方法論記事

UHPLC-Q-Orbitrap HRMSをネットワーク薬理学と統合したIgA腎症に対する一気清戒処方の物質的根拠の解明

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DOI:

10.3791/70541

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2026年5月19日

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1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

この記事について

サマリー

本プロトコルは、超高性能液体クロマトグラフィーとハイブリッド四重極-オービトラップ高分解能質量分析法(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)を組み合わせ、ネットワーク薬理学および分子ドッキングを組み合わせて、IgA腎症(IgAN)治療のための一気清戒式(YQQJ)の物質的基盤を予測・検証することを目的としています。

要約

本研究では、UHPLC-Q-Orbitrap HRMSを用いて、YQQJの水分抽出可能および血液吸収成分を特徴付けます。ネットワーク薬理学と分子ドッキングをさらに応用し、YQQJがIgANに対する治療効果の基礎を予測・検証するためにも活用されています。YQQJの水抽出物および血清サンプルはUHPLC-Q-Orbitrap HRMSを用いて化学成分の特性評価と血液吸収化合物の同定を行いました。化合物同定は、参考データベース、公開文献、保持時間、前駆体イオン質量の精度、MS/MS断片パターン、同位体分布の包括的な評価に基づいて実施されました。試作血液吸収化合物の潜在的な標的は標的予測データベースを用いて予測され、IgAN関連標的は統合バイオインフォマティクスプラットフォームから収集されました。コアターゲットはPPIネットワーク解析でスクリーニングされました。「化合物–標的–経路–疾患」ネットワークを構築し、コア化合物と標的間の相互作用を評価するために分子ドッキングが行われました。YQQJの水抽出物から合計185の化合物が同定されました。そのうち28種類の化合物が試作型で血流に入りました。PPIはIgANにおけるYQQJの治療効果に関連する42のコアターゲットを特定しました。KEGGおよびGOの濃縮解析では、細胞増殖、炎症、アポトーシス、およびPI3K-Akt、MAPK、JAK-STATなどの主要経路における濃縮が関与していることが示されました。分子ドッキング解析により、6つの重要標的(CASP3、IGF1R、JUN、STAT3、PRKCB、PIK3CA)と、デアセチルスペルロシド酸、ゲニポジジン酸、ディオシンという3つの主要な血液吸収化合物との間で、結合エネルギーが一貫して低い良好な結合相互作用が予測され、潜在的な相互作用が示唆されました。この統合解析により、YQQJは複数の成分と標的を通じてIgANに対して治療効果を発揮することが明らかになりました。デアセチルスペルロシド酸、ジェニポシジック酸、ジオシンがこれらの効果に寄与する主要な有効成分として示唆されています。

概要

IgA腎症(IgAN)は、世界的に最も多い原発性球体腎炎の一つです。臨床症状は非常に多様で、通常は顕微鏡的または粗い血尿として現れ、しばしば異なる程度のタンパク尿、高血圧、腎障害を伴います。以前の研究では、診断から20年以内に最大40%の患者が腎不全に進行すると示唆されていました。しかし、より新しい証拠では予後が著しく悪く、ほとんどの患者が10〜15年以内に腎不全を発症し、進行せずに生涯腎機能を維持できる割合はごくわずかです。標的治療は最近IgAN管理において臨床的進歩を遂げていますが、その高コストと効果の発現が比較的遅いことは依然として大きな課題であり、臨床的利益とリスクのバランスは依然として議論の的となっています。

伝統中国医学(TCM)は複雑な病気の治療において独自の利点を示しています。この療法は安定した治療効果、比較的低い副作用発生率、および多標的相乗効果を特徴としています7。単一標的薬理学的薬剤とは異なり、TCMの処方には複数の生物活性成分が通常含まれており、多様な生物学的経路を同時に調節できます。この多成分・多標的作用機序は、IgAN8のような複雑な疾患の治療において潜在的な治療的優位性をもたらします。TCM理論では、IgANには特定の疾患名はなく、一般的に「血尿」「浮腫」「腰痛」「腎病」「消耗性疾患」に分類されます。多くの学者は、その主な病因を肺脾気の欠乏に関係し、防御性気の制御を失い、風や湿気、熱、毒素の侵入を引き起こし、最終的に腎臓を損傷すると考えている。腎臓が主な臓器ですが、心臓、肝臓、脾臓、肺も影響を受けることがあります。この知見に基づき、多くの研究が気の補強、外部定着、熱浄化、解毒、湿気解消特性を持つIgAN10,11の臨床治療に向けた漢方薬や処方の特定に注目しています。

宜気清治処方(YQQJ)は、当院腎臓科でIgAN治療に用いられている効果的な実証処方薬です。この処方は7種類のハーブで構成されており、黄耆(Astragalus membranaceus)、ジンイン華(Jinyinhua)のLonicera japonica Thunb.、Rheum palmmatum L.(大黄)、Hedyotis diffusa Willd.(白華謝草)、Dioscorea nipponica Makino(川山龍)、Spatholobus suberectus Dunn(ジシュエテン)、Plantago asiatica L.が含まれます。(切キアンソー)YQQJは気の強化、外側の凝固、熱の浄化、解毒、血行活性化、利尿促進といった治療的機能を果たします。臨床研究により、YQQJはIgAN患者のタンパク尿および血尿を有意に減少させ、腎機能を改善し、粘膜免疫関連症状を緩和し、良好な安全性プロファイルを示すことが示されています12,13。

この処方は臨床的に良好な効果を示しているものの、TCMの処方には多くの化学成分が含まれているため、薬理活性物質の基礎は依然として解明が困難である。クロマトグラフィーや質量分析のみに基づく化学プロファイリングは、化学式の全体的な化学組成を明らかにできます。しかし、どの化合物が全身循環に吸収され、治療効果に直接寄与するかを特定することはできません14。さらに、従来のネットワーク薬理学研究は主にデータベースベースの予測に依存し、通常は経口バイオアラビシビリティや薬剤類似性などのパラメータを用いて候補化合物をスクリーニングします。このアプローチは、実際に生体内で薬理学的活性を発揮する化合物を見落とすことがあります。

