ウサギの角膜創傷修復のための強化光交連ゲラチン–リボフラビンハイドロゲルの製造および外科的応用

サマリー

ウサギの角膜間質創傷修復のための現場ブルーライト交差ゲラチンリボフラビンハイドロゲルの調製、濃縮、適用に関する再現可能なプロトコルを提示し、手術的取り扱い、部分的な足蘠切除術、術後ケアの手技手順を含みます。

要約

本記事では、ウサギの角膜間質創傷修復のために、 現場 でブルーライト交差連結可能なゼラチンハイドロゲルを製造、補完、外科的に適用するためのステップバイステッププロトコルを示します。ハイドロゲル前駆体は、5%(w/v)のゼラチンと0.01%のリン酸リボフラビン(w/v)で構成され、滅菌・光保護条件下で準備され、滅菌フィルターで使用前に加熱されて注射可能な粘度を実現します。ヒト羊膜抽出物またはウサギ自己血清の任意導入も詳細に記載されています。必要に応じて、λ = 420–480 nmのブルーライトを用いて眼表面に約2分間ゲル化を誘発します。 in vivo 法は、再現可能な前間質角膜切除術(トレフィン径6.5mm、深さ約187μm)、その後ヒドロゲル充填、光活性化、部分側側足根形成術を含み、治療の安定化、創傷治癒促進、術後ケアの標準化を図ります。代表的な in vitro アウトカムでは、ゲル様粘弾性挙動、せん断薄化と迅速な回復、500nm以上で高い光透過率(>90%)が認められ、角膜使用に適していることが示されています。 in vivoでは、ハイドロゲルを用いた治療が進行性上皮閉鎖、良好な眼球耐性(3日および7日で低いDraiズスコア)、および生分解および組織置換に一致する時間依存的なヒドロゲルの減少を支持します。再現性を確保するために重要なステップや一時停止点を強調し、溶解およびろ過時の温度制御、光からの保護、架橋時のランプ位置調整などを強調します。このプロトコルは、縫合なしで正確に配置された光活性ハイドロゲル安定化を可能にし、複数のバイオアクティブサプリメントの追加と互換性があります。次世代眼科バイオマテリアルの前臨床評価のための実用的なプラットフォームを提供し、角膜創傷修復のための光交差可能なハイドロゲル療法の翻訳を促進します。

概要

角膜は透明で無血管構造であり、眼の屈折力の約3分の2を占めるため、その構造的・機能的な完全性は視力に不可欠です^。外部環境に直接曝露されるため、角膜は外傷、感染、化学的損傷、術後の合併症に非常に脆弱です^2,3。上皮の完全性を迅速かつ効果的に回復できないと、持続的な上皮欠損(PEDs)や慢性的な角膜潰瘍を引き起こし、最終的には気質の溶融、穿孔、瘢痕、そして不可逆的な視^力喪失に至る可能性があります^4,5。従来の治療法(潤滑剤、抗生物質予防、自己血清点眼薬など)は、中等度から重度の欠損において間質修復を十分に促進せず、部分的な利益しかもたらさないことが多く、^6,7,8。

これらの制限に対処するため、創傷の保護、上皮修復の支援、間^質組織の回復が可能であるため、バイオマテリアルベースの治療法が有望な代替手段として浮上^{しています。ハイ}ドロゲルは生体適合性、光学的透明性、調整可能な機械的挙動、治療薬の組み込み能力から特に魅力的です。ゼラチン^15,16,17、コラーゲン^18,19、キトサン^20,21、ポリエチレングリコール(PEG)^22,23、ヒアルロン酸^18,24などの天然および合成ハイドロゲルは、角膜創傷の治癒促進に潜在的であることが示されています。これらの中でも、ゼラチン系ハイドロゲルはコラーゲン由来の組成と細胞接着モチーフを持つため特に価値があります。

