済みプレートを37°C、CO₂5%インキュベーターに入れて消化し、初期消化時間は10分です。
   3. 24ウェルプレートの各ウェルから消化液を15mL遠心分離機チューブに回収し、10mLの完全培養培地を加えます。
   4. 300 × g で遠心分離機で3分間オルガノイドを採取し、上清液を捨てます。
   5. 1mLの全細胞培養培地を加え、ピペットで十分に混合し、懸濁液を1.5mLのマイクロ遠心分離管に移します。
   6. 300× g で3分間遠心分離し、その後上清液を捨てます。
   7. 基底膜マトリックス100μLを加え、ピペッティングで十分に混合します。
   8. オルガノイドを解離し、顕微鏡で単一細胞の数を推定した後、1孔あたり約3,000〜5,000個の単一細胞をシードします。
   9. すべての実験群で比較的一貫したシーディング密度を維持し、再現性のあるオルガノイド成長と実験結果を保証します。
   10. オルガノイド解離後の顕微鏡的評価と、オルガノイド培養研究でよく用いられる既に報告された条件に基づいてシーディング範囲を調整します。
   11. 96ウェルプレートの各ウェルの中心に6μLの混合物を加えます。合計30井戸を使用し、3つの技術的複製を用います。
   12. プレートを逆さにして、37°Cで5%CO₂インキュベーターで15分間培養します。
   13. 96ウェルプレートの各ウェルに100μLのオルガノイド培養培地を加えます。
   14. 種まきからちょうど7日後にカドミウム処理を開始してください。
       注:この7日間の培養期間により、単一細胞が構造的に完全なCOに完全に発達します。
2. CD濃度希釈
   1. 3.67 mgの塩化カドミウム粉末を2 mLの滅菌超純水に溶かし、最終体積2 mLの10 mMストック溶液を準備します。
   2. 10 mMのカドミウム溶液2 mLを0.22 μmフィルターに通して滅菌します。
   3. 滅菌したカドミウム溶液を1.5mLの遠心分離機管に分割し、光を遮断して4°Cで保存します。
   4. 実験中は、白衣、防護手袋、安全ゴーグルなどの適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。
   5. 関連するすべての作業は化学換気フード内で行い、曝露リスクを最小限に抑えましょう。
   6. カドミウム補完培養培地、ピペットチップ、遠心分離機管、培養皿など、すべてのCD含有廃棄物を有害化学廃棄物として分類・管理します。
   7. これらの物質は指定された重金属液体廃棄物または固体廃棄物の収集容器に捨ててください。
   8. すべての廃棄物は、制度のガイドラインおよび地域の環境規制に厳格に従って処分してください。
   9. CD廃棄物を一般的な実験室のゴミとして扱ったり、シンクに流したりしないでください。
   10. 24ウェルプレートの蓋に4、3、2、1、0とラベルを付けます。
       注意:オルガノイドは最終濃度40μM、20μM、10μM、5μM、0μMでCd処理してください。カドミウムストック溶液の希釈は標準式で計算されました:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. 20 μMの作動濃度4 mLを調製するには、10 mMのストック溶液8 μLを3992 μLの完全な培地に加えます。溶液を十分に混ぜて均一な分布を確保してください。
   1. 標示されたウェル4に培地1.4mLを加え、残りのウェルにそれぞれ700μLの培地を加えます。
   2. 標識済み4のウェルから5.6μLの培養培地を取り出し、5.6μLのカドミウム溶液を加えます。よく混ぜてください。
   3. 「4」とラベル付けされたウェルから「3」ウェルに700μLの溶液を移し、十分に混ぜます。
   4. 各井戸から次の低い番号井戸へ(「3」から「2」、「2」から「1」、「1」から「0」へ)へ移送と混合のプロセスを繰り返し、各ステップでしっかりと混ぜます。
      注意:0とラベル付けされた井戸内でいかなる操作も行わないでください。
   5. インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、既存の培養培地を廃棄します。
   6. 96ウェルプレートの蓋板を左から右へ40μM、20μM、10μM、5μM、0μMとラベル付けします。
   7. 各標識井にカドミウム含有培地100μLを加えます。
   8. プレートをインキュベーターに入れてください。