これらの限界に対処するため、近年の研究では、超高性能液体クロマトグラフィーとハイブリッド四重極-オービトラップ高分解能質量分析法(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)、血清薬理化学およびシステム薬理学を組み合わせた統合分析戦略がTCM研究で採用される傾向が増えています。16,17。血清薬理化学は投与後に全身循環に入る化合物を特定し、潜在的な生物活性成分のスクリーニングに薬物動態的に関連した証拠を提供します18。一方、UHPLC-Q-Orbitrap HRMSは複雑なハーブ行列中の化学成分の高精度な検出と構造的特徴付けを可能にします。

化学的プロファイリングや理論的標的予測のみに依存する手法と比較して、本研究で適用された統合ワークフローは、UHPLC-Q-Orbitrap HRMSベースの成分同定、血清薬理化学スクリーニング、ネットワーク薬理学解析、分子ドッキング検証を含む複数の方法論的利点を提供します。UHPLC-Q-Orbitrap HRMSは複雑な化学成分の包括的かつ正確な同定を可能にします。血清薬理化学は候補化合物を実際に全身循環に吸収されるものに限定し、その後のネットワーク解析における生物学的妥当性を高めます。実験的に確認された吸収化合物に基づくネットワーク薬理学解析は、多標的メカニズムのシステムレベルの探求を可能にし、TCM処方の全体的な薬理学的特性をよりよく反映します。分子ドッキングはさらに、予測された化合物–標的相互作用の予備的な計算検証を提供し、候補分子の合理的な優先順位付けを後続の実験検証に支援します。この統合的なワークフローは、YQQJのような複雑なハーブ処方の物質的基盤とメカニズムを解明するための信頼性が高く効率的かつ生理学的に関連性の高い戦略を提供します。

このワークフローは、動物や人間の薬理動態研究から体内吸収データを得られる複雑なハーブ処方の薬理活性物質の基盤やメカニズムの調査に特に適しています。特に臨床的有効性が確立されているものの有効成分が不明な処方に適用されます。しかしながら、いくつかの制限点も認識すべきです。まず、ターゲット予測の精度は公開データベースの質と完全性に依存します。次に、ワークフローは循環中に検出された試作化合物に焦点を当てており、生体内で生成されるバイオアクティブ代謝物を考慮していません。第三に、ネットワーク薬理学解析から導き出された予測はさらなる実験的検証が必要です。これらの制約にもかかわらず、このワークフローはTCM公式の機構的研究において、仮説生成とターゲット優先付けにおいて効率的かつ信頼性の高いアプローチを提供します。

したがって、本研究はUHPLC-Q-Orbitrap HRMSを用いてYQQJの水抽出成分および循環化合物を体系的に特徴付け、潜在的な有効成分の比較的包括的なデータベースを構築します。このデータセットに基づき、ネットワーク薬理学解析と分子ドッキング検証を組み合わせることで、IgAN治療におけるYQQJの潜在的な薬理活性成分を予測し、その後のメカニズム研究の基盤を提供します。

プロトコル

動物を対象としたすべての実験手順は、中国動物福祉委員会が発行した実験動物のケアおよび利用に関するガイドラインに準拠しています。本研究のすべての手技は、広安門病院動物実験センターの施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 動物および医薬品管理

  1. 6週齢のスプラグ–ドーリー(SD)オスラット12頭(体重200〜230g)を使用します。
  2. すべての動物は実験動物センターに収容されています。
    注意:飼育温度は20〜26°C、相対湿度は40〜70%に保ってください。12時間/12時間の明暗サイクルを使って、自然な概日リズムを再現しましょう。
  3. 実験前に、動物を標準的な条件下で7日間、自由に餌と水に慣らしてください。ラットをランダムに2つのグループ(各グループに n = 6 個)に分けます:対照群と薬物治療群です。
  4. 人間と動物の体表面積で換算した等価線量を参照20。YQQJ濃縮抽出物を経口ガベージで24.68 mL/(kg・day)投与しました。対照群に同量の蒸留水を同時に投与し、同期処理を確保します。
  5. 投与を1日間続けてください。1日の総投与量を3回に分けて(例:08:00、13:00、18:00に分けて)、1日以内に全量投与を確実にします。
    注意:最終ガヴェージの12時間前は速食動物を飼い、水は自由に利用してください。
  6. 最終投与後2時間と8時間後に血液サンプルを採取してください。ラットには1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg)を腹腔内注射して麻酔します。腹部大動脈から血液を採取してください。
  7. 血液サンプルを室温で1時間放置し、その後450× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄液(血清)が透明で溶血がないか確認してください。上澄液を移し、さらに分析のために–80°Cで保存します。

