自己組織化された間葉幹細胞集合体由来の細胞外小胞の単離および治療的応用

サマリー

このプロトコルは、自己組織化された幹細胞集合体から大きな細胞外小胞(LEV)を効率的に分離し、下顎骨再生に治療的応用する方法を詳述しています。

要約

細胞外小胞(EV)は細胞間コミュニケーションの重要な媒介者であり、再生医療における細胞フリーエージェントとして有望です。EVサブポピクルの中で、大型の細胞外小胞(LEV)はその豊かな再生促進貨物により組織修復に特に適しています。しかし、機能的な歯科幹細胞由来LEVを下流の特性評価や治療評価のために生成する標準化かつ再現性の高い手法は依然として限られています。頂端乳頭からの幹細胞(SCAPs)の卓越した骨形成能力を活用し、低接着条件下で自己組織化SCAP集合体を誘導する3D培養モデルを開発しました。このモデルは生理的な間葉結縮を模倣し、細胞間相互作用を有意に強化し、LEV分泌を促進します。細胞の生存率を維持しつつ、集合体の一貫性を高め、LEV産出を最大化するために重要な培養パラメータと取り扱いノートが提供されています。ここでは、3D集合体生成、差分遠心分離による分離、ナノ粒子追跡分析(NTA)に基づく粒子サイズ分布と濃度解析、そして下顎骨欠損修復のための熱架橋ハイドロゲルを用いた治療的投与を含む、機能的SCAP由来LEVの効率的な生産のための標準化されたプロトコルを提示します。このアプローチにより、LEV生成は下流の機構研究や頭蓋顔面再生における前臨床評価のための効率化を実現します。この最適化されたワークフローにより、一定の収量と濃縮されたプロステオジェニックカーゴを持つバイオアクティブLEVの再現性調製が可能となり、基礎研究を促進し、EV介在の頭蓋顔面再建の臨床翻訳を加速させます。代表的な用途では、ハイドロゲル充填LEVが欠陥部位に局所的なデポを提供し、移植時の便利な取り扱いを可能にします。この手法は、SCAP由来のLEVを作成するためのスケーラブルなプラットフォームを提供し、標準化された報告およびトランスレーショナルスタディ設計における重要な考慮事項を浮き彫りにします。このアプローチは、頭蓋顔面EV検査室でのより広範な普及を支援します。

概要

細胞外小胞(EV)は、細胞から放出される膜に結合されたナノ粒子であり、タンパク質、miRNA、脂質などの生物活性物質の移動を通じて細胞間コミュニケーションを媒介^します。EVサブ集団の中で、大きな細胞外小胞(LEV)は細胞膜からの直接放出と再生促進分子の固有的な富集が特徴であり、組織修復や再生に適している^4,5。再生医療において、間葉幹細胞(MSC)由来のEVは、全^{細胞療法の}有効な細胞フリー代替としてますます認識されています^6,7,8。これらは親MSCのパラクリン再生効果を再現しつつ、直接移植の制約である低い着床効率、免疫原性、バッチ変動(7,8,9,10)を回避しています。MSCの源としては、頂端乳頭からの幹細胞(SCAPs)が優れた骨形成および歯原性分化ポテンシャル^11,12,13を示しており、SCAP由来のEVは口顔面の骨および歯組織修復に特に魅力的です8。

特に、EVの生の生成と機能は細胞^微小環境に大きく影響^{されています。}従来の二次元(2D)単層培養は、自然組織の文脈から大きく逸脱^{し、しばしば}再生能力が低下したEVを生み出します¹⁸。対照的に、三次元(3D)自己組織化MSC集合体は、細胞密度が高く、細胞間接触が集中し、細胞外マトリックス(ECM)が濃縮され、構造的支持を提供し、細胞の接着、移動、運命の決定を調節する生化学的・機械的な手がかりを提供する生理的間葉結縮の重要な側面を再現します 19,20,21.このバイオミメティックな3Dマイクロ環境は、細胞間コミュニケーションとパラクリンシ^{グナル伝達}を強化する^{だけでなく、}EVの分泌を促進し、より高い収量と改善されたバイオアクティブ貨物プロファイル(24,25,26)を生み出します。このように、3D自己組み立てMSCアグリゲージを利用することは、^{再生用途向けの}機能的に強力なEVを得るための非常に有望な戦略として浮上しています。

