気管支喘息治療におけるグベン平川顆粒のメカニズムの探究

サマリー

本プロトコルは、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、 in vivo を用いて気管支喘息におけるGuben平川顆粒の作用機序を調査します。検証。

要約

本研究は、ネットワーク薬理学、分子結合、実験的検証を用いて、気管支の治療におけるグベン平川顆粒の作用機序を調査します。有効成分および対応する標的はTCMSP、HERB、SymMapのデータベースを用いて特定されました。気管支関連の標的はGeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、PharmGKBから収集されました。重複する標的を特定し、成分–標的およびタンパク質–タンパク質相互作用(PPI)ネットワークを構築しました。遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析は、誤発見率(FDR)補正を用いて実施されました。結合親和性を評価するために分子ドッキングを行い、その後in vivo での検証が行われました。合計121の有効成分と234の薬剤関連標的が特定され、155の重複標的が見られました。コアターゲットには TP53、 AKT1、 TNF、 IL6が含まれていました。 KEGG解析によりPI3K–Aktシグナル伝達経路の有意な濃縮が示され、実験的検証のために選択されました。分子ドッキングにより、コア成分と AKT1 の間に強い結合親和性が示されました。オブアルブミン誘発性喘息ラットでは、グベン平川顆粒が血清 IL-4 および IL-10 レベルを低下させ、肺組織内の FoxP3 発現を増加させ、 PI3K および AKT mRNAレベルを上位調節しました。これらの発見は、Guben Pingchuan顆粒が PI3K–Akt. シグナル伝達経路を調節し、炎症性サイトカインを調節し、調節T細胞機能を高めることで気管支喘息を緩和することを示しています。

概要

気管支喘息は、気道炎症、気道過敏性、粘液過剰分泌、気道再構築を特徴とする異質な慢性呼吸器疾患です^。その病因は、免疫細胞の活性化、炎症性メディエーター、複数のシグナル伝達経路の複雑な相互作用を伴います。臨床的には、喘息は繰り返しの喘鳴、呼吸困難、胸の締め付け感、咳を伴います。気道炎症は、IL-6、IL-4、IL-17、TNF-αなどの炎症性サイトカインの分泌増加、好酸球や好中球を含む炎症細胞の浸潤、気道平滑筋の増殖、基底膜の肥厚、粘液腺過形成といった構造変化を特徴とする疾患の発症および進行の中心的なメカニズムです.これらの病理学的過程は最終的に気道閉塞や気流障害を引き起こします。

喘息の病態生理は単一のメカニズムではなく、複数の相互作用するシグナル伝達経路によって調節されます。PI3K–Aktシグナル伝達経路は、特にTreg/Th17軸の免疫バランスを調節し、FoxP3の発現を調節する重要な役割を果たします。この経路はまた、IL-17およびTNFシグナル伝達経路と相互作用し、炎症反応や気道再構築を促進し、疾患の異質性と治療抵抗性に寄与します^3,4。疫学的データは、世界で喘息の有病率が継続的に増加していることを示しており、世界中で3億5,800万人以上が影響を受け、中国では約4,570万人の成人患者がいます^5,6。現在の治療法は主に吸入β₂作動薬とグルココルチコイドに依存しています。しかし、これらの治療法は病理的メカニズムが限定的であり、特定の患者で副作用やグルココルチコイド耐性を引き起こす可能性があります。PI3K–Akt.などの経路の調節障害は治療反応性の低下と関連しており、多標的治療アプローチの必要性が浮き彫りになっています^7,4。

伝統中国医学(TCM)では喘息を「シャオ症候群」と分類し、肺、脾臓、腎臓の機能不全と外的病原性要因が併せて現れます。TCM製剤は、その多成分・多標的特性により喘息管理に広く用いられています^8,9。単一標的薬理学的薬剤とは異なり、TCM化合物は複数の生物学的経路の調節を協調させることで治療効果を発揮し、喘息の複雑な病態生理と整合しています¹⁰。ネットワーク薬理学は、薬物成分、標的、疾患経路間の相互作用を解析するためのシステムレベルのアプローチを提供し、主要な生体活性化合物や分子メカニズムの同定^{を可能にします。}分子ドッキングは、小分子と標的タンパク質間の結合親和性を評価することで、このアプローチをさらに補完します。