2. 解の準備

  1. テスト解の準備
    1. YQQJの粗草はすべて処方に従って採取してください。煮込み鍋に浄化水4巻を加え、20分間浸します。
      注: 浄化水は4:1(v/w)の比率でハーブに加えられました。
    2. 混合物を沸騰させ、弱火で30分間煮込み続けます。ガーゼを通してろ過し、ろ過液を回収します。残留物の煎じを4巻の水でさらに30分間繰り返し、再度ろ過します。
    3. 2つのろ過液を組み合わせます。混合溶液を60°Cの水浴温度で3g/mL(w/v、粗製医薬品に相当)まで濃縮します。
    4. 濃縮された抽出物が暗く粘性のある液体で、目に見える沈殿がないことを確認してください。後で使用するために4°Cで保存してください。
  2. 参照解の調製
    1. 以下の参照化合物を正確に計量してください:デアセチルラスペルロシド酸、ゲニポジジン酸、ロガン酸、モロニシド、クロロゲン酸、スワロサイド、プランタゴグアニジニン酸、ライン-8-O-β-D-グルコピラノシド、ジェニスチン、アピゲニン-7-グルコシド、ディオスメチン-7-O-β-D-グルコピラノシド、カリコシン、プロトディオシン、ジェニシュタイン、ジオスメチン、偽プロトロトジオシン、フォルモノネチン、3-ヒドロキシ-9,10-ジメトキシプテルカルパン、アロイモジン、ライン、ディオシン。
    2. 各化合物をメタノールに溶かし、混合物を1分間ボルテックスし、その後室温で10分間超音波処理して完全に溶解させます。
    3. 各溶液をメタノールで希釈し、各標準物質の最終濃度10 μg/mLにします。

3. サンプルの準備

  1. YQQJエキスサンプルの調製
    1. YQQJ水抽出物100 μLを1.5 mLの遠心分離機チューブにピペットで移します。メタノール300μLを加え、1分間渦を巻きます。遠心分離機で1800× g、4°Cで10分間。得られる上清液が透明で、浮遊粒子がないことを確認しましょう。
    2. 上清液100μLを取り、100μLの超純水と混ぜて1:1の希釈にします。優しく渦巻き、オートサンプラーのバイアルに移して分析します。
  2. 薬物含有血清サンプルの調製
    1. 1.5mLの遠心分離チューブに100μLの血清をピペットで注ぎます。メタノール300μLを加え、タンパク質沈殿を確保するために10分間渦巻きます。遠心分離機で1800× g、4°Cで10分間。
    2. 上清液270μLを採取し、清潔なチューブに移します。真空遠心濃縮機を120 × g、37°Cで4時間蒸発し、固体残留物が見えるまで乾燥させます。
    3. 残留物を50%メタノール水溶液90μLで再構成します。残渣を完全に溶かすために1分間渦を流し、その後1800 × g、4°Cで10分間遠心分離機をかけます。
    4. 最終的な透明上清液80μLを採取し、オートサンプラーバイアルに移して分析します。

4. 解析条件

  1. クロマトグラフィー条件
    1. クロマトグラフィー分離は、クロマトグラフィーカラムを備えたUHPLCシステムを用いて行われます。
    2. 二元移動相(相A:0.1%の蟻酸を含む水;フェーズB:アセトニトリル)。表 1に示された勾配洗脱プログラムを、流量0.3 mL/minで適用します。カラム温度を40°C、注入量を6.0μLに設定します。
      注: カラム仕様は2.1 mm×100 mm、1.8 μmの粒子寸法です。
  2. MS条件
    1. 加熱電解イオン化(HESI)スプレープローブを搭載した四重極軌道トラップ質量分析計を用いて試料を解析します。
    2. パラメータを設定します:イオン化電圧:3.7 kV(正モード)/3.5 kV(負モード);毛細血管温度:320°C;シースガス圧力:30 psi;補助ガス圧:10 psi;溶かし温度:300°C;シースガスと補助ガス:窒素;衝突ガス:窒素、1.5 mTorr。
    3. フルスキャン/dd-MS2 モードでデータを取得。フルスキャンパラメータを以下のように設定してください:解像度70000、オートゲイン制御ターゲット1×106、最大アイソレーション時間50ms、m/zスキャン範囲100 – 1500。
    4. dd-MS2データを、分解能17500、オートゲイン制御ターゲット1×105、最大分離時間50 ms、断片化の最も強い親イオンの上限n(n≤)を選択し、動的排除機構と組み合わせ、分離ウィンドウはm/z 2、衝突エネルギーは10 V、30 V、60 V、強度閾値1×105のパラメータで収集します。

5. MSデータの処理

  1. 取得したMSデータを専門のデータ処理ソフトウェアで処理します。インポートデータモジュールに移動し、生データファイルをアップロードしてください。
  2. ピークピッキングモジュールを実行し、ピークデコンボリューションを行い、加加イオンをグループ化し、複合特徴を生成する。
  3. 候補化合物の同定のために参考化合物データベース、ターゲット予測データベース、関連する公開文献を検索してください。
  4. 高解像度MSデータに基づく2つの補完的な同定戦略を用いて化合物を同定します。
    1. 参照基準の照合に基づく識別。本物の基準と比較して化合物を確認しましょう。以下の条件すべてを満たした場合にのみ識別を受け入れてください:
      1. 質量精度:前駆体イオンと断片イオンの質量誤差は±5 ppm以内に収まらなければなりません。
      2. スペクトル類似度:実験用MS/MSスペクトルと参照標準のMS/MSスペクトル間の余弦類似度スコアは≥0.85でなければなりません。
      3. 同位体分布:同位体パターンマッチングスコアは90%≥なければなりません。
      4. クロマトグラフィー挙動:検出された化合物と基準標準物質間の保持時間の偏差は0.2分<なければなりません。
        注: 上記のすべての基準を満たす化合物はMSIレベル1として注釈が付けられ、構造同定が確認されたことを示します。
    2. 高解像度MSデータおよびインシリコスペクトル予測に基づく識別。参照標準が存在しない化合物については、正確な質量測定と計算スペクトル予測に基づいて仮定同定を行います。以下の条件が満たされている場合にのみ注釈を受け入れてください:
      1. 質量精度:前駆体イオンの質量誤差は±5ppm以内、断片イオンの質量誤差は±10ppm以内になければなりません。
      2. スペクトル類似性:実験的なMS/MSスペクトルと、Progenesis QIアルゴリズムを用いて複合SMILES構造から生成された理論的なMS/MSスペクトルを比較します。コサイン類似度スコア0.60≥マッチを受け入れます。
      3. 同位体分布:同位体パターンマッチングスコアは90%≥なければなりません。
      4. クロマトグラフィー挙動予測:実験保持時間と機械学習で予測される保持時間の偏差は<1.0分でなければなりません。
        注: 保持時間予測モデルは、同じクロマトグラフィー条件下で分析された2000以上の参照化合物からの実験的クロマトグラフィーデータを用いて訓練されました。これらの基準を満たす化合物はMSIレベル2として注釈が付けられ、高い構造的確信度を持つ推定同定化合物を表します。

