エピトランスクリプトームの解読:乳がんにおけるm6A調節ネットワークへのシ リコ の洞察

Summary

本プロトコルは、がんゲノムアトラス(TCGA)、遺伝子型-組織発現(GTEx)プロジェクト、マイクロアレイプラットフォームからの公開データセットを用いて、突然変異プロファイル、コピー数変異、遺伝子発現、臨床アウトカムを統合し、m6A修飾調節因子のシ リコ 遺伝学的、分子的、予後解析を行うアプローチを提示します。

Abstract

N6-メチルアデノシン(m6A)は真核転写産物における最も豊富な内部RNA修飾であり、RNA代謝、遺伝子発現、細胞恒常性において重要な役割を果たします。m6A調節因子の調節障害(「書き手」「消しゴム」「リーダー」など)は、がん生物学にますます関与しているとされています。しかし、乳がんにおける彼らの包括的な役割はまだ理解されていません。本方法論の主な目的は、バイオインフォマティクス初心者に対し、公開されているがんデータセットを活用して突然変異解析を行い、遺伝子発現変化を評価し、患者生存率との関連を検証するためのステップバイステップの枠組みを提供することです。ケーススタディとして、乳がんにおけるm6A調節因子は、Cancer Genome Atlas(TCGA)、Genotype-Tissue Expression(GTEx)プロジェクト、およびマイクロアレイプラットフォームのデータセットを用いて解析されました。トランスクリプトミクスプロファイルを体系的に解析し、乳がんにおけるm6A調節成分の予後関連性を評価するワークフローを示しました。この分析枠組みを用いて、主要なm6A調節因子間で遺伝的変異や発現の違いが明確に見られました。METTL14、CBLL1、YTHDC1、HNRNPC、HNRNPA2B1、RBMXなどの複数の調節因子は患者の生存率向上と関連し、YWHAGは全体的な生存率が低いと関連していました。本研究は、乳がんにおけるm6A調節遺伝子の包括的なシステムゲノミクス概要を提供するとともに、実用的かつ再現性の高いウェブベースのバイオインフォマティクスワークフローを示します。これらの発見は乳がんにおけるエピトランスクリプトム調節の理解を深め、新しいm6Aベースの診断および治療戦略の開発の基盤を提供します。

Introduction

エピトランスクリプトミック修飾は転写後遺伝子調節の重要な層であり、多様な細胞過程や疾患状態に寄与します。これまでに170以上のRNA修飾が確認された中で、N6-メチルアデノシン(m6A)は真核生物mRNAにおいて最も多く、よく特徴づけられている1^。METTL3/METTL14を含む「ライター」複合体によってインストールされ、FTOやALKBH5などの「消しゴム」によって除去され、YTHやIGF2BPファミリーのメンバーを含む「リーダー」タンパク質によって解釈されるm6Aは、RNAのスプライシング、安定性、輸送、翻訳を調整し、発生、分化、^{ストレス応答などの}主要な生物学的プロセスに影響を与え^ます。

m6A調節成分の変化は、幅広い悪性腫瘍で報告されています⁴.多くのがんでは、異常なm6A活性が悪性表現型を引き起こします。例えば、METTL3の発現が上昇すると、ハリネズミ経路およびMYC RNAメチル化を調節することで前立腺がんの発症と進行を促進します^5,6。当初、急性骨髄性白血病におけるがん性影響に関与することが判明しましたが、FTOは肝臓、肺がん、大腸がんにおける腫瘍進行を促進することが示されました(7,8,9,10)。しかし、FTOおよびALKBH5の文脈依存的な役割が特定され、m6A介在の調節が二重に作用していることを示し、発がん性と腫瘍抑制シグナル伝達の両方を促進することを示しています⁽11,12,13,14)。YTHDF1/2/3を含むM6Aリーダー、異質核リボ核タンパク質(hnRNPs)、インスリン様成長因子-2 mRNA結合タンパク質(IGF2BP1-3)も発がん性と関連していることが確認されています 15,16,17。

乳がんにおいて、m6A調節因子が頻繁に調節不全を発し、腫瘍サブタイプ、免疫関連の特徴、臨床アウトカムと関連している可能性が増える証拠が示唆されています(^18,19)。複数の機構的研究により、METTL3は乳がんにおいて頻繁に上行される腫瘍促進因子として位置づけられています。METTL3を媒介するm6Aの導入は、増殖、上皮間葉転移(EMT)、転移、^{化学療法抵抗}性を促進する転写本の翻訳を安定化または促進することができます。METTL3はBcl-2を標的化することで乳がんの進行を促進することも示^{されています。}ALKBH5はNANOGやその他の幹関連分子を通じてがん幹細胞プログラムの調節に関与しているとされていますが、その影響は腫瘍の文脈によって異なります²²。