集約由来のEVには明確な利点があるものの、3Dシステムからの分離や特性評価のための標準化されたプロトコルは依然として十分に発展していません。差動遠心分離などの現在のEV隔離手法は確立されており、EV^{生産のための}スケーラブルな枠組みを提供しています。同様に、MSC集合体を生成する方法も報告されており、多くの場合、ビタミンCによる細胞のカールと2D培養細胞からの凝集に依存しています²⁸。しかし、これらのビタミンC誘導集合体内のECM構造は、空間的に組織化された凝縮状の天然間葉組織の微小環境とは異なる場合があります。これに対し、低接着条件下での足場なし自己組織化は、間葉結合の主要な特徴に近似するコンパクトで球状の集合体の形成を促進します^19,29。現在、このような低接着誘発の3D SCAPアグリゲットからEVを分離し適用するための体系的かつ再現可能なワークフローが不足しています。実用的な観点から、従来の2D SCAP培養によるLEV生産は通常、ナノ粒子追跡解析(NTA)で11個¹¹個程度の範囲に入り、3D低付着集体はLEV出力を数倍に増加させつつ、後続の応用で再現性を維持することが期待されています。このギャップを埋めるために、SCAPsの固有の骨生成・歯学的機能を活用し、3D低接着集約を通じてMSCマイクロ環境を最適化する包括的なプロトコルを詳述します。このプロトコルにより高品質なLEVの信頼性の高い生産が可能となり、頭蓋顔面医学における細胞フリー再生療法の標準化ツールを提供します。

プロトコル

すべての動物実験は第四軍医大学の動物ケア・利用委員会の承認を受け、ARRIVEガイドラインに準拠して実施されました。人体サンプルの採取および使用は、第四軍医科大学倫理委員会(承認番号)によって承認されました。IRB-REV-2022187)。サンプル採取前にすべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントが取得されました。未成年者や同意を提供できないドナーについては、法定後見人から書面によるインフォームド・コンセントを取得しました。すべての試薬は無菌ろ過され、細胞培養手順は無菌を維持するためにバイオセーフティキャビネット内で行われました(材料 表参照)。すべてのヒト由来物質(歯、組織、一次細胞、調整培地、EV製剤)を感染性のあるものとして扱いましょう。人体サンプルを含むすべての手順は、適切な個人防護具(PPE)を用いて認証されたバイオセーフティキャビネット内で行い、白衣、手袋、目の保護具を着用してください。バイオセーフティおよび廃棄物処理に関しては、機関のBSL-2ガイドラインに従います:すべての人為由来物質および汚染された使い捨て品をBSL-2バイオハザード廃棄物として扱うこと;使用後は、機関承認の消毒剤で表面や設備を除染してください。液体バイオハザード廃棄物をラベル付き容器に収集し、承認された方法で無効化してから処分してください。シャープはすぐに認可されたシャープ容器に入れて処分してください(キャップの交換はなし)。動物組織・死骸および麻酔・化学残渣を規制対象のバイオハザード・化学廃棄物として扱い、該当する規制に従い機関サービスを通じて処分してください。

1. ヒトSCAPの分離と培養

注意:P/Sはバイオアクティブ抗生物質混合物であり、皮膚や目の刺激やアレルギー反応を引き起こす可能性があります。開封時のBSL-2バイオセーフティキャビネット内のハンドル;手袋と目の保護具を着用すること;エアロゾル発生を避けること;そして、機関の化学廃棄物ガイドラインに従って廃棄物を処分すること。コラーゲナーゼタイプI(溶液)はバイオアクティブ酵素であり、皮膚や目の刺激やアレルギー反応を引き起こす可能性があります。BSL-2バイオセーフティキャビネット内のハンドル;手袋と目の保護具を着用すること;ピペッティング中の飛沫やエアロゾル発生の回避、そして、機関の手続きに従って速やかに流出したものを除染すること。保管や使用中にコラーゲナーゼタイプIを光から守りましょう(材料表を参照)。