6. ネットワーク薬理学

  1. 血液吸収成分およびIgAN関連標的の同定
    1. YQQJの同定された試作血液吸収成分をターゲット予測データベースにインポートします。「ホモ・サピエンス」を対象種として選択し、その潜在的な対象を入手してください。これらをYQQJの血液吸収化合物の標的セットとして記録してください。
    2. 「IgA腎症」というキーワードを使って、統合バイオインフォマティクスプラットフォームからIgAN関連疾患標的を取得してください。複数の情報源からの結果をまとめてバイアスを最小限に抑えましょう。
      注意:一貫性を保つために、回収したすべての標的をGene Symbol形式に変換するためにタンパク質データベースを使用してください。
  2. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの構築とコアターゲットの同定
    1. YQQJ血液吸収化合物の標的セットとIgAN疾患標的セットを統合し、それらの交差点を抽出します。
    2. 交差するターゲットをPPIプラットフォーム21にアップロードしてください。設定を設定してください:生物を ホモ・サピエンスに設定し、信頼度スコアを0.90にし、すべての切断ノードを破棄します。
    3. PPIデータを可視化ソフトウェアにインポートします。トポロジカル解析プラグインを起動します。次数中心性(DC)23、中間中心性(BC)24、近接中心性(CC)25を計算します。
    4. トポロジカルパラメータ値(DC、BC、CC)が中央値を超えるノードをフィルタリングすることで、YQQJの中核治療標的をIgANに対してスクリーニングします。
  3. 「YQQJ–血液吸収成分–標的–経路–疾患」統合ネットワークの構築と解析
    1. node属性ファイルを準備します:2列のスプレッドシートを作成します。最初の列に ノード名 、2列目に ノードタイプをラベル付けします。各ノードに5つのカテゴリ(フォーミュラ、血液吸収成分、交差ターゲット、経路、または疾患)のいずれかを割り当てます。
    2. ネットワークインタラクション(エッジ)ファイルを準備する:ノード間の接続を定義するスプレッドシートを作成します(例:血液吸収成分と交差ターゲット)。マッピングエラーを避けるために、すべてのノード名がノード属性ファイルのものと一致していることを確認してください。
    3. ネットワークのインポートと構築:ネットワーク可視化ソフトウェアを起動します。Edge ファイルを読み込むために > > ネットワークのインポート に移動してください。プレビューウィンドウで、列を ソースノード と ターゲットノード にマッピングし、 OK をクリックして初期グラフを生成します。
    4. ノード属性とビジュアルスタイルのセット:ノード属性ファイルをファイルからインポート > テーブル>インポートします。 スタイル パネルを開き、 ノードタイプの 列をノードの形状、塗りつぶし色、サイズなどの特定のビジュアルプロパティにマッピングします。
    5. 位相分析を実行する: Tools > Analyze Networkにアクセスして位相計算を行います。度数に基づいてコア有効化合物や主要な治療対象をフィルタリングし、特定します。
      注意:コアノード識別の一貫性を確保するために、ステップ6.2で説明されたトポロジカルパラメータを使用してください。
    6. ネットワーク画像をエクスポートする:ネットワークレイアウトを最終決定します。最適化された可視化を保存するには、 ファイル>「ネットワーク>画像にエクスポート 」へ移動してください。
  4. GO濃縮およびKEGG経路解析
    1. 遺伝子リストを送信してください:ウェブベースの関数注釈プラットフォームを開きます。 ステップ1:遺伝子リストの提出 エリアに移動し、以前にフィルタリングされたコアターゲット遺伝子リスト26をアップロードしてください。
    2. 種を選択する: ステップ2:種としての入力 および ステップ3:種としての分析のドロップダウンメニューで、正しい生物学的文脈で分析を行うためにH . sapiens. (人間)を選択してください。
    3. カスタム解析の設定:カスタム解析モードを選択してください。エンリッチメントカテゴリでは、以下のデータベースを確認してください:Gene Ontology(GO)分子機能(MF)、GO生物学的プロセス(BP)、GO細胞コンポーネント(CC)、および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路。
    4. 有意度の閾値を設定する:P値のカットオフを< 0.01、最小濃縮を≥ 1.5、最小重なりを≥ 3に設定します。その他のパラメータはデフォルト設定のまま維持してください。
    5. 解析を実行する: エンリッチメント分析 ボタンをクリックしてタスクを送信し、計算完了を待ちます。
    6. 結果の取得とエクスポート:生成された分析レポートページにアクセスしてください。ダウンロードボタンをクリックすると、詳細なエンリッチメントデータと対応する棒グラフ、ヒートマップをスプレッドシート形式でエクスポートできます。