近年、m6A調節因子のリストが拡大し続ける中、新たに特定された調節因子が乳がんでどのように調節不均衡になっているかについての最新情報が必要です。表1は、書き込み器、リーダー、消去器を含むm6Aレギュレーターの一覧を示しています。さらに、LRPPRCやYWHAGなどの新規m6A調節因子ががん進行に関与することが確認されています 23,24,25。そのため、既知のすべてのm6A調節因子の包括的な遺伝的・分子的特徴解析が、限られたバイオインフォマティクスの背景を持つ研究者が用いられるツールを用いて乳がんにおいて実施されました。

本Methods記事の目的は、公開されているがんゲノミクスリソースを用いて、乳がんにおけるm6A調節因子を解析するための段階的なプラットフォームベースのバイオインフォマティクスプロトコルを提示することです。The Cancer Genome Atlas(TCGA)(www.cancer.gov/tcga)、Genotype Tissue Expression(GTEx)プロジェクト²⁶、cBioPortalやUCSC Xenaなどのウェブベースの分析プラットフォームのデータセットを用いて、このプロトコルは突然変異プロファイル、遺伝子発現変異、患者生存との関連を評価するための再現可能なワークフローを示しています。この可視化されアクセスしやすいアプローチは、がんバイオインフォマティクスに初心者の研究者がエピトランスクリプトミックデータ解析を採用することを目的としています。

Protocol

注:m6Aメチル化調節因子をコードする遺伝子のリスト(書き手、リーダー、消しゴムに分類)は表 1に示されています。挙げられたすべての遺伝子は、その後の変異、発現パターン、全生存率の解析に含まれました。本研究で使用されるすべてのソフトウェアおよびツールは 材料表に記載されています。

1. m6A調節因子における遺伝的変異の同定

1. がんゲノミクスのためのcBioPortalにアクセスしてください。cBioportalのウェブサイト(www.cbioportal.org)^27、28にアクセスしてください。ホームページから「クエリ」タブを選択して新しい分析を開始します。
2. 適切ながん研究とコホートを選択してください。
3. 「可視化および分析のための研究を選択する」検索バーで「Breast Invasive Carcinoma」と入力し、「Breast Invasive Carcinoma (TCGA, Pan-Cancer Atlas)」を選択してください。
4. 下部で「遺伝子によるクエリ」を選択してください。
   重要事項:選択されたコホート(996サンプル)に変異データとコピー数変異(CNA)データの両方が含まれていることを確認してください。
5. 遺伝的クエリを定義してください。「遺伝子入力」 欄には、調査中のm6A調節因子の全リストのHUGO遺伝子記号を入力してください。
   注:遺伝子はスペースで区切られたリストとして入力可能です。「ゲノムプロファイルを選択する」では、以下の2つのデータタイプ(変異)とコピー番号改変(Mutations)にチェックを入れてください。
6. 「患者/症例セットを選択する」から、すべてのプロファイル症例を持つコホートに対応するデフォルトのサンプルセットを選択してください。
7. 青い「クエリを送信」ボタンをクリックしてください。
8. 遺伝子変異データを取得し解釈してください。提出すると、結果は「summary」タブに表示されます。中央の「OncoPrint」可視化は、コホート内のすべての遺伝子における遺伝的変異の即時概要を提供し、ダウンロード可能です。
9. OncoPrintの横に「がんタイプ概要」プロットを見つけてください。これにより、乳がんサブタイプ間の変異の定量的内訳が得られます。
10. 汎がん分析を行いましょう。cBioPortalのホームページに戻り、「Query」タブの「TCGA PanCancer Atlas Studies」を選択してください。
11. 遺伝子入力欄に同じm6A調節遺伝子のリストを入力します。
12. 「クエリを送信」 をクリックし、結果ページで「がんの種類概要」タブに移動します。これは汎がんの視点を提供します。

2. UCSC Xenaを用いたm6A調節因子の比較トランスクリプトミック解析。

1. UCSCゼナプラットフォームにアクセスしてください。UCSCゼナのウェブサイト(https://xena.ucsc.edu)²⁹へアクセスしてください。
2. ホームページから「Xenaを起動」ボタンをクリックして、メインの分析ブラウザに入ります。
3. Xenaブラウザで「DATA SETS」をクリックします。
4. データセットの中から「TCGA TARGET GTEx」を選択してください。これはTCGAおよびGTExプロジェクトの正常組織から均一に処理されたRNA-Seqデータが含まれています。
5. 次のページで「VISUALIZE」をクリックしてください。
6. 表現型(サンプルグループ)変数を定義します。「最初の変数を選択する」で、表現型データ型の「メインカテゴリ」を選択します。
7. 「TO SECOND VARIABLE」をクリックしてください。次に、ゲノムデータ型でデータセット内の「遺伝子発現」にチェックを入れます。「遺伝子または位置を追加する」ボックスに遺伝子リストを追加します。「完了」をクリックしてください。
8. ヒートマップで表情パターンを視覚化しましょう。
9. 乳房(TCGA+GTEx)サンプルをTCGA TARGET GTExから分離するには、「Breast」と入力し、フィルターオプションを使ってサンプルを保持してください。
10. ヒートマップは現在表示され、PDFとしてダウンロード可能です。
11. 個々の遺伝子の比較ボックスプロットを作成します。特定の遺伝子の発現差異を定量化・可視化するには、「チャートとして表示」をご利用ください。このオプションを用いると、データはボックスプロット、ドットプロット、バイオリンプロットとして見られ、2つのサンプルグループ間の表現分布を比較できます。
12. 「PDFとしてダウンロード」オプションを使ってチャートをダウンロードしてください。
13. 統計的有意性(p値)は「STATISTICS」をクリックすると取得できます。