1. 健康なドナー(16〜21歳)から未熟な先端を持つ第三大臼歯を採取し、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で徹底的に洗浄します(材料 表参照)。
2. 無菌眼用ピンセットとハサミで根尖から乳頭組織を切り離し、小さな断片(< mm³)に刻みます。
3. すべての組織断片を15mLの遠心分離機チューブに移します。断片を2 mg/mLのコラーゲン酵素タイプIと共に37°Cで1時間消化し、15分ごとに優しく振る。
4. 消化を止めるために、同じ体積の完全な最小限α必須培地(α-MEM)を加えます(材料 表参照)。
   注:コラーゲナーゼタイプIの消化時間は固定されておらず、組織の消化状態に依存します。注意深く観察し、培地を加えて組織が半ば侵食されたら消化を終了させてください。過剰消化は細胞の生存能力を損なう可能性があります。
5. 細胞懸濁液を100 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を廃棄し、ペレットを完全なα-MEM2 mLに再懸濁します。
6. 消化組織懸濁液を10cmのペトリ皿に種まき、完全なα-MEMを8mL加えて、最終的な1皿あたり10mLの体積にします。
7. SCAPは37°Cで加湿インキュベーターで5%のCO₂で培養します。
   注意:培養を継続的に監視してください。細胞は通常、組織断片から放射状に移動し、3〜7日以内に皿に付着します。組織の生存率が低い、または5日間以内に細胞移動が見られない場合は、20%血清を補足した完全のα-MEMに切り替えます。
8. 細胞通過では、細胞が80〜90%の合流度に達した時点で、残留培地を除去するために5 mLのPBSで洗浄しました。その後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAを2mL、37°Cで2分間インキュベートしました(材料 表参照)。
   注意:トリプシン–EDTAは刺激物質であり、皮膚や目を損傷する可能性があります。手袋とアイプロテクトを着用し、水しぶきやエアロゾルの発生を防ぎ、接触があった場合はすぐに十分な水で洗い流してください。トリプシンを含む液体廃棄物は、機関のガイドラインに従って処分してください。
9. 顕微鏡で細胞が丸くなり細胞間接合部が乱れた場合は、過度な構造損傷なしに優しく細胞を皿から切り離してください。完全なα-MEMを4mL添加してトリプシンを中和します。
10. 細胞を新しい15mL遠心分離機チューブに優しく繰り返しピペットで移して採取します。100 × g で5分間遠心分離した後、上清液を廃棄し、細胞ペレットを完全なα-MEMで再懸濁します。再懸濁した細胞を新鮮な培養皿やウェルプレートに種まきします。メディアンは2日に1回交換してください。
    注意:集合培養に使用されるSCAPは、passage 5以内に収められていることを確認してください。通過数^30,31の増加により茎と集積能力は低下し、総地層効率や機能性能が低下する可能性があります。

2. SCAPアグリゲートの自己組織化

1. 収穫経過3–5 SCAPsをトリプシン化処理、100 × g で遠心分離機で5分間処理し、再懸浮α-MEMに10%EV枯渇胎児用牛血清(FBS)および1%のP/Sを補給します(材料 表参照)。
   注意:EVが枯渇したFBSは、150,000 × g 、4°Cで一晩遠心分離してEVやその他の不^純物を除去します。
2. ヘモサイトメーターを用いて細胞数を数え、超低付着型24ウェルプレートで1ウェルあたり10個×⁵ 個の細胞をシードします。懸濁状態を維持するために、中容量を1井戸あたり500μLに調整してください。
3. プレートを37°Cで5%のCO₂で72時間培養し、培地は48時間ごとに交換します。
4. 倒立光学顕微鏡の下で骨材の形成を毎日監視してください。骨材が直径200〜400μmに達し、コンパクトで滑らかな縁取りを持つEVを収集します。
   注:1つの生産「バッチ」とは、同じ細胞通路から同日にシードされたSCAP骨材から採取し、同じ培養条件下で単一の収集ウィンドウ(72時間)内に維持されたプール調整培地から分離されたLEVと定義します。各バッチは遠心分離で独立して処理します。種まきから48時間後に培地を交換し、同じ量の新鮮培地を補充します。LEV生産では、播種後48時間と72時間後に調整された培地を採取し、収穫された培地(0–48時間および48–72時間分率)を一括でまとめます。プールされた調整培地を4°Cに保ち、LEVの分離処理を行います。