7. 分子ドッキング検証

  1. 構造生物学データベースから、コアターゲットの高解像度(< 2.50 Å)3Dタンパク質構造およびコア血液吸収成分の2D化学構造をダウンロードしてください。
  2. 分子ドッキングソフトを起動し、ダウンロードした構造をインポートします。
  3. 以下の前処理ステップを順に実行します:編集>水を除去して水分子を除去する;非標準残基を破棄するには 編集>ヘテロアトム 除去を選択します。
  4. 極性水素原子を追加するには、 > Hydrogen Edit > > Polar Only を追加します。処理済みの構造体をファイル >保存>書き込みPDBQTからPDBQT形式で保存します。
  5. Grid > Grid Boxツールを使ってドッキングサイトを定義します。グリッドボックスの寸法は適応的に調整され(20〜100 Å)、予測された結合領域の完全なカバーを確保しました。
  6. ドッキングパラメータの初期化: マクロモレキュール>ドッキング でレセプターを選択し、リジッドファイル名を設定し>ドッキング >リガンド>開いてください。ドッキングパラメータは以下の通りに設定されました:消極性=32、エネルギー範囲=3kcal/mol、最大10の結合モードが保持されました。共結晶リガンドを持つタンパク質では、ドッキンググリッドボックスがリガンド中心部を中心に8.0 Åの拡張を施し、共結晶化リガンドを持たないタンパク質では、約90%のカバレッジでDoGSiteScorerを用いて結合ポケットを予測しました。
  7. 検索戦略としてラマルク遺伝的アルゴリズム(LGA)を選択してください。 シミュレーションはドッキング>AutoDockを実行してください。
  8. 結合親和性を計算された結合エネルギー(ドッキングスコア)に基づいて評価します28。
    注:結合エネルギーが低いほど、予測される生活性が強くなり、タンパク質-リガンド複合体の構造安定性が高いことを示します。結合安定性の良好な判断には、通常 ≤ -5.0 kcal/molの閾値が用いられます。

結果

YQQJ水抽出物中の成分分析
YQQJ水抽出物の成分分析は、プロトコル4で定められた条件のもとで実施されました。UHPLC-Q-Orbitrap HRMSは、YQQJの水抽出物をプロファイリングするために、正イオンおよび負イオンフルスキャンモードの両方で使用され、得られたベースピークイオンクロマトグラム(BPI)は図1に示されています。この基盤に基づき、自己構築した化学成分データベースとMS/MSスペクトル特性解析を組み合わせ、水抽出物から185種類の化合物を成功裏に同定し、詳細な情報は補足表1にまとめられています。化合物同定に用いられる代表的なMS/MSスペクトルマッチングおよび断片化パターンは補足図1に示されています。化合物カテゴリーの統計解析により、フラボノイドとテルペノイドがYQQJの主要な構成要素であり、94化合物が最も豊富であることが明らかになりました。

YQQJの血液吸収成分
生体内での直接的な生体活性物質を明確にするために、YQQJ投与後に採取した血清サンプルを分析しました。ブランク血清のBPIクロマトグラム(図2)を含み、薬剤由来化合物と内因性血清成分を区別するために含まれました。薬剤含有血清のBPI(図3)に基づき、血流に吸収された合計28種類の試作成分が特定され、主にフラボノイド、テルペノイド、ステロイドが含まれます。YQQJ抽出物、ブランクセラム、薬物含有血清の代表化合物のイオンクロマトグラム(EIC)を抽出した結果、流通中の薬物由来成分の存在が確認されました(補足図2)。そのうち、Spatholobus suberectus Dunnから10、Dioscorea nipponica Makinoから7、Astragalus membranaceusから7、Hedyotis diffusa Willd.から6、Lonicera japonica Thunb.から6、Plantago asiatica L.から4、リウムパルマタムから4が由来しています。補足表1にまとめられている。

IgANに関連するYQQJの血液吸収成分の標的予測
血流に投入された28種類の同定されたプロトタイプ成分がターゲット予測データベースに入力され、459の潜在的なターゲットが得られました。一方で、統合バイオインフォマティクスプラットフォームから2779のIgAN関連標的が回収されました。交差解析により、YQQJとIgANの間に247の重複ターゲットが特定されました(図4)。

PPIネットワークの構築と解析
247の交差ターゲットはPPIプラットフォームにアップロードされ、可視化ソフトウェアを使ってDC、BC、CCの3つのトポロジーパラメータに基づくコアターゲットをスクリーニングしました。合計42のターゲットが最終的にコアノードとして特定されました。これらのコアターゲットをスクリーニングするために用いられるワークフローは 補足図3にまとめられています。PPIネットワークでは、ノードのサイズや色はパラメータ値によって変動し(図5)、TP53、SRC、AKT1、ESR1、STAT3がトップ5のコアターゲットにランクインしました。

YQQJの「フォーミュラ–血液吸収成分–コアターゲット–経路–疾患」ネットワーク
YQQJがIgANに対して持つ多成分・多標的メカニズムを体系的に明らかにするため、「Formula–Blood-Absorbed Components–Core Targets–Pathways–Disease」相互作用ネットワークが可視化ソフトウェアを用いて構築されました。ネットワークは96ノードと459エッジで構成され、各エッジは2つのノード間の関係または相互作用を表していました(図6)。

GOおよびKEGG濃縮解析
42コアターゲットのGO濃縮解析により、1162のBP項、52のCC項、92のMF項が明らかになりました。 図7 は、BP、CC、MFカテゴリで最も大きく強化されたGO用語トップ10を示しています。KEGG濃縮解析により、これらのコアターゲットに関連する182の経路が特定されました。 図8 は、IgANの病因に密接に関連する上位20の有意に濃縮された経路を示しています。これらのチャートでは、より深い赤色は統計的有意性が高いことを示し、バブルサイズが大きいほどバーの長さが長いほど、各経路内の濃縮ターゲット数が増えていることを示します。

