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方法論記事

循環細胞ストレス張力システムを用いて骨格幹細胞に引張力を加える in vitro システム

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DOI：

10.3791/70570

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2026年6月12日

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

この記事について

サマリー

マウス骨骨幹細胞(SSC)はFACSによって単離され、 in vitroで培養されました。SSCsに周期的引張力力刺激を適用する制御可能な実験システムが確立され、細胞老化関連遺伝子、特に p16 および p21の発現が減少しました。

要約

骨は身体の物理的なサインに絶えず反応する主要な機械感受性器官です。機械的刺激は骨格の発達、恒常性、損傷修復において重要な役割を果たしますが、骨格幹細胞(SSC)が機械的ストレスに対してどのように応答するかは、まだ完全には解明されていません。この疑問に答えるために、マウスの骨膜SSCを単離し機械刺激を適用する in vitro モデルを構築しました。マウスのペリオステル細胞は最初、酵素による消化によって得られ、その後、確立された表面マーカーに基づく蛍光活性化細胞選別(FACS)によってSSCが分離されました。培養後、SSCは循環細胞応力-張力系を用いた引張力力刺激を受けました。このシステムは培養細胞への引張力の再現性の適用を可能にし、機械的入力に対するSSC応答の解析プラットフォームを提供します。この手法を用いると、機械刺激後に細胞老化に関連する遺伝子 p16 および p21 の発現がSSCで著しく低下していることがわかりました。これらの発見は、引張刺激が in vitro 条件下でのSSCの老化関連変化に影響を与える可能性を示唆しています。全体として、このプロトコルは機械刺激下でのSSC挙動を研究し、機械的な手がかりがSSC機能にどのように影響するかを調査するための有用かつ適切なプラットフォームを提供します。

概要

人体で最大かつ最も重要な支持器官として、骨格系は他の臓器の接着部位や保護を提供するだけでなく、運動機能の基盤としても機能します。したがって、骨格系は内部および外部環境からの様々な機械的刺激に絶えずさらされています。機械的刺激信号は骨の発達と機能維持において同様に重要です。1893年にはすでに、骨密度と骨が持つ力との間にある種の正の相関関係があると提案されており、これがウォルフの法則1です。近年、いくつかの研究では、骨2,3,4,5の正常な発達に機械的な力を担う骨格系の重要性が示されています。骨格系の機械的力への応答は、骨6の細胞構成要素に部分的に依存します。骨細胞は骨格系の細胞構成要素の85%から90%を占めています。広範囲に分布し、樹状細胞の形態が独特であるため、骨細胞は現在、機械的応答の観点から最も徹底的に研究されている骨格細胞のタイプです 7,8。骨細胞が機械的な力に反応する能力が広く認められていることに加え、骨格前駆細胞もその役割に欠かせない役割を果たしています。骨膜前駆細胞の機械的信号への応答が運命の変化を調節し、組織損傷修復に影響を与えることが判明しました。

骨格幹細胞(SSC)は自己更新能力を持つ組織特異的幹細胞の一種であり、骨の成長、維持、修復に必要な成熟した骨細胞タイプへと分化することができます。2015年にはマウスSSCの表面マーカー遺伝子が10つ同定されました。その後、複数の研究でSSCが骨の発達、恒常性維持、骨損傷修復など様々な側面で非常に重要な役割を果たすことが示されています11,12。骨格系が機械的な力に反応する特性から、機械的な力信号は骨格幹細胞の機能を調節する上で不可欠な要素と考えられます。機械的刺激下でのSSCの行動変化を研究するには、in vitroで機械的力を適用するための適切な実験システムを確立する必要があります。

細胞のin vitro機械的刺激の主な方法は、流体せん断応力、圧縮応力、引張力、静水圧、マトリックス剛性、マトリックストポロジーなどです。マウスSSCの表面マーカー遺伝子に基づき、骨折修復に関与するSSCは主に骨膜14に由来するため、フローサイトメトリーでマウス骨膜SSCを得ました。その後、周期的な細胞ストレス張力システムを通じて骨膜SSCに適切な引張力が加えられました。引張力刺激後、細胞サンプルを取得でき、トランスクリプトームシーケンシング、プロテオームシーケンシング、ATACシークエンシングなどのマルチオミクス解析が実施されます。したがって、このプロトコルの確立は、機械的刺激に対するSSC応答の研究に堅固な基盤を提供します。