グベン平川顆粒は、エ フェドラ・シニカ (エフェドラハーブ)、 ソラレア・コリリフォリア の果実、プル ヌス・アルメニアカ の種(アプリコットシード)、 プセウドステラリア・ヘテロフィラ の根、 ペリラ・フルテセンスの 果実、エ リオボトリヤ・ジャポニカ の葉(枇�の葉)、 リリウム・ブラウニー 球根、エ ピミット・ブレビコルヌム など、8種類の漢方成分からなる伝統的な中国薬用処方です。この処方は伝統的に活力を強化し、痰を解消し、喘鳴を和らげるために使われます。過去の臨床研究では、気管支喘息において治療効果が示されており、従来の治療法と比較して高い反応率を示しています¹²。

作用の根本的なメカニズムを明らかにするために、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、 生体内 実験検証を組み合わせた統合的アプローチを適用します。ネットワーク薬理学は、気管支喘息に関連する活性成分や潜在的な標的を特定するために用いられます。分子ドッキングは、主要な化合物と標的タンパク質間の相互作用を評価するために用いられます。その後、動物モデルでの実験的検証が行われ、特に PI3K–Akt. 経路における重要なシグナル伝達経路への調節効果が評価されます。このアプローチは、グベン平川顆粒の多標的治療効果に関する機構的な洞察を提供し、気管支喘息治療への応用を支援することを目的としています。

プロトコル

すべての動物処置は遼寧中医大学動物倫理委員会(承認番号:21000042023058)によって承認され、機関のガイドラインに従って実施されました。このプロトコルで使用される研究ツールは 材料表に記載されています。

1. データベースとソフトウェア

1. 以下のデータベースおよびソフトウェアにアクセスできます:TCMSP、HERB、SymMap、PubChem、STRING、GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、PharmGKB、DAVID、UniProt、Cytoscape(バージョン3.9.1)。

2. 構成目標の取得

1. TCMSPデータベースからエフェドラハーブ、アプリコットシード、プセウドステラリア根、ペリラの実、勷の葉、リリウム属、エピメディアの化学成分を取得¹³。HERBおよびSymMapデータベースからPsoraleaの化合物を取得してください。
2. 経口バイオアバ≥率30%および薬物類似性(DL ≥ 0.18)を用いて有効成分をスクリーニングする^14,15。
3. TCMSPを用いて標的遺伝子を予測します。すべての標的は、ホモ・サピエンスを選択してUniProtデータベースを用いて標準化します。非ヒトエントリー、注釈なしのタンパク質、廃止された識別子など、重複および無効なターゲットを削除します。

3. 気管支喘息標的の取得

1. 「気管支喘息」というキーワードでGeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、PharmGKBを検索してください。GeneCardsの関連スコアを>4に設定してください。回収したすべてのターゲットを統合し、重複するものを削除してください。

4. 交差点目標の特定

1. 薬物標的および疾患標的をオンラインのVenn分析ツールにインポートできます。重複するターゲットを特定し、その合計数を記録して後続解析に備えます。

5. コンポーネント–ターゲットネットワークの構築

1. 交差ターゲットをCytoscape 3.9.1にインポートします。コンポーネント–ターゲットネットワークを構築します。度数に応じてノードのサイズと色を調整してください。

6. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの構築

1. 交差点のターゲットをSTRINGデータベースにアップロードしてください。ホモ・サピエンスを選択し、信頼度スコアを≥0.900に設定します。ネットワークをエクスポートしてCytoscapeにインポートします。
2. 位相的パラメータ(次数中心性、中間中心性、近接中心性)を計算します。中央値閾値と次数>20を用いてコアターゲットを特定します。

7. GOおよびKEGG濃縮解析

1. 重複するターゲットをDAVIDデータベースにアップロードするか、RパッケージのclusterProfilerを使って解析してください。
2. 生物学的プロセス、細胞構成要素、分子機能カテゴリーの遺伝子オントロジー(GO)濃縮解析を行います。
3. KEGG経路濃縮解析を実施します。偽発見率(FDR)補正を適用し、有意性閾値をFDR<0.05に設定します。
4. バープロットやバブルプロットを使って、上部の豊かな項を可視化します。

8. 分子ドッキング

1. PubChemからコア化合物の2D構造をダウンロードしてください。ChemOfficeを使って3D構造を作成し、mol2ファイルとして保存します。
2. RCSB PDBデータベースからタンパク質構造をダウンロードしてください。PyMOLを使って水分子と配位子を除去します。
3. AutoDock Vinaを使って分子ドッキングを行います。グリッドボックスのパラメータを定義し、ドッキングシミュレーションを実行します。
4. 結合エネルギー(kcal/mol)と主要な相互作用残基を記録します。分子モデリング、可視化、シミュレーションプラットフォームを用いてドッキング結果を可視化します。