光交連型ハイドロゲルは、眼表面に直接必要に応じて固化できるという追加の利点を持ち、縫合なしで正確な配置と機械的安定性の向上を可能にします。リボフラビン介在の架橋は、もともと円錐角膜治療のために開発されましたが、優れた生体適合性、眼科安全性、可視光または紫外線下での架橋誘導活性酸素種を生成する能力により、最近はハイドロゲル光高重合に適応されています^25,26。青色光(≈445 nm)は角膜用途に特に優れており、効率的な架橋を可能にしつつUV関連リスクを回避できます^27,28,29。

本記事では、5%(w/v)ゼラチンおよび0.01%(w/v)リボフラビンリン酸(RFP)からなる光交差可能なハイドロゲルの製造、濃縮、外科的応用を紹介します。in vitroハイドロゲル製剤の詳細なプロトコルを提供しており、ヒト羊膜抽出物(HAMe)または自己血清(AS)の任意導入、ならびにウサギ間質角化切除モデルでのin vivo適用も含まれます。HAMeは眼表面に対して抗炎症、抗線維化、再生促進効果を発揮することが知られており30,31,32,33,34,35であり、自己血清は上皮再生に不可欠なビタミンA、EGF、フィブロネクチンなどの成長因子を涙のような濃度で提供します(36,37,38)。これらの要素は共に再上皮化を支援し、炎症を軽減し、間質分解を防ぐ可能性があります^。39,40。

このアプローチは制御された光重合とカスタマイズ可能な生体活性を提供しますが、現在は表層および間質中間欠損に限定され、青色光への視線下での曝露が必要であり、不透明または深く浸潤した組織での使用が制限される可能性があります。ハイドロゲルの調製と濃縮、眼科での取り扱い、部分的な側方足腱形成を含む術後ケアを統合することで、本論文は角膜修復を支援し、光活性ハイドロゲル技術の臨床実践への応用を促進し、角膜再生研究のための標準化されたプラットフォームの開発に寄与する再現性のあるアプローチを提供します。

プロトコル

ヒト胎盤は、ヘルシンキ宣言に従い、クルセス大学病院倫理委員会(承認番号 CEIC E15/03)の承認を得て、ドナーから十分な同意のもと取得されました。すべての動物実験はバスク大学動物研究倫理委員会(UPV/EHU)(承認番号 CEEA M20/2023/038)により承認され、眼科および視覚研究における動物利用に関するARVO声明に準拠しています。すべての処置はUPV/EHU動物施設(SGIker)で行われ、全期間無菌技術を維持しました(生物製剤の取り扱いはクラスIIのバイオセーフティキャビネット)。

1. ハイドロゲル合成

1. ゼラチン–リボフラビン前駆体溶液(5%および10% w/v)
   注意:薄暗い照明下で作業するか、溶液を光から保護するために琥珀色のボトルやアルミホイルで包んだ瓶を使用してください。生物用途を目的としたハイドロゲルの場合は、層流フード内の無菌条件下ですべての工程を行ってください。
   1. 必要なゼラチンとリボフラビンリン酸(RFP)の量を計量します:5%(w/v)+ 0.01%(w/v)RFP前駆体10 mLの場合、ゼラチン500 mgとRFP 1 mgの重量です。10%(w/v)+0.02%(w/v)RFPストック30 mLの場合、ゼラチン3gとRFP6 mgの重量です。
   2. ゼラチンとRFPを、対応する脱イオン水の体積(最終体積の≈90%)に加えます。粉末が完全に分散するまで優しくかき混ぜます。
   3. 1 M NaOHを用いてpHを7.0に調整し、塩基をドロップごとに加えつつpHを監視します。使用されたNaOHの体積と最終調整された体積を記録します。pH調整後、溶液を脱イオン水で最終体積まで持ち込みます。
   4. 溶液を溶かし均質化し、80°Cで磁気攪拌を200rpmで30分間行います。
      注意:高温の溶液(>70–80°C)には耐熱手袋を着用してください。
   5. 溶液を30〜40°Cまで冷却し、0.22μmのポリエーテルスルホン(PES)親水性膜フィルターで無菌琥珀のボトルに濾過します。
      注意:必要に応じてろ過前に粘性溶液を温め(≈ 40〜50°C)、過熱を避けること。
   6. ボトルには組成、日付、オペレーターのイニシャルをラベル付けしてください。ろ過済みのハイドロゲル溶液は使用まで4°Cで保存し、保存期間は準備から2週間を超えないようにしてください。
2. 補充ゼラチンハイドロゲル(最終容量:10 mL)
   1. 第4節および第5節に記載された手順に従い、自己血清(AS)またはヒト羊膜抽出物(HAMe)を準備してください。抽出物は使用まで滅菌・冷蔵保存してください。
   2. 濃縮ハイドロゲル10mLごとに、10%(w/v)ゼラチン+0.02%(w/v)RFPストックを5mL、対応する生物抽出物(ASまたはHAMe)を5mL混ぜます。
      注意:必要に応じてろ過前に粘性溶液を温め(≈ 40〜50°C)、過熱を避けること。
   3. 温かい溶液を0.22μmのPES親水性膜フィルターで無菌琥珀色のボトルに濾過します。
   4. 使用まで4°Cでラベルを貼り保存してください。保存期間は準備から2週間を超えないようにしてください。
      注意:すべての廃棄物は機関のバイオセーフティ規則に従って処分してください。