3. SCAPアグリゲートからのEVの分離と特性評価

1. 大型LEVの分離のための差動遠心分離
   1. SCAP集合体を含む培地を15 mL遠心分離機チューブに集めます。
   2. 800 × g で4°Cで10分間遠心分離機で、未保存の集合体や大きな細胞の残骸を除去します。
   3. 上清液を新しい15 mLチューブに移し、2,500 × g で4°Cで15分間遠心分離して残留血小板や小細胞片を除去します。
   4. 上清液を無菌の1.5mL円錐管に慎重に移し、16,800 × g で4°Cで30分間遠心分離機でLEVペレットを形成します。
      注意:LEVの収率を高めるには1.5 mLの円錐管を使用してください。
   5. 上清液を捨て、ペレットを1 mLの無菌PBSに再懸浮させ、固定角度ローター(標準的なベンチトップ遠心分離機対応)を用いて16,800 × g で4°Cで30分間遠心分離し、LEVをペレットします。
   6. 減速/ブレーキを「遅い」または「低速」設定(通常はブレーキレベル1または2)に設定し、最終減速段階でのLEVペレットの再懸吊を防ぎます。
   7. 上清液を廃棄し、最終的なLEVペレットを50μLの滅菌PBSに再懸濁します。サスペンションはすぐに(24時間以内)使用するか、4°Cで保管してください。 バイオアクティブの損失を最小限に抑えるために冷凍は避けてください。
      注:典型的な下流実験に十分なLEVを得るために、約80井戸の骨材を準備してください。LEVsサンプルは長期保存よりも即時の特性評価や治療用途に推奨されます。より長い保管が必要な場合は、LEV懸濁部(例:1管あたり5〜10μL)を分割して、温度の繰り返し変動や凍結・融解サイクルを避けます。ドライアイスにスナップフリーズアリクオートを作って、−80°Cで短期の長期保存(例:最大1〜3ヶ月)に保管します。氷で一度解凍してすぐに使ってください。凍結は生物活性を低下させ、粒子の回復やサイズ分布に影響を与える可能性があることに注意してください。したがって、可能な限り新たに準備されたLEVを用いた機能研究を行うこと。保管後の品質管理のために、NTAを用いて粒子濃度とサイズ分布を再測定し、値があらかじめ定められた受け入れ範囲内に収まる場合にのみ測定を進めてください。 さらに、このプロトコルでは、BCAのようなタンパク質ベースのアッセイに伴う小胞の損失を避けるため、NTA粒子濃度を主要な定量方法として用い、下流の応用で収量を最大化します。
2. 粒子サイズと濃度のNTA(非正当性)
   注:NTAは市販のナノ粒子追跡解析装置(材料 表参照)を用いて、サイズ分布と粒子濃度の評価を行います。
   1. LEVの懸濁液1μL(セクション3.1、ステップ6より)を1,499μLの無菌PBSに希釈し、無菌1.5mL円錐形チューブ内で十分に混合します。
   2. 対応ソフトを起動し、サンプルセルに超純水10mLを満たします。システムがクリーンであることを保証するために、背景粒子数が1フレームあたり<10であることを確認しましょう(材料 表を参照)。
   3. 準備済みの標準溶液で機器を校正してください。ソフトウェアのパラメータを感度70、シャッター70、最小面積5、最小明るさ20に設定してください。レーザーが焦点を合わせていることを確認するために「オートアライメント」を実行してください。標準希釈をソフトウェアで表示される粒子数が50〜400(できれば~200)になるまで調整し、その後キャリブレーションプログラムを実行します。
      注意:標準溶液は、1 mLの蒸留水に1 μLの校正ビーズを再構成して一次溶液を作ってください。一次溶液100μLを蒸留水25mL(1:250,000希釈)に希釈し、4°Cで最大1週間保存します。
   4. 分析前にサンプルセルを蒸留水5mLで洗い流します。
   5. チャネルを蒸留水1mLで洗浄し、検出界面の粒子数が<10であることを確認します。
   6. 希釈したLEVsサンプル1 mLを、滅菌1 mLシリンジで0.5 mL/sの一定速度で注入します。
      注意:注射速度を安定させるために手動でシリンジを操作してください。
   7. 粒子分析を行い、レポートを作成しましょう。ソフトウェアで新しい測定値を作成し、「サイズ/濃度モード」を選択します。取得を3回、1回の録画に60秒、25°Cでステップ3と同じ検出パラメータ(感度70、シャッター70、最小面積5、最小明るさ20)で設定します。
   8. 取得を開始し、画面上のパーティクルカウントがフレームあたり50〜400パーティクル(できれば~200)以内に収まっているか確認します。この範囲外の場合は停止し、試料希釈を調整し、ステップ6を繰り返します。取得後、平均サイズ、モードサイズ、D10/D50/D90、および粒子濃度(粒子/mL)を解析します。その後、結果とサイズ分布プロットを.csvおよび.pdf(または同等のレポート形式)としてエクスポートし、測定ファイルを記録用に保存します。