3. 発光性試薬の添加

1. −20°Cの冷凍庫から発光性試薬を取り出し、室温で解凍します。発光性試薬を1:1の体積比で加えます。
2. 使い捨て試薬タンクに発光生存試薬2.5mLを加えます。
3. 大腸オルガノイド培地2.5mLを加え、ピペットで十分に混ぜます。
4. 廃棄吸引システムを用いて、96ウェルプレートの各ウェルからオルガノイド培養培地を除去します。井戸から基底膜マトリックスを吸引するのは避けてください。
5. 使い捨て試薬リザーバーから200μLの溶液をCOを含む96ウェル板の各ウェルに移し、激しいピペッティングで十分に混合します。ピペッティング中に気泡を混入させないように注意してください。
6. 皿を室温で25分間孵化します。室温で光を遮って孵化させます。

4. 発光性試薬測定

1. 特定のマイクロプレートリーダー用の操作ソフトウェアを開きます(補足図1A)。
2. 「今すぐ読む」をクリックしてください(補足図1B)。
3. 「新設」をクリックします(補足図1B)。
4. 「読む」をクリックしてください(補足図1C)。
5. 選択的な発光(補足図1D)。
6. 選択用ルミネセンスファイバー(補足図1D)。
7. OKをクリックしてください(補足図1D)。
8. フルプレートを選択してください(補足図1E参照)。
9. 「すべてクリア」をクリックします(補足図1F)。
10. ターゲットの96ウェルプレート上の対応する位置を選択し、合計15ウェルとなります(補足図1G)。
11. OKをクリックしてください(補足図1G)。
12. 96ウェルプレートを装置に挿入します(補足図1H)。
13. 「蓋を使う」を選択してください(補足図1I)。
14. 測定を開始するにはOKをクリックしてください(補足図1I参照)。
15. 測定完了後、エクスポートをクリックしてデータをExcelにエクスポートします(補足図1J参照)。

5. データ処理と解析

1. 非線形回帰が可能なオープンな統計データ解析ソフトウェア。(補足図2A)
2. XYデータ表を選択してください(補足図2A参照)。
3. Xを数値に設定します(補足図2A)。
4. Yを入力に設定し、並列のサブカラムで値を複製し、3回の重複を入力します(補足図2A参照)。
5. データの導入(補足図2B)。
6. クリック分析(補足図2C)。
7. XY解析(補足図2D)をクリックしてください。
8. 非線形回帰(曲線適合)(補足図2D)をクリックしてください。
9. OKをクリックしてください。(補足図2D)。
10. 選択用量反応-阻害(補足図2E)。
11. 対数(阻害剤)と正規化反応の選択 – 可変傾き(補足図2E)。
12. 解析を実行するにはOKをクリックしてください(補足図2E)。
13. ファイルをクリックしてください(補足図2F)。
14. 「エクスポート」をクリックします(補足図2F参照)。
15. 「OK」をクリックしてください(補足図2G)。

結果

人間のCOの設立
組織サンプルから大腸窩構造を単離することに成功し、低倍率・高倍率両顕微鏡で典型的な陰部の形態が明確に観察されました。in vitro培養中、孤立したクリプトは徐々に拡大し、秩序ある形態的成熟過程を示しました(図1A,B)。培養3日目と6日目までに、構造的に完全な大腸オルガノイドが形成され、主に球状または早期出芽状の構造を示しました(図1C,D)。

COのCD曝露に対する感度
COは96ウェルプレートにシードされ、さらに5日間培養された後、0、5、10、20、40μMの濃度でカドミウム処理が行われました。72時間の曝露後、ATPベースの発光アッセイを用いて相対発光単位(RLU)を測定し、データを解析・可視化しました。結果は、カドミウム濃度の増加に伴い、オルガノイド生存率が線量依存的に有意に低下することを示しました(図2A)。10μM、20μM、40μMのカドミウム曝露COは著しくRLU値が低下しました(図2B)。5μM Cd曝露された大腸オルガノイドでは有意な毒性は観察されませんでした。生存可能性データと一致して、形態学的解析ではカドミウム処理された大腸オルガノイドに顕著な構造変化が見られました。これにはオルガノイドサイズの縮小、上皮構造の深刻な破壊、進行性の構造断片化が含まれます(図2C)。これらの発見は、大腸オルガノイドがカドミウム誘発性の細胞毒性に非常に敏感であることを示しています。