9. 実験的検証

1. 動物
   1. 48匹のオスのスプラグ・ドーリーラット(9週齢、220〜240g)を入手します。飼い動物は標準条件下で湿度55%〜60%、20〜25°Cで飼育します。
2. 薬剤と試薬
   1. エフェドラハーブ、プソラレア、アプリコットシード、プセウドステラリアの根、ペリラの実、枇の葉、ユリウム、エピミウムからなるグベン・ピンチュアンの粒を準備します。
   2. デキサメタゾン、オブアルブミン(OVA)、水酸化アルミニウム、ELISAキット、RNA抽出キット、および材料表に記載された抗体を準備します。
3. 楽器
   1. マイクロプレートリーダー、電気泳動システム、パラフィン顕微透膜、画像診断システムなどの標準的な実験機器を準備してください。
4. 動物の分類と処分
   1. ラットを無作為に6つのグループ(n = 8)に割り当てます:ブランクコントロール群、モデル群、デキサメタゾン群(0.3 mg/kg)、低用量中薬群、中用量中用量中薬群、高用量中医学群。
   2. 1日目、7日目、14日目に、モデル群、低用量中薬群、中用量中薬群、高用量中薬群、デキサメタゾン群のラットに1mL腹膜内注射を投与し、感作効果を高めます。
   3. 1日目、7日目、14日目に、白対照群のラットに0.9%生理食塩水の腹膜内注射1 mLを投与します。
   4. 15日目から21日目までは、1日1回、20分間のネブライズ吸入刺激を行います。モデル群、低用量中薬群、中用量中用量中医学群、高用量中医学群、デキサメタゾン群のラットに5%OVAネブライズド吸入を投与します。
   5. 15日目から21日目までの空白対照群ラットに0.9%生理食塩水ネブレーション吸入を投与しました。
   6. 割り当てられた治療群に従い、22日目から36日目まで1日1回経口経口で治療を行います。
   7. 実験中は毎日体重と全体的な状態を監視してください。実験のタイムラインは 表1にまとめられています。
5. 組織病理学
   1. 肺組織を採取してください。修正、埋め込み、セクションサンプル。ヘマトキシリン・エオシン染色を行います。
   2. コラーゲン沈着を評価するためにマッソン染色を行います。
6. RT-PCR解析
   1. 肺組織から全RNAを抽出します。
   2. 極低温条件下で凍結肺組織を均質化すること。試料を重量した後、液体窒素を含む予冷モルタルに素早く移し、粉末に粉砕します。
   3. 粉末状のサンプルを遠心分離機のチューブに移します。50〜100mgの組織ごとに1 mLのTransZol UPと0.2 mLのRNA抽出試薬を加えます。チューブを室温で5分間振ってください。
   4. 試料を1000 × g 、2〜8°Cで15分間遠心分離します。無色の水相を新しい遠心分離機管に移します。
   5. トランスゾールUP1 mLをイソプロパノール0.5 mLに加えます。混合物を室温で10分間孵化します。
   6. サンプルを1000 × gで10分間遠心分離します。75%エタノールを1mL加え、再び遠心分離機で5分間処理します。
   7. 上澄液を捨て、沈殿物を室温で5分間自然乾燥させます。沈殿物を50〜100μLのRNA溶液に溶かし、10分間培養します。
   8. 長期保存のためにサンプルは−70°Cで保管してください。
   9. cDNAを合成し、定量的なPCRを行いPI3KおよびAKT発現を測定します。
7. エリサ
   1. 血清サンプルは4°Cで解凍します。 製造元の指示に従ってELISAキットを使用して IL-4 および IL-10 .レベルを測定してください。
8. 免疫組織化学
   1. 肺組織は4%のパラホルムアルデヒドで固定され、パラフィンに埋め込まれ、スライスし、脱ワックス処理、水和処理。
   2. 抗原回収、ブロッキング、抗体培養を行います。FoxP3免疫組織化学キット、DAB染色液による染色、陽性発現は茶黄または濃い茶色の染色として現れます。
   3. 顕微鏡で観察・撮影し、Image Jソフトウェアを使用してFoxP3発現の定量的統計解析を行います。
9. 統計解析
   1. シャピロ–ウィルク検定を用いた検定データの正規性と、レヴェーン検定を用いた分散均質性。
   2. 必要に応じて一方向ANOVAやノンパラメトリック検定を用いてデータを分析してください。データを平均±標準偏差として表現します。
   3. p < 0.05を統計的に有意なと定義します。★★p < 0.01および★p < 0.05 対 対照群;◆ < 0.01 と ◆p < 0.05 モデルグループに対して;##p < 0.01、#p < 0.05とデキサメタゾン群。