3. Kaplan-Meier プロッターを用いたm6A調節因子の予後的重要性評価。

1. Kaplan-Meier プロッターツールにアクセスしてください。Kaplan-Meier Plotterのウェブサイト(https://kmplot.com/analysis)³⁰へアクセスしてください。
2. ホームページから「乳がん」タブを選択して、乳がんデータセットに特化した分析を開始します。
3. 単一の遺伝子に対して遺伝子クエリを設定します。
4. プライマリ入力セクションで「遺伝子シンボル」ボックスを見つけてください。
5. 解析対象のm6A調節遺伝子の公式記号(例:METTL3)を入力します。
   重要な点:遺伝子入力ボックスの真下で、「Only JetSet best probe set」のチェックボックスを見つけて有効にしてください。これにより、最も信頼性が高く特異的なマイクロアレイプローブが自動的に遺伝子に選択され、データの品質と再現性が最適化されます。
6. 生存分析パラメータを定義してください。「生存」セクションでは、この分析の主要エンドポイントとして「総合生存(OS)」 を選択してください。この設定を選択すると、ツールは自動的に1880人の乳がん患者のデータを活用します。
7. 「患者を分けて」オプションを「中央値」に設定していることを確認してください。これにより患者は2つの等しいグループに分類されます。高発現と低発現は、すべてのサンプルにおける調べられた遺伝子の中央値発現値に基づいています。
8. 「フォローアップ閾値」 を使ってフォローアップ期間を選択できます。本研究では180か月が選ばれました。
9. カプラン・マイヤープロットを生成し解釈します。
10. 「カプラン・マイヤープロットを描く」ボタンをクリックしてください。
11. 新しいウィンドウが読み込まれ、サバイバルカーブが表示されます。
12. 重要なプロット要素を解釈し、X軸は月単位、Y軸は全体の生存確率を示し、2本の色付き線は高発現(赤)と低発現(黒)患者群の生存曲線を表しています。対数ランクのP値が表示され、2つの生存曲線間の差異の統計的有意性を示します。

Results

乳がんにおけるm6aメチル化調節因子の変異的状況

TCGAデータセットのゲノム解析に関する以前の研究では、DNAメチル化調節因子をコードする複数の遺伝子の再発変異^{が報告されています}。本研究では、cBioPortalを用いて「Breast Invasive Carcinoma(TCGA、PanCancer Atlas)」データセットを解析し、m6A RNAメチル化の書き手、リーダー、消去装置をコードする遺伝子の変異プロファイルを調べました。この解析では、乳がん患者における多様な遺伝的変異が明らかになり、遺伝子ごとに変異頻度が大きく異なり、CNBPおよびRBM15Bでは0.4%、VIRMAでは12%に及びました(図1A)。遺伝子増幅が最も一般的な変異であり、追加の事象としては深い欠失、塩基置換、複数の同時変異が含まれていました。特に、m6A関連機能を調節する遺伝子の変異が476人(コホートの48%)で検出され、乳がんにおけるm6A修飾動態の重要性...

Discussion

本手法の記事は、がん研究におけるあらゆる遺伝子シグネチャーの体系的なマルチオミクスプロファイリングおよび臨床翻訳のための包括的でアクセスしやすく統合されたワークフローを提供しており、乳がんにおけるm6A RNAメチル化調節因子の解析を通じて示されています。これらの主要な公共バイオインフォマティクスプラットフォームを組み合わせることで、研究者は高度な計算専門知識を必要とせずにゲノム発見から臨床的に関連性のある仮説へと効率的に進むことができます。

この手法の主な強みは、モジュール型で仮説生成パイプラインです。このプロトコルはユーザーを論理的な順序に沿って導きます。まず遺伝子改変遺伝子を特定し(cBioPortalを用いて)、次にバッチ補正環境下での発現異常を評価(UCSC Xenaを使用)、最後にその異常調節が患者の生存に与える臨床的影響(Kaplan-Meier Plotterを用いて)評価します。DNAからRNA、臨床結果に至るまでの段階的な解析は、候補遺伝子を優先的に研究する結果となります。例えば、このワークフロ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cBioPortal	メモリアル・スローン・ケタリングがんセンター	https://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)	GTEx コンソーシアム	https://gtexportal.org
Kaplan-Meier Plotter	Gyorffy ラボ/A5 遺伝学株式会社	https://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)	米国国立がん研究所 (NCI)	https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena Browser	カリフォルニア大学サンタクルーズ校	https://xenabrowser.net