2. in vitroでのハイドロゲル応用

1. 第1節で説明したハイドロゲル製剤を準備し、適切な粘度を維持するために塗布前に32°Cに保ってください。
2. 滅菌技術を用いて、ターゲットウェル、型、皿、基板に必要な量のハイドロゲルをピペットで注入します(図1A)。
3. LED-C硬化ランプをハイドロゲル表面の2cm上に位置させます。ハイドロゲルを青色光(λ=420–480 nm)と850-1000 mW/^cm²の光出力で照射し、合計2分間の間、現場架橋を開始します。照射を20秒の6パルスで照射し、パルス間に5〜10秒の休憩を入れて局所加熱を防ぎます(図1B)。
4. 完全なゲル化を目で確認し、無菌器具で表面に優しく触れて、固体で操作可能なハイドロゲルの形成を確実にします(図1C,D)。
5. 架橋ハイドロゲルは直ちに使用するか、下流の施布に適した滅菌条件下で4°Cで保存してください。
   注意:処置中は無菌技術を維持してください。皮膚や目をブルーライト照射に直接浴びないようにしてください。

3. ヒト羊膜(HAM)の取得

注意:胎盤は、インフォームドコンセントを提供し、機関および倫理要件を満たしている血清陰性ドナーの胎盤のみを使用してください。

1. ドナーの適格性と同意
   1. 各ドナーがHIVタイプ1および2、B型およびC型肝炎、梅毒のスクリーニングと陰性検査を受けていることを確認しましょう。
   2. 手術前に各ドナーから書面によるインフォームドコンセントを取得してください。
   3. 健康なドナーの選択的帝王切開後、すぐにヒト胎盤を取得してください。
2. 収集と初期処理
   1. 出産直後に各胎盤を無菌のステンレス容器に入れて採取してください。
   2. 手術室では、胎盤を無菌生理食塩水でしっかり洗い流し、血栓を除去します。羊膜(羊膜腔内側の最も内側の透明な膜)を特定し、無菌鉗子を使って胎盤の縁に向かって優しく剥がして絨毛膜から慎重に分離します。
      注意:膜は破れないように慎重に扱ってください。
   3. 完全に分離後、無菌のニトロセルロースフィルターをHAM間質面に取り付け、操作を容易にし、分割を標準化します。HAMを3つの定義された領域に分けます(図2A,B):遠位羊膜:幅10cm、内側羊膜:幅10cm、近位羊膜:胎盤縁まで延びる部分。
3. 交通
   1. 各HAM断片を滅菌ボトルに入れ、1.25 μg/mLのアンフォテリシンB、50 μg/mLのペニシリン・ストレプトマイシン、50 μg/mLのネオマイシンを添加したDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に浸します。
   2. 各ボトルにはドナーコード、日付、産地(遠位、内側、近位)を明確にラベル付けしてください。
   3. サンプルは清潔かつ無菌の冷蔵条件下(4°C)で直ちに実験室へ運ばれます。
      注意:膜は、国連3373(生物物質、カテゴリーB)に準拠した密封された三重包装で輸送し、ヒト組織を規制する機関のバイオセーフティ規制に従ってください。
4. 実験室での処理
   注意:以降のすべての工程はクラスIIの生物学的安全キャビネットで無菌条件下で行ってください。