表1:実験的タイムライン。 感作、挑戦、治療手順のスケジュール。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

結果

有効成分のスクリーニング
ターゲット活性のフィルタリングを経て、TCMSPデータベースから合計121の活性成分が特定されました。これには エフェドラ ハーブから23成分、 プソラレアから7成分、アプリコットシードから19成分、 プセウドステラリア 根から8成分、ペリラ果実から16成分、拇の葉から18成分、 リリウムから7成分、 エピミウム から23成分が含まれていました。(表2)ルテオリン、ケルセチン、β-シトステロール、ケンフェロール、スティグマスターロール、(+)-カテキンを含む16の一般的な成分が同定されました。標準化後に合計234の薬剤関連標的が取得されました。さらに、喘息関連標的が1,059件、薬剤と疾患の間に155件の重複標的が特定されました(図1)。

表2:古本平川...

ディスカッション

気管支喘息は呼吸器科でよく見られる疾患^です。これはアレルゲンと気道過敏性によって引き起こされる閉塞性気道障害^です。臨床的発生率が高く、再発しやすく、治癒が困難で、患者の健康や生活の質に大きな影響を与えます。2025年のグローバル喘息イニシアティブ(GINA)によると、吸入グルココルチコイド療法は^喘息に効果的であると報告されています。しかし、長期使用は遵守率の低下につながる可能性があります。一部の患者は用量の減少や中止後に再発し、視床下部-下垂体-副腎軸の抑制が起こり、部分的なグルココルチコイド反応性が生じることがある¹⁹。

近年、伝統中国医学(TCM)は喘息治療に注目を集めています。喘息は中医で小正症候群(喘鳴症候群)に分類され、病因としては風の過剰、体質欠損、気の逆流、痰閉塞が関与します。風の過剰な発作は急性喘息発作を引き起...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
qPCRキット	Novogene	NQ-001, 2×1mL	ターゲット遺伝子の相対的mRNA発現の検出
アルミニウム水酸化物Al(OH)3	上海裕波生物科技有限公司	YB-AL001, 500g	抗原免疫応答を高めるための免疫学的アジュバント
BCAタンパク質濃度測定キット	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 1箱につき100個	サンプルのロードを標準化するためのタンパク質全体の定量
化学発光イメージングシステム	Tanon	5200Multi	WBバンドイメージング、ゲルおよびブロットイメージの収集と分析
色付き前染めタンパク質マーカー	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	電気泳動実験のためのタンパク質分子量の基準
強化RNA抽出キット	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 1箱につき50個	組織および細胞からの総RNAの抽出と精製
酵素結合免疫吸着アッセイレーター	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	サンプル中のサイトカインとタンパク質含有量の定量的検出
FOXP3一次抗体	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/個	免疫アッセイ用FOXP3タンパク質への標的結合
ゲル迅速調製キット	上海雅美	PG212, 30セット	電気泳動用の分離ゲルおよびスタッキングゲルの迅速調製
マソン染色キット	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100錠	組織コラーゲン線維および線維症観察のための特異的染色
OVA	北京宝拓達科技有限公司	OVA-10g, ≥98%	アレルギー動物モデルの確立のための古典的アレルゲン
一次抗体希釈溶液	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	一次抗体の希釈、活性の維持、非特異的結合の減少
ラットIL-10ELISAキット	Andy Bio	E-30649, 96T	ラットIL-10抗炎症因子の定量的検出
ラットIL-4ELISAキット	Andy Bio	E-30623, 96T	ラットTh2炎症因子IL-4の定量的検出
逆転写キット	宝日医疗科技有限公司	E047-01A	RNAからcDNAへの逆転写、その後の遺伝子分析用
飽和オイルレッドOキット	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2本	組織脂滴の特定染色と検出
上扬抗ウサギ二次抗体	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	WBカラー反応用ウサギ一次抗体への結合
TBSTバッファー	武漢賽威生物科技有限公司	G2150, 1L / ボトル	ウェスタンブロットにおける膜洗浄と抗体希釈用バッファー
電泳転移システム	上海精粋精密機械有限公司	PowerPac Basic	タンパク質電気泳動とウェスタンブロット膜転移に使用
超低温冷蔵庫	中科美菱	MDF-382	試薬、タンパク質サンプル、組織の低温凍結保存
垂直電気泳動タンク	BIO-RAD	JY-ZY5	タンパク質および核酸サンプルの垂直電気泳動分離