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プロトコル

このプロトコルのマウス実験はすべて、中国科学院上海生化学細胞生物学研究所動物ケア・利用委員会(SIBCB-S350-2312-41)によって承認されています。

1. マウスにおける骨膜細胞の単離

  1. 生後4〜6週間のマウスをCO₂安楽死ボックスに入れ、呼吸が止まるまで3分間連続的にCO₂にさらします。
  2. マウスの体の表面を75%アルコールで消毒してください。後肢を分離するために眼科用のハサミを使ってください。その後、尖った鉗子と眼底ハサミを使い、後肢の骨格筋を除去し、大腿骨と脛骨の関節部分を保ちます。
  3. 分離した骨を冷却したPBSで保存し、骨の両端を低融点のアガロース(TAEバッファーで5〜10%)でコーティングします。
  4. 大腿骨と脛骨を、最小限の必須培地アルファ(α-MEM)で消化し、1 mg/mLのコラーゲン酵素II、2 mg/mLの分散II、0.1 mg/mL DNase Iを37°Cで30分間2回消化し、 0.3 × g を30分間2回投与します。消化された細胞を培養培地(α-MEM + 10%胎児牛血清(FBS))に採取します。
  5. 細胞懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過し、その後500× g で遠心分離して上清液を除去します。
  6. 赤血球溶解バッファーで細胞沈殿を2分間再懸浮させ、フローサイトメトリーバッファー(PBS + 2% FBS)で反応を終了させます。
  7. 細胞を500×gで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。細胞をフローサイトメトリーバッファーで10×7 mLで再懸浮させて細胞選別を行います。

2. 蛍光活性化細胞選別

  1. 細胞懸濁液に以下の抗体を染色します:PerCP/Cy5.5共役抗マウスCD45、PerCP/Cy5.5共役抗マウスCD31、PerCP/Cy5.5共役抗マウスTer119、FITC共役抗マウス6C3/Ly-51、ブリリアントバイオレット605共役抗マウスCD90.2、PE/Cy7共役抗マウスCD105、APC共役抗マウスCD200。
  2. 上記の抗体を1:500の比率で希釈し、光を遮って30分間氷で培養します。
  3. フローサイトメトリーバッファーで細胞を洗浄し、蛍光活性化細胞選別機で細胞選別を行い、CD45-CD31-Ter119-CD90.2-6C3-CD105-CD200+ SSCを得ます。選別したSSCを培養培地で採取します。取得したデータをFlowJo v10.8.1ソフトウェアで分析してください。
  4. 5%CO2 細胞インキュベーターで培養皿内の発酵培地で選別したSSCを増殖させます。機械的刺激の前に1回の通路を行うことができました。
    注:6週齢のマウス1組あたり、約1×105個の骨膜 SSCを採取可能です。

3. SSCの機械的刺激

  1. 滅菌した0.02 M酢酸でラットの尾型Iコラーゲンを希釈し、最終濃度0.15 mg/mLにします。この溶液は3回再利用可能で、4°Cで保温する必要があります。
  2. 6ウェルフレキシブルボトム培養プレートの各ウェルに希釈したラットテールI型コラーゲンを1.5mL追加します。室温で1時間コーティングした後、余分なコラーゲンを吸引し、PBSで一度洗って後で使用します。
  3. 注意:すぐに使う場合は、残留酸を取り除くためにプレートをPBSで洗い流してください。4°Cで保存する前に、蓋を外してプレートを完全に乾燥させてください。
  4. 培養マウスの骨膜SSCを消化し、500× g で5分間遠心分離し、細胞沈殿を培養培地に再懸浮させて細胞密度を1 ×5 cells/mLにします。6ウェルの軟底培養皿の各ウェルに2 mLの細胞懸濁液を加え、細胞インキュベーターに入れます。
  5. 細胞のシードから24時間後、柔軟底培養板を伸ばしたベースプレートに置き、別の軟底培養板を機械的力刺激なしの対照群として保持します。
  6. FX-6000バージョン1.0ソフトウェアのパラメータ設定は以下の通りです:ストレッチ強度8%、周波数0.1Hz、波形は方形波、波形デューティサイクル80%、伸縮持続時間は12時間。
    注:6ウェルフレキシブルボトム培養プレートを設置するための伸縮基板には4つの位置があります。実験に必要な細胞数が4未満の場合は、空いた位置を新しい6ウェルの柔軟な底培根プレートで埋めるべきです。適切な機械的刺激を加えた後、SSCは細胞分化や増殖などの機能試験を受け、複数オミクスシーケンスのためにサンプルを抽出することも可能です。

4. リアルタイム定量PCR(RT-qPCR)