分子ドッキング評価
本研究では、IgAN29,30,31,32の主要ターゲットおよび関連経路の解析に基づき、CASP3(PDB ID: 6X8I)、IGF1R(PDB ID: 1JQH)、JUN(PDB ID: 8RPP)、STAT3(PDB ID: 6NJS)、PRKCB(PDB ID: 8SE3)、PIK3CA(PDB ID: 5FI4)を含む6つのコアターゲットが分子ドッキングの受容体タンパク質として選定されました。IgANの中毒性(「腎臓に侵入する病原性風、湿熱、毒素」と定義される)に対応し、熱を浄化し湿気除去・解毒特性を持つ代表的な活性成分が配位子として選ばれました。すなわち、Hedyotis diffusa Willd.のデアセチルスペルロシジック酸とジェニポシジック酸、Dioscorea nipponicaのディオシンです。牧野。ドッキング結果は図9に示されています。すべてのリガンド-受容体の組み合わせの中で、ディオシンは選択されたすべての標的で著しく低い結合エネルギーを示し、より高い結合親和性を示唆しています。JUNとデアセチルスペルロシド酸/ジェニポシジック酸の相互作用を除き、他のドッキングペアも良好な結合活性を示しました。代表的な3Dドッキングの構造は図10に示されています。

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図1:YQQJ水抽出物のベースピークイオンクロマトグラム。 (A) 正イオンモードBPIクロマトグラム。(B) 負イオンモードBPIクロマトグラム。クロマトグラムは、確立されたUHPLC-Q-Orbitrap HRMS条件下でのYQQJ水抽出物の全体的な化学プロファイルを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:ブランク血清のベースピークイオンクロマトグラム。 (A) 正イオンモードBPIクロマトグラム。(B) 負イオンモードBPIクロマトグラム。クロマトグラムは、薬物由来成分と内因性成分を区別するために、薬物含有血清との比較対照として用いられる内因性血清背景プロファイルを表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:YQQJ含有血清のベースピークイオンクロマトグラム。 (A) 正イオンモードBPIクロマトグラム。(B) 負イオンモードBPIクロマトグラム。クロマトグラムは、YQQJ投与後に血清中に検出された血液吸収成分のプロファイルを表しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:YQQJとIgAN間の重なり標的のベン図。 図は予測されるYQQJターゲット数、IgAN関連ターゲット、およびそれらの交差点を示し、治療効果に関与する可能性のある共通ターゲットを強調しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5:コアターゲットのタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク。 ノードはタンパク質の標的を表し、エッジは標的間の相互作用を表します。ノードのサイズと色の強度は度数に対応し、ノードが大きく濃いほどネットワーク内の接続性が高いことを示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図6:YQQJの成分、標的、経路、疾患の統合ネットワーク。 このネットワークは、配合、血液吸収成分、コアターゲット、経路、IgANとの関係を示しています。三角形は病気を表し、円は経路を表し、V字型のノードはYQQJの式を表します。ダイヤモンドはハーブを表し、六角形は構成要素を表し、オクタゴンは血液吸収部品の試作を表し、長方形はターゲットを表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図7:コアターゲットのGO濃縮解析。 棒グラフは、BP、CC、MFカテゴリにおける上位10の強化遺伝子オントロジー用語を示しています。x軸はGO項を表し、y軸は−log10(p値)を示し、濃縮の重要性を示します。略称:BP = 生物学的プロセス;CC = 細胞成分;MF = 分子機能。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図8:コアターゲットのKEGG経路濃縮解析。 バブルプロットは、上位20の濃縮されたKEGG経路を示しています。ドットサイズは濃縮遺伝子の数を示し、色のグラデーションは−log10(p値)を示し、赤色ほど統計的有意度が高いことを示します。x軸は遺伝子比を示し、y軸は経路用語を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図9:分子ドッキング結合エネルギーヒートマップ。 ヒートマップは、コアターゲットと主要な血液吸収化合物間の結合エネルギー(kcal/mol)を示します。結合エネルギー値が低いほど、予測される結合親和性が強いことを示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図10:代表的な分子ドッキング構造。 (A) デアセチルラスペルロシド酸とCASP3の結合構象。(B) STAT3によるディオシンの結合立体構造。(C) PIK3CAによるゲニポジジド酸の結合立体構造。画像は予測されたリガンド–タンパク質相互作用と結合配位を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:高分解能MS/MSによる代表化合物の構造同定。 (A) デアセチルスペルロシジック酸の実験スペクトル(上、赤)と参照データベーススペクトル(下、青)の頭から尾へのスペクトル比較。(B) デアセチルラスペルロシド酸の高分解能MS/MS断片化スペクトル。(C) ジェニポジジン酸の頭から尾までのスペクトル比較と参考データベース。(D) ゲニポジジン酸の実験的なMS/MS断片化スペクトル。(E) ディオシンと参照データベースの頭から尾までのスペクトル比較。(F) Dioscinの高分解能MS/MS断片スペクトル。これらのパネルは、化合物同定に用いられるスペクトルマッチングを示しています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:サンプル間で代表化合物の抽出イオンクロマトグラム(EIC)。 (A) 脱アセチルスペルロシド酸のEIC。(B) ジェニポジジッド酸のEIC(C) ディオシンの編集長。各パネルの上部トレースはYQQJ水抽出物(ZY)、中央トレースはブランクコントロール血清(KBX)、下部トレースはYQQJ投与後の血液吸収成分を含む血清サンプル(GYX)を表します。比較により、血清中の薬物由来化合物の存在が浮き彫りになります。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:コアターゲットのスクリーニングワークフロー。 フローチャートは、複合ターゲット予測、IgAN関連ターゲット収集、交差解析、PPIネットワーク構築、トポロジカルパラメータに基づくコアターゲットのスクリーニングを含む、ターゲット同定の段階的なプロセスを示しています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

時間(分)移動フェーズ
A(v)B(v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

表1:UHPLC勾配洗脱プログラム。 表は、クロマトグラフィー分離に使用される移動相組成および勾配条件、時間点および対応する水性(相A)および有機(相B)溶媒の割合を示しています。