   1. 各遠位、内側、近位のHAM断片を、滅菌ハサミで4.0〜4.5〜4.5cm×4.0〜4.5cmの正方形に切断します。
   2. 先に述べた抗生物質補充のDMEMに断片を浸し、滅菌クランプで優しくブラッシングして血液残留物を除去します。50 μg/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEMで2×5分間洗浄します。
   3. 抗生物質なしでDMEMで2回×5分洗います。
   4. これらの選定された断片を無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
   5. 各断片を培養培地なしで5mLの滅菌チューブに移します。サンプルを直接-80°Cで凍結し、使用後に続けます。

4. ヒト羊膜抽出物(HAMe)製剤

注意:タンパク質の分解と汚染を最小限に抑えるため、すべての工程は無菌かつ寒冷な条件下で行ってください。

1. −80°Cで保存されたヒト羊膜(HAM)断片を含むチューブを回収します。組織を硬化させるために液体窒素に5分間浸します。
2. 各冷凍破片を予め冷却した乳鉢(−80°C)に移し、乳棒でしっかりと砕き、柔らかく均一な粉末になるまで徹底的に砕きます。
3. 粉末状サンプルはすぐにバランスプレートで計量し、解凍を最小限に抑えます。重量した粉末を5mLのチューブに移し、3mLのPBSに5μL/mgのプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充して再懸濁します。
   注意:タンパク質の完全性を保つため、処理中はすべてのチューブを氷に保管してください。
4. ソニックケーターと直径1.5mmのプローブを使い、90%振幅で各サンプルを20分間ソニックテージし、過熱を防ぐために15秒のオン/15秒のオフサイクルを適用します。
5. 溶合液を3,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。ペレットを乱さずに上澄液を慎重に回収します。
6. 上清液を0.22μmのPES親水性膜フィルターで無菌条件下でろ過します。ろ過したHAMeを0.2 mLのマイクロチューブに分割します。使用後は−80°Cで保存します。
   注意:保管期間は準備日から6か月を超えないようにしてください。

5. ウサギから血液由来の自己血清の抽出

注意:ニュージーランドのホワイトラビット(≈2 kg)における 生体内 検査のすべての手順は、該当機関の動物研究倫理委員会の承認を得て、機関ガイドラインに準拠して実施してください。

1. 静脈穿刺部位でリドカイン(局所または皮下投与)を局所麻酔します。
2. 中央耳動脈から血液を4.5mLの採血管に集め、ポリマーゲルセパレーターを含みます(図3A,B)。血液を刺激せずにRTで2時間凝固させます(図3C)。
3. サンプルを1,000 × g で15分間RTで遠心分離します。上澄液(血清)を採取し、これがウサギの自己血清(AS)を構成します(図3D)。
4. 血清を0.22μmのPES親水性膜フィルターでろ過します。滅菌の0.2 mLチューブに分割し、−80°Cで保存して使用します。
   注意:保管期間は準備日から6か月を超えないようにしてください。