4. 下顎骨再生におけるLEVの治療的応用

1. LEV負荷ハイドロゲルの調製
   1. プルロニックF-127ストック(20%のw/v)を準備します。プルロニックF-127粉末を滅菌PBSに20%(w/v)の最終濃度に加え、4°Cで一晩かき混ぜて完全に溶け均一になるまでします(材料 表参照)。早期ゲル化を防ぐため、調製中は溶液を4°Cに保ちます。
      注:プルロニックF-127は20%(w/v)で4°Cで液体で、~20〜25°Cで熱ゲル化を起こします(チューブ/部屋依存)。37°Cで安定したゲルになります。
   2. 寒冷条件下でLEVを積み込む。チューブ、ピペットチップ、ハイドロゲルを4°Cまで予冷します。 50μgのLEV(24ウェルの骨材板からのLEVに相当)と1mLの20%プルロニックF127を、優しくピペッティングし、短時間の低速渦流で均一分布を確保します。混合物は氷の上または4°Cで着床まで保ちます。
   3. 取り扱いや使用の指導(再現性のため)。氷上で素早くローディングとシリンジ/チップローディングを行います。混合物が~20〜25°C以上に温まると粘度が上がり、ゲル化が始まることがあります。その場合は、材料が完全に流動可能になるまで4°Cに戻してから使用してください。欠損部に埋め込んだ後、体温(37°C)でその場でゲル化を行います。
2. マウス下顎骨欠損モデルの確立
   1. 8週間齢のC57Bl/6マウス(オスまたはメス)をペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg)腹腔内注射で麻酔します(材料 表参照)。
      注意:ペントバルビタールナトリウムは強力な鎮静剤・麻酔剤であり、誤って注射、摂取、または吸入すると人体に毒性があります。安全な鋭利器の方法(針をリキャップせず、すぐに鋭利器容器に捨てる)を用いて準備・投与し、手袋と目の保護具を着用し、皮膚接触を避け、施設の規制薬物方針に従って使用を保管・記録してください。マウスの適切な麻酔を確認し、角膜反射がないか、足パッドをつまんでも四肢が引き込めないか確認してください。角膜乾燥を防ぐために保護用の眼軟膏を塗布してください。
   2. 左下顎の毛を剃り、10%のポビドンヨウ素と75%のエタノールで交互に消毒します。
      注意:75%のエタノールは非常に可燃性が高いです。点火源から離して使用し、良好な換気を確保してください。ポビドンヨウ素は皮膚や目の刺激やアレルギー反応を引き起こすことがあります。手袋を着用し、目や粘膜との接触を避け、こぼれたものは速やかに掃除してください。
   3. 下顎の縁に沿って縦に1cmの切開を入れ、軟部組織を鈍く切り離して下顎角を露出させます。
   4. 熱損傷を防ぐために、連続的な生理食塩水灌流を伴う歯科用ドリルを用いて直径2mmの円形骨欠損を形成します(材料 表参照)。
      注意:術中出血を注意深く観察し、小さな綿球で出血をコントロールして手術視野をクリアに保ち、感染リスクを減らしてください。ドリルで周囲の軟部組織に触れないように、絡まりを防ぎましょう。
3. LEV負荷ハイドロゲルの埋め込み
   1. LEVハイドロゲル混合物を滅菌注射器に注入し、骨欠損部に注入して完全に充填します。
      注意:マウス1匹あたり~10μgのLEVを投与してください。n=5マウスの実験に十分なLEVを得るには、24ウェルのSCAP骨材プレート2枚が必要です。
   2. 対照群では、LEVを含まず同量のプルロニックF-127ハイドロゲルを注入します。
   3. 切開部は4-0吸収性縫合糸で縫合し、皮下鎮痛剤(カルプロフェン、5 mg/kg)を投与して術後の痛みを和らげます(材料 表参照)。
      注意:カルプロフェンは薬理活性のあるNSAIDであり、誤って注射されたり皮膚や目に触れた場合は有害になる可能性があります。手袋を着用し、鋭利な損傷を避け、針や注射器は鋭利な容器に捨て、未使用の薬物や汚染物質は施設の医薬品廃棄物手順に従って処分してください。
   4. 麻酔から回復するまで、マウスを温める毛布の上に置き、その後、餌や水が自由にアクセスできる個別のケージに移します。
      注意:マウスが胸骨横たわりを維持できるほど意識を取り戻すまでは、マウスを放置しないでください。マウスは完全に回復した後にのみグループケージに戻してください。