補足表1:YQQJ水抽出物の化学成分が特定されました。 この表は、UHPLC-Q-Orbitrap HRMSによって特定された化合物、試作血液吸収成分(A1–A28)およびその分類およびハーブ起源を示しています。略称:BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.;CSL = Dioscorea nipponica 牧野;DH = 掌脂類リウマチ ア L.;JXT = Spatholobus suberectus Dunn;HQ = Astragalus membranaceus;CQC = プランタゴ・アジアティカ L.;JYH = ロニセラ・ジャポニカ。 サンブ。複合類にはA=アルカロイド、Ald = アルデヒド;F = フラボノイド;N = ヌクレオシド;O = その他;OA = 有機酸;P = フェノール;PA = フェノール酸;Phe = フェニルプロパノイド;Q = キノネス;S = 糖類;Ste = ステロイド;T = テルペノイド;タン=タンニン。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、「UHPLC-Q-Orbitrap HRMS同定・血清薬理化学解析・ネットワーク薬理学予測・分子ドッキング検証」を組み合わせた統合戦略を用いて、IgAN治療におけるYQQJの潜在的物質的基盤とメカニズムを体系的に明らかにしました。従来の研究では主にMSを使ってハーブ処方の化学成分を分析し、ネットワーク薬理学のみでメカニズムを予測していましたが、血清薬理化学は「複雑なハーブ成分–血液吸収成分–直接生体内活性物質–薬理力学的材料基盤」のワークフローに従っています。投与後に全身循環に入る成分を特定することで、このアプローチはTCM処方の薬理力学的物質基盤を特定する効果的な戦略として広く認識されています。

本研究では、UHPLC-Q-OrbitrapによるHRMS解析でYQQJ中に185成分が当初同定され、そのうち28成分が血液吸収の試作化合物であることが確認され、後の機構研究の信頼できる化学的基盤を提供しました。この同定の精度は、保持時間、正確な質量、MS/MS断片情報の包括的なマッチングに依存していました14。血清薬理化学戦略に基づき、これらの試作血吸収化合物がネットワーク構築の出発点として用いられ、ハーブ成分と実際の生体内有効性の関連性が高まりました。複合疾患交差標的とPPIベースのコアノードスクリーニングを統合し、GOおよびKEGG濃縮解析を行うことで、IgANに関連する主要なシグナル伝達経路が15条同定されました。分子ドッキングの結果は、主な血液吸収成分が Hedyotis diffusa Willd. および Dioscorea nipponica Makinoから由来することを示唆しました。実験的に確認された機能活性ではなく、予測された結合親和性に基づいてコア標的と相互作用する可能性があります。これらの発見は、デアセチルスペルロシド酸、ゲニポジジン酸、ジオシンがYQQJの主要な薬理動態成分として機能する可能性があるという仮説を支持しており、さらなる実験的検証が待っています。

技術的な観点からは、サンプルの前処理が極めて重要でした。血清の複雑さとホルモンや酵素などの内因性タンパク質の存在により、血液吸収成分の検出妨害は避けられません。本研究では、メタノール沈殿法を用いて分析物の濃縮と背景干渉の低減を行い、MS分析の感度と精度の両方を確保しました。血液採取の時間点に関しては、ハーブ処方内の異なる成分が異なる吸収および生体内での形質変化パターンを示すことがあり、それが血清での検出性に影響を与えることがあります。したがって、予備試験に基づき、最終投与後2時間および8時間後に血清サンプルを採取し、循環中の成分のカバー範囲を最大化しました。

このワークフローの成功裏の実装には、特に重要な手続きのステップがいくつかあります。正確な化合物同定は、保持時間、高分解能質量精度、診断用MS/MS断片イオンの複合評価に大きく依存しています。さらに、投与後のさまざまな段階で血液吸収成分を捕捉するためには、適切な血清サンプリング時間点が不可欠です。したがって、複雑な生物行列における試作化合物の検出を確実にするためには、試料前処理およびクロマトグラフィー分離条件の慎重な最適化が必要です。

試料準備やMS分析の際に潜在的な分析上の課題が生じる可能性があります。例えば、不完全なタンパク質沈殿はイオン化効率を抑制するマトリックス効果を引き起こす可能性があり、一方で過剰な背景ノイズは検出感度を低下させることがあります。これらの問題は、タンパク質沈殿時の溶媒比の最適化、クロマトグラフィー分離条件の改善、MS取得パラメータの調整によって緩和できます。データ処理中に、データベースマッチングのみに頼ると偽陽性複合注釈が発生することがあります。したがって、MS/MSの断片化パターンや保持挙動の手動検証が、識別信頼性向上のために推奨されます。

この研究にはいくつかの方法論的考慮が取り入れられました。第一に、経口バイオ利用能や薬剤類似性といった従来の基準を適用せず、実験的に検証された血液吸収成分のみを標的予測に用いました。このアプローチは、あらかじめ設定されたろ過閾値による有効化合物の省略を避け、生体内で生体利用可能でない無関係成分を排除することで、ネットワーク予測の生理学的関連性を強化しました16。第二に、ドッキング用の有効配位子の選択は、「風湿を除去し熱毒素を除去する」機能を持つ漢方由来の主要成分(Hedyotis diffusa Willd. および Dioscorea nipponica Makino.)に焦点を当て、TCMの「風湿熱毒素が腎臓に侵入する」という病理的概念と現代のIgAN病理的特徴との間に機論的な架け橋を築きました。これは、式とパターンの相関に関するTCM理論を支持する予備的な証拠を提供します。第三に、データベース間でデータサイズや品質の違いを考慮し、複数のプラットフォームを統合して対象カバレッジを拡大し、単一のデータベースによるバイアスを軽減しました35。