6. 生体内 外科手術

注意:すべての実験手順は該当機関の動物研究倫理委員会に従い、ヘルシンキ宣言および眼科・視覚研究における動物利用に関するARVO声明の原則を遵守してください。

1. 術前準備
   注意:動物モデルにはニュージーランド産ホワイトラビット(≈2kg)を用いてください。
   1. 手術前に、動物の太ももに筋肉内注射による全身麻酔を投与します。投与量はケタミン1 mL/kg(50 mg/mL)、キシラジンは0.3 mL/kg(20 mg/mL)です。角膜反射と足反射がなくなったことを確認してから進行してください。
   2. 動物を無菌手術台に横方デ キュビトゥス 姿勢で置き、周囲眼をポビドンヨウ素溶液で消毒します。手術中に眼表面の連続露出を維持するために、まぶたのスペキュラムを手術眼に装着します。
2. 前間質角質切除術
   1. ウサギ角膜に直径6.5mmの真空レフィンを中心に設置します(図4A)。吸引をかけて装置を安定させ、トレフィンを3/4回転させて約187μmの間質深さを達成します。
   2. 三日月型の刃を用いて、頭蓋骨部内で前部間質角質切除術を行い、上皮層と前部間質層を除去して滑らかな創傷床を得ます(図4B)。
3. 生体内 ハイドロゲルの応用
   1. 角膜欠損部に対応するハイドロゲル製剤50μLを充填し、最適な粘度を確保するために32°Cまで予熱します(図4C)。
   2. 角膜表面を青色光(λ=420–480 nm)で2分間照らすことで 、その場架 橋を開始します。局所加熱を制限するために、20秒間隔を5〜10秒の間隔で6回照射します(図4D)。
4. 側側部分跗骨
   1. 上まぶたと下まぶたの鼻縁の3分の1を特定し、観察と治療のために内側からの露出を可能にします。
   2. 最初の縫合糸を挿入します(まぶたの長さや安定性に応じて1〜2針の縫合糸を使用)(図4E)。
      1. 鉗子で外側の上まぶた縁を掴みます。皮膚側から結膜側へと、灰色の線/まぶたの縁を通し、可能であれば足根骨への深い挿入は避けつつ、全厚の噛みつきをします。
      2. 結膜側から皮膚側にかけて、下まぶたの縁の対応する点を針で通し、まぶたの縁の付け合わせを作ります。
      3. 縫合糸はしっかりとした外科医の結び目と2つの四角い結び目で結び、結び目はまぶたの縁の外側にやや寄った位置に置き、まぶたの縁の上に直接置かないようにします。
      4. 追加の安定性が必要な場合は、同じ全厚U字型縫合糸または単純な中断縫いを使い、最初の縫合糸の内側に約3〜4mmの位置に2本目の縫合糸を挿入します。
      5. 縫合糸の尾は3〜4mmに切り詰めて刺激を減らし、後で除去できる長さを残します。
      6. まぶたの付け合わせが治療された角膜を保護するかを確認しつつ、内側および側頭の結膜/角膜へのアクセスを可能にして検査や点眼薬を投与します。足根が過度に締まっていないこと、そして動物のまぶたが虚血性でないことを確認しましょう(図4F)。
5. 術後のモニタリングとケア
   1. ケラテクトミー前に皮下注射で0.05 mg/kgのブプレノルフィンを投与し、12時間ごとに72時間にわたり鎮痛効果を提供します。