図1:ヒトの大腸窩の分離と大腸胞臓器培養の確立。 (A) 孤立したヒト大腸窩の代表画像。(10×)。(B) 単一の地下室の高倍率ビュー(20×)。(C) 培養3日後のCOの代表的な画像(4×)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:COにおけるCd誘発性の細胞毒性および形態的変化。 (A) 異なる濃度のCdにさらされたCOの相対的な線量反応曲線。x軸はCd濃度を表し、y軸はオルガノイドの相対的な生存可能性を示します。(B)異なる濃度のCd処理後のCOの相対的なRLU値。X軸はCd濃度を表し、Y軸は相対的なRLU値を示します。一方元ANOVA *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。(C) 未処理(0 μM)およびCd処理COの代表的な明視野画像(5 μM、10 μM、20μM、40μM)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

補足図1:特定のマイクロプレートリーダーの運用ソフトウェアを用いたRLU検出の詳細な16ステップワークフロー。 (A) ソフトウェアアイコン。(B) ソフトウェアローンチインターフェース。(C) 設定メニュー。(D) アッセイ選択インターフェース。(E) プレートレイアウト設定メニュー。(F)デフォルトのプレート配置。(G)実験板の配置に従って井戸の位置を設定すること。(H)マイクロプレートを装填中。(I) 装置がRLU測定を開始する。(J) データエクスポート。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:その後のデータエクスポート、データ処理および統計解析が統計データ分析ソフトウェアで行われます。 (A) ホーム画面。(B) データ入力テーブル。(C) 分析ダイアログ。(D) 分析パラメータメニュー。(E) 非線形回帰の設定メニュー。(F)ファイルオプションメニュー。(G) データエクスポートダイアログ。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究は、カドミウム曝露およびATP生存可能性アッセイの標準化されたプロトコルを確立し、COを用いてカドミウムがオルガノイド生存可能性に与える影響を評価することを目的としています。このプロトコルは、オルガノイド解離および96ウェルプレート工程を最適化し、実験的再現性とその後のATPアッセイ表示の安定性を高めます。現在の実験プロトコルは主にCd毒性評価のための3次元大腸がんオルガノイドモデルの確立に焦点を当てていますが、広範な研究により、従来の2D細胞培養と3Dオルガノイドモデルは薬物反応、細胞間相互作用、組織構造、毒理学的プロファイルにおいて有意に異なることが示されています。2次元単層と比べて、オルガノイドは腫瘍の空間構造、細胞の異質性、生体内微小環境をより忠実に再現し、優れた生理学的関連性を提供します。複雑な細胞間および細胞外マトリックス(ECM)相互作用が存在しないため、2次元培養の重金属曝露への応答は、実際の生体内毒性学的プロセスを正確に捉えきれない可能性があります¹⁶。逆に、本研究で確立されたCOモデルは腫瘍組織の三次元成長動態を効果的にシミュレートし、Cd誘発毒性を評価するための生理学的に非常に重要なプラットフォームを提供します。

オルガノイド通過時は、解離時間が約10分と厳密に維持されていました。この最適化により、不完全解離が過剰に大きな細胞集合体になるのを防ぎ、過剰解離による過剰な単一細胞数の発生も防げます。解離の程度を正確に制御することで、比較的均一なオルガノイド構造を得て、その後の薬理治療やATP生存可能性アッセイの一貫性を高めました。

高スループットの96ウェル培養システムを用い、基底膜マトリックスプレート容積を1ウェルあたり6μLに標準化しました。この標準化により、すべての井戸間で一貫したオルガノイド密度と成長特性を確保することで、井戸間変動を最小限に抑え、最終的には実験の再現性とデータ比較性が向上します。ATP発光アッセイと統計データ解析ソフトウェアを用いた線量応答曲線解析を組み合わせることで、Cd曝露後のオルガノイド生存率の変化を定量的に評価する堅牢な評価を実現しました。本研究は、環境毒性学および重金属曝露におけるオルガノイドモデルの応用に関する非常に再現性の高い実験プロトコルを確立します。