結果

実験ワークフローによると、SCAP分離、骨材形成、LEV抽出、治療的埋め込みなどの重要な工程が成功裏に実行されました(図1)。ドナーからの臨床的埋伏された第3大臼歯では、未熟な先端が見られ、開口根管の周囲に完全な頂端乳頭組織が付着しており、SCAPの適切な供給源が確認されました(図2A)。 vitro培養時、豊富な細胞突起を持つ紡錘形のSCAPが頂端乳頭組織から移動し、3日以内に徐々に合流し、特徴的な渦状の配列を形成しました(図2B)。フローサイトメトリーによりCD90陽性およびCD45陰性のSCAP表現型が確認されました(図3A)。自己更新能力はCFUの設立とEdUの法人化によって支えられました(図3B)。アリザリンレッドSおよびオイルレッドO染色によって...

ディスカッション

細胞フリー再生療法への関心の高まりにより、間葉系幹細胞由来のLEVは、細胞ベースのアプローチに伴うリスクなく生体活性分子を送達できるため、全細胞移植の有望な代替手段として位置づけられています。しかし、LEVベースの治療法の臨床応用は、LEVの機能を完全に維持・強化できる生理学的に関連性の高い培養システムが不足しているため、妨げられています。従来の2D単層培養は、生体内で間葉質幹細胞の機能を支えるネイティブの微小環境から大きく異なり、再生能力が限定的なLEVとなります^18,24。この制約に対処するため、自己組立した3D SCAPアグリゲートに基づくプロトコルを開発し、LEVの収率を向上させるだけでなく、臨床文脈での機能的関連性も向上させる標準化されスケーラブルなワークフローを構築しました。

本研究は、SCAPの低接着凝集を通じて幹細胞ニッチの主要な生理的特性を再現する効率的な足場フリ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
針付き1mL注射器	BD	300841	麻酔
10cm細胞培養皿	コーニング	353003	細胞培養
15 mL ポリスチレン遠心分離機管	コーニング	352095	細胞培養
75%エタノール消毒剤	海詩海怒	HS-750	動作
吸収性縫合 4-0	金環医療	R413	動作
ベンチトップ遠心分離機	ウィッゲンズ	CE187	EVのアイソレーション
CO2インキュベーター、150リットル、ユニバーサルタイプ	サーモフィッシャー	51032874	細胞培養
コラーゲナーゼタイプI	サーモフィッシャー	17100017	細胞培養
綿球	デロイヤル	30-033	動作
曲面作動ハサミ	JZ外科用器具	J21040	動作
歯科用移動式タービンユニット	カヴォ	S609C	動作
電子天秤	志可	ZK-DST	細胞培養
エッペンドルフ管	エッペンドルフ	3810X	EVのアイソレーション
鉗子、大丈夫	JZ外科用器具	JD1020	動作
脱毛クリーム	ヴェート	1.00097E+11	動作
高速ボールバー	デンツプリ・シロナ	E0123	動作
高速ハンドピース	カヴォ	KV-1-008-1644	動作
倒立顕微鏡	Mshot	MF53-N	細胞培養
MEMとα;(最低限の必須ミディウム&アルファ)	サーモフィッシャー	12561056	細胞培養
ナノ粒子追跡ビデオ顕微鏡 PMX-120	粒子メトリクス	ゼータビュー PMX120	ナノ粒子追跡解析
ペニシリン・ストレプトマイシン(P/S)	サーモフィッシャー	15140122	細胞培養
ペントバルビタールナトリウム	シグマ・オルドリッチ	57-33-0	麻酔
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャー	10010023	細胞培養
プルロニックF-127	シグマ・オルドリッチ	P2443	EVインプラント
ポビドンヨウ素溶液	バクスター	PROSL500	動作
特殊胎児用牛血清(FBS)	サーモフィッシャー	12664025	細胞培養
滅菌ガーゼブロック	勝利	10-000-681	動作
卓上高速マイクロ遠心分離機	日立	CT15E	EVのアイソレーション
トレフィンドリル	バイオメットマイクロフィクセーション	01-9182	動作
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャー	25200072	細胞培養
超低圧アタッチメント24ウェルプレート	コーニング	3473	細胞培養
ボルテックスミキサー・ジーニー	科学産業	SI0425	EVインプラント