   2. 感染を防ぐために、創傷が完全に閉じるまで1日2回、3 mg/mLのトブラマイシン点眼薬を点滴してください。
   3. 角膜の水分補給を維持するために、0.2%ヒアルロン酸(HA)人工涙液を1日4回、すべての目(対照群を含む)に1滴塗布してください。
   4. 縫合糸の緩み、感染、局所組織壊死、過度な緊張の兆候がないか、少なくとも1日2回は足根骨を点検してください。動物の行動、摂食、眼の不快感の兆候を観察してください。
   5. 処置後72時間で縫合結び目を切り、鉗子で各縫合糸を優しく引き抜き、結膜表面に汚染物質が引きずらないように注意してください。
   6. まぶたの縁を適切な治癒状態と角膜表面の上皮の完全性を確認する。上皮の完全な閉鎖が観察されるまで必要に応じて眼治療を継続する。
   7. 3日目から7日目までの眼の治癒および臨床症状を監視・記録し、スリットランプ顕微鏡と蛍光染色を用いて上皮閉鎖、不透明度、新生血管形成を評価します。
      注意:虚血、傷口の裂傷、または重度の刺激の兆候が見られた場合は、直ちに縫合糸を外し、適切に管理してください。
6. 急性眼の刺激評価
   1. タオルや毛布のラップで優しくウサギを拘束します。まず白光の下で虹彩と結膜を調べます。
   2. 結膜の赤み、化学性(浮腫)、分泌物をドレイズ尺度で評価します( 表1 および 表2参照)。
   3. データシートに6つのDraizeパラメータすべてを記録します。成分スコアの合計として眼刺激指数(OII)を計算します。OIIは0から110の範囲で、値が高いほど刺激が強いことを示します。
   4. OIIに基づくKay–Calandraカテゴリに従って各目を分類し、データセットにカテゴリを記録します。
7. 創傷治癒の写真記録
   1. 下結膜にフルオレセイン溶液(5 μL)を注入します。
   2. ブルーライトで目を照らし、角膜の不透明度(密度と面積)と蛍光染色の程度を評価します。
   3. 手動ホワイトバランス調整、光学ズーム無効にしてカメラをセットし、目から約3cmの位置に位置して、セッションごとに同じパラメータですべての画像を撮影します。蛍光照射後、ブルーライト照射の有無にかかわらず、上皮欠損を明らかにする画像を撮影します。0日目(足根骨摘出前)および3日目(跗骨摘出後)から完全に上皮閉合するまで毎日撮影します。
   4. ImageJソフトウェアで画像を解析し、蛍光染色領域の面積を定量化します。
      注:部分的な足骨形成のため、1日目と2日目の写真記録は通常不可能です。1日目と2日目の画像がデータセットに欠落していることを示し、副作用(例:偶発的な角膜擦過)を報告してください。
8. 安楽死と組織採取
   1. 21日目(両眼の評価期間後)に、ケタミン(2 mL/kg)およびキシラジン(0.6 mL/kg)を筋肉内投与して動物に深く麻酔をかけます。
   2. 中耳辺静脈に10 mLの飽和塩化カリウム(KCl)を静脈内注射して安楽死させてください。
   3. 死後硬直の発生と生命反射の欠如による死亡を確認し、その後組織採取に進む。