COs培養中、クリプトペレットと基底膜マトリックスを徹底的に混合することは、適切なCO生成と安定した成長を確保するための重要なステップです。基底膜マトリックスの割合は70%以上に保つべきです(基底膜マトリックスの体積は70%>)。推奨されるベースメント膜マトリックス容積は、96ウェルプレートで1ウェルあたり6μL、48ウェルプレートで20μL、24ウェルプレートで25μLです。マトリックス重合後、ウェルに以下の体積を加えます:96ウェルプレートは1ウェルあたり100μL、48ウェルプレートは300μL、24ウェルプレートは500μLです。培地を基底膜マトリックスドームに直接ピペットで送り込むことは避けるべきで、これは三次元構造を乱す恐れがあります。表現型および遺伝的安定性を維持するため、本研究では大腸オルガノイドの使用を最大4回に制限しました。

クリプトやCOが直径約600μmに達したり、暗化や成長停止を示す場合は、次の感度解析を可能にするために迅速にパッセージを行うべきです。酵素解離中は、消化を顕微鏡で監視する必要があります。COが十分に小さな細胞クラスターや単一細胞に解離されない場合、オルガノイドの大きさや解離状態に応じて消化時間が徐々に延長されることがあります。過剰消化や細胞生存能力の喪失のリスクを最小限に抑えるために、単一段階での長期消化は避けるべきです。

次の式で各井戸の相対的生存可能性を計算し、各濃度の応答値として複製井戸の平均パーセンテージを用います

 

ATP生物発光アッセイは、ホタルルシフェラーゼによるD-ルシフェリンの酸化を基にしており、これにより光子放出が発生します。高感度、プレートベースの高スループットフォーマットとの互換性、そして標準化された市販キットの利用可能性により、この方法はオルガノイドモデル¹⁷の予備毒性スクリーニングに広く適用されています。

いくつかの交絡要因を考慮する必要があります。特定の化学物質は化学的干渉や酵素抑制を通じてルシフェラーゼ酵素反応を直接阻害し、シグナルの抑制を引き起こすことがあります。三次元細胞外マトリックスからの背景発光、オルガノイドのサイズと密度の不均一性、不完全な溶解は、井戸間およびバッチ間に大きな変動をもたらすことがあります。ATPベースの発光だけでは細胞死の様式を正確に区別したり、その毒性学的メカニズムを解明したりすることはできません¹⁸。

方法論的信頼性を高めるために、体系的な品質管理措置が推奨されます。メーカー推奨または既に検証済みの溶解バッファーを使用し、必要に応じて拡張溶解時間、機械的解離、凍結・解凍サイクルを用いて、マトリックス内の細胞溶解効率を向上させます。次に、アッセイ最適化中にATPスパイクイン回収実験を行い、試験化合物や溶解環境による発光反応の直接的な阻害の可能性を評価すること。第三に、ATP標準曲線を用いて線形検出範囲を確認し、試薬添加、培養、プレート読み取りのタイミングを厳密に制御して技術的な変動を最小限に抑えること。最後に、各アッセイにブランク、ビークル、ネガティブコントロールを含め、エッジ効果やバッチ関連の変動を評価・補正するための十分な技術的再現を組み込みます。近年、溶解化学が改善され信号安定性が向上したオルガノイド最適化された生存可能性アッセイがいくつか開発されており、これらの製剤は三次元毒性^アッセイにおいて一般的に優れた性能を示している。まとめると、本研究はヒトCOを環境重金属毒性学のin vitroモデルとして用い、高スループットかつ感度の高いATP生物発光ベースのアッセイを確立して、Cd曝露に対するオルガノイド感受性を評価する方法を確立しました。本研究は、オルガノイドを用いた研究システムにおける毒性評価のための実践的な実験的参照および方法論的指針を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	特定のマイクロプレートリーダーの運用ソフトウェア。
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	1:1の体積比の蛍光生物学的活性試薬。
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	基底膜マトリックス
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	オルガノイド解離溶液
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		特定のマイクロプレートリーダーの運用ソフトウェア。
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S