  1. 細胞の機械的刺激が完了した後、培養培地を廃棄し、PBSで一度細胞を洗浄し、TRIzol試薬で全RNAを抽出し、RNA逆転写を行います。
    注:RNA抽出が完了した後は、-80°Cで保存可能です。 逆転写から得られたcDNAは、後続の検査のために-20°Cで保存することも可能です。
  2. リアルタイムPCRシステムでRT-qPCRを実施してください。使用されたプライマーセットは以下の通りです。
    HPRT:フォワード5'-GTTAAGCAGTACACCCCAAA-3',
    hprt: reverse 5'-AGGGCATATCCAACAACAACT-3',
    p16: 前方5'-GGTCACACACTGGGGATT-3',
    p16: reverse 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAAG-3',
    p21: フォワード5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3',
    p21: reverse 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'。

5. 機械的応力の短期的処理の影響

  1. FX-6000バージョン1.0ソフトウェアのパラメータ設定は以下の通りです:伸縮強度8%、周波数0.1Hz、波形は方形波、波形デューティサイクル80%。細胞は機械的緊張刺激後10分と60分にRIPA溶解バッファーI(ホスファターゼ阻害剤カクテルおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で溶解されます。
  2. Erk抗体とp-Erk抗体でウェスタンブロットを行います。

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結果

このプロトコルの実装後、マウスの骨膜SSCに対して引張力が成功裏に加えられました。まず、SSCはマウスの骨膜からフローサイトメトリーによって得られました。フローサイトメトリーの結果、骨膜におけるSSCの割合はLin-(CD45-, CD31-, Ter119-)CD90.2-6C3-(図1)の約30%を占めており、これは骨髄のそれよりもはるかに多かった。骨膜のSSCが骨の発達や骨折修復に重要な役割を果たすことを考えると、14,15。機械的刺激に反応した後の骨膜SSCの変化を十分に分析する必要があります。

機械的力刺激後に骨膜SSCで起こった変化を検出するために、一次細胞は培養通過時に細胞老化しやすいことから、細胞老化マーカー遺伝子の発現を検出

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ディスカッション

近年、骨の異なる部位から11、12、17の骨格幹細胞マーカー遺伝子が継続的に発見されています。しかし、SSCの機能の直接的な調節に関する研究は、特に機械的力刺激の調節の側面で、さらに深化が必要です。これまでのところ、骨格幹細胞/前駆細胞の機械的調節効果に関する研究は主にPiezo1ノックアウトマウスモデル9,18の構築に基づいており、機械的刺激下でSSCにどのような変化が起きたかを明らかにする直接的な証拠はまだ不足しています。サイクリックストレッチシステムは、in vitro培養細胞に対して精密で制御可能、重複可能、静的または周期的な応力変化を提供できるため、細胞に力を加える実験的プラットフォームとして非常に適しています。多くの研究が...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

中国科学院上海生化学細胞生物学研究所のフローサイトメトリーコア施設および動物コア施設に感謝いたします。この研究は中国国家自然科学基金(32471190、82502903年)および海南省外国専門家プログラム(506068033010年)の支援を受けました。

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材料

```html
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
α-MEMCorning10-022-CV骨膜細胞の分離
APC anti-mouse CD200BioLegend123809SSCのソーティング
BioFlex 6ウェル培養プレート FlexcellBF-3001A細胞培養
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317SSCのソーティング
コラーゲナーゼSigmaC0130骨膜細胞の分離
Dispase IISigmaD4693骨膜細胞の分離
DNase ISigmaDN25骨膜細胞の分離
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701SSCのソーティング
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305SSCのソーティング
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 細胞張力
フローサイトメトリーソーターBDBD FACSAria FusionSSCのソーティング
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513細胞培養
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409SSCのソーティング
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522SSCのソーティング
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132SSCのソーティング
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228SSCのソーティング
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
ラットテールタイプIコラーゲンCorning354236細胞培養
リアルタイムPCRシステムThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 赤血球溶解バッファー Beyotime C3702骨膜細胞の分離
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
ホスファターゼ阻害剤コクテールIIMCEHY-K0022ウェスターブロット
 RIPA溶解バッファーISangon BiotechNO. C500005ウェスターブロット
プロテアーゼ阻害剤コクテール MCEHY-K0010ウェスターブロット
p44/42 MAPK (Erk1/2) 抗体 Cell Signaling Technology9102ウェスターブロット
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) ウサギモノクローナル抗体Cell Signaling Technology4370ウェスターブロット
```

参考文献

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
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