結果

ハイドロゲル合成と特性評価
ハイドロゲルは合成され、光架橋の前後でそのレオ学的および光学的特性を評価するためにin vitro で評価されました。せん断レオロジーを用いて粘弾性、降伏率、流動挙動を特徴づけました。周波数スイープでは、テストされたすべての周波数でG′がG"よりも高く保たれ、固体様の挙動を示しました(図5A)。10ラッド・s⁻^¹ での振幅スイープでは、広範な線状粘弾性領域(~100%ひずみ)が明らかになり、保存率(G′)が損失弾性率(G")を一貫して上回り、ゲル状構造を示しました(図5B)。ブルーライト架橋前に行われたフロースイープではせん断薄化が示され、せん断速度が10^⁻4 から100s⁻¹に増加するにつれて粘度が著しく低下し、注入条件を模擬しました(図5C...

ディスカッション

本プロトコルは、角膜創傷治癒のための光交差可能なゼラチン–リボフラビン水素ゲルの調製、充填、適用のための再現可能なワークフローを提供します。一貫したゲル品質を達成するためには、いくつかの in vitro ステップが重要であり、変動の最も頻繁な原因であるため強調が必要です。まず、攪拌中に前駆体溶液を80°Cで維持することで、ゼラチンおよびリボフラビンリン酸の完全な溶解を確実にし、光学的透明度や架橋均一性を損なう粒子状集合体を防ぎます。滅菌ろ過前に、完全な流動性を確保するために製剤を40°Cまで再加熱する必要があります。低温でのろ過は通過不完全や汚染リスクの増加を引き起こすためです。準備後、ハイドロゲルは4°Cで光から保護し、使用直前に32°Cまで温めるべきです。この時点で半固体でありながらピプティング可能であり、in vitro および in vivo での漏れを防ぎます。実際には、これらの温度ベンチマークのいずれの故障も、濁ったゲル、フィルターの詰まり、不均一な光硬化、または適用部位での拡散として最もよく現れます。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アムホテリシンB	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15290018	最終濃度： 1.25 ＆mu;g/mL
ウサギ自己血清(AS)	自家製	-	全血から調製; 0.22 ＆mu;m PESを通してろ過
ブルーLED硬化ランプ	Woodpecker Medical Instrument Co	LED.C モデル	波長： ＆lambda;=420＆ndash;480 nm; 距離： 1＆ndash;2 cm; 光出力：850-1000 mW/cm2
ブプレノルフィン(ブプレケア)	Ecuphar	578950	用量： 0.05 mg/kg、皮下注射で12 h毎に 72 h
カメラ	Panasonic	LUMIX TZ35	ライカ光学を搭載したカメラ
Cimarecデジタル攪拌ホットプレート	Thermo Fisher Scientific	SP131320-33	220-240 V、最大温度：540 °C
クレセントマイクロサージカルブレード	BVI Medical	373807	-
DMEM(Dulbeccoの改変Eagle培養液)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11966025	-
エッペンドルフチューブ(0.2 mL)	Merck KGaA	30124707	HAMe準備のために冷蔵で保管; アライオティング
エッペンドルフチューブ(5 mL)	Merck KGaA	30119606	HAMe準備のために冷蔵で保管; アライオティング
フルオレセイン溶液	Novartis	Colorcusi Fluotest	2％フルオレセイン溶液、5 ＆micro;l点眼薬
Gibcoネオマイシン	Merck KGaA	N1142	最終濃度： 50 ＆mu;g/mL
ゼラチン粉末	Sigma Aldrich	G1890	80 °Cで溶解; pHを7.0に調整
ヒアルロン酸人工涙液(0.2％)	Chem.-pharm. Fabrik GmbH	Hylo-Tear	-
ImageJ画像処理ソフトウェア	National Institute of Mental Health	-	Wayne Rasbandによって研究サービス部門で開発
ケタミン(ケトラール)	Pfizer	631028.1
リドカイン	Vet One	NDC 13985-222-04	局所または皮下注射
ペニシリン＆ndash;ストレプトマイシン	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15140-122	最終濃度： 50 ＆mu;g/mL
PESシリンジフィルター、 0.22＆thinsp;＆mu;m0.22＆mu;m (Millex)	Merck KGaA	SLGP033RS	-
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma Aldrich	P4417-100TAB	-
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma Aldrich	P8340	5 ＆mu;L per mg 組織に追加
ポビドンヨード溶液	Meda pharma	7167204	術前消毒
リボフラビンリン酸(RFP)	Sigma Aldrich	R0630000	濃度： 0.01％ w/v (最終); 0.02％ w/v (ストック)
ソニケーター	Bandelein electronic	Sonoplus GM mini20	-
ソニケータープローブ	Bandelein electronic	MS 1.5	1.5 mm径、63 mm長のプローブ。
タルソラフィ縫合糸(非吸収性)	Alcon	8065308001	必要に応じて1–2縫合
トブラマイシン点眼薬(3 mg/mL)	Novartis	Tobrex	投与：閉鎖まで2回/日
ヘスバーグ・バロントレパン、6.5 mm径	Jedmed	21-8265	-
ポリマーゲルセパレータ付きバキュータナー血液採取管	BD (Becton, Dickinson and Company)	367704	-
キシラジン溶液	Laboratorios Calier SA	Xylagesic	用量： 5 mg/kg 筋肉内注射