従来の戦略でネットワーク薬理学を直接適用して検出されたすべての化学成分と比較し、現在のワークフローは実験的に検出された血液吸収成分に基づくエビデンスに基づく化合物の優先順位付けを重視しています。この段階的なフィルタリングプロセスにより、計算解析に入る候補化合物の数が減り、化合物–ターゲット相互作用ネットワークの解釈性が向上します。さらに、主に内因性代謝の乱れを捉える代謝体学志向の研究とは異なり、現在の戦略はハーブ医薬品由来の外因性プロトタイプ化合物に焦点を当てており、特定のハーブ成分に対する薬理学的活性をより直接的に帰属させることを可能にします。

実践的な方法論的観点から、このワークフローは複雑なハーブ製剤の調査にいくつかの利点を提供します。HRMSと血清薬理化学の統合により、生体利用可能成分の信頼性の高い同定が可能となり、ネットワーク薬理学と分子ドッキングの組み合わせにより、化学的証拠と機構的予測を結びつける階層的な分析フレームワークが確立されます。さらに、ネットワーク構築を実験的に検証された化合物に限定することで、ネットワークの複雑さを軽減し、コア化合物と標的相互作用の明確な同定を容易にします。

この研究には限界もあります。まず、ネットワーク薬理学と分子ドッキングは予測計算的アプローチです。強い結合親和性は必ずしも生体内での生物学的制御に結びつくわけではなく、分子ドッキングはタンパク質の動態、細胞内の文脈、下流のシグナル伝達を考慮しない。さらに、現行ドッキングプロトコルには共結晶リガンドを用いた再ドッキング検証や既知阻害剤とのベンチマークが含まれておらず、ドッキング精度の評価が制限される可能性があります。RMSDベースの検証、分子動力学シミュレーション、実験アッセイを取り入れた今後の研究は、これらの予測の信頼性をさらに強化するでしょう。現在、私たちのグループはディオシンがJAK2/STAT3経路を通じて作用することを示すメカニズム的検証を完了しており、これにより予測の信頼性がある程度強化され、本研究で特定された主要ターゲットに対する部分的な実験的支持を提供しています。ただし、他の成分–ターゲット相互作用については依然として確認が必要です36.第二に、ハーブ間の比例適合性や用量関係の影響は本分析に組み込まれていませんでした。今後の研究では、臨床処方実践をよりよく反映するために用量効果加重ネットワークモデルを導入する可能性もあります

結論として、現在のワークフロー—高解像度のMSベースの血液吸収成分同定、ネットワーク薬理学に基づく標的および経路集中解析、分子ドッキング検証—は、複雑なハーブ処方から有効物質基底および作用標的を効率的に絞り込むことを可能にします。これにより、追跡調査の生物学的検証に明確な実験的方向性が示され、TCM処方の機構的調査が加速されます。将来的には、空間代謝体学、オルガノイドモデル、マルチオミクス技術の統合により、生理学的・病理学的条件をより正確に再現するシステムにおける現存研究の動的かつ三次元の検証・拡張が可能となり、TCMの公式の科学的基盤を解明するためのより堅牢な証拠を提供する可能性があります。

開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金(助成金番号81973675)、中国医療病院高レベル促進プロジェクト(助成金番号)の支援を受けました。HLCMHPP2023039)、および北京自然科学基金(助成金番号7252259)から。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AutoDock 4.2.6スクリプト研究所-
クロマトグラフィーカラムウォーターズ社アクイティUPLC HSS T3
高速冷蔵遠心分離機ヘティッヒ研究所テクノロジーミクロ220R
統合バイオインフォマティクスプラットフォームワイツマン 研究所 of 科学-GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)
統合バイオインフォマティクスプラットフォームその...ジョンズ ホプキンス 大学 学校 of 医学-OMIMデータベース(https://omim.org/)。
LC-MS/4 L アセトニトリルサーモフィッシャー・サイエンティフィックA955-4
LC-MS/4 Lメタノールサーモフィッシャー・サイエンティフィックA456-4
LC-MS/4リットル水サーモフィッシャー・サイエンティフィックW6-4
LC-MS/50 mL 蟻酸サーモフィッシャー・サイエンティフィックA117-50
質量分析データ処理ソフトウェアウォーターズ社-Progenesis QI 3.0ソフトウェア
分子ドッキングソフトウェアオルソン研究所AutoDock 4.2.6
PPIプラットフォームSTRINGデータベース会社-STRINGオンラインプラットフォーム(https://string-db.org 年)
タンパク質データベース欧州バイオインフォマティクス研究所;スイス生物情報学研究所、タンパク質情報リソース-UniProtプラットフォーム(https://www.uniprot.org/)
四極軌道トラップ質量分析計サーモフィッシャー・サイエンティフィックIQLAAEGAAPFALGMAZR
参考化合物データベースTCM Pro 2.0、北京和新科技有限公司-
ロータリーエバポレーター上海タイタン科学株式会社TR-3L
構造生物学データベース。ブルックヘブン国立研究所-RCSB PDBデータベース(https://www.rcsb.org/)
構造生物学データベース。国立バイオテクノロジー情報センター-PubChemデータベース(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 年)
ターゲット予測データベースSIBスイスバイオインフォマティクス研究所-SwissTargetPredictionデータベース(https://www.swisstargetprediction.ch 年)
ターゲット予測データベース上海 研究所 of マテリア メディカ-TCMSPデータベース(https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
トポロジカル解析プラグイン--Centiscape 2.2プラグイン;ネットワークアナライザー
UHPLCシステムヴァンキッシュ・フレックス-
超高性能液体クロマトグラフサーモフィッシャー・サイエンティフィックヴァンキッシュ・フレックスUHPLC
超音波抽出器昆山超音波計測株式会社KQ3200D
真空遠心濃縮機寧波科学バイオテクノロジー有限公司シエンツ-1LS
可視化ソフトウェア--Cytoscape 3.10.4
ウェブベースの関数注釈プラットフォーム。ブロード 研究所-Metascapeオンラインプラットフォーム(https://metascape.org 年)

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