方法論記事

ツメガエル初期胚発生における新生転写体の代謝標識

DOI：

10.3791/70591

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2026年3月27日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

この記事について

サマリー

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5-エチニルウリジン(5-EU)を用いて、ツ メガエル 初期胚のトランスクリプトーム解析のために新生転写産物を代謝的に標識・精製する方法を詳細に提供します。

要約

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早期胚発生には、受精後に休眠状態だった接合子ゲノムから接合遺伝子の新たな転写が必要です。大きな課題は、新しい転写本を正確に検出し、接合ゲノム活性化(ZGA)中の発現時期を特定することでした。ここでは、初期の ゼノメガ エル胚における5-エチニルウリジン(5-EU)による新生転写物の代謝標識の詳細な手順を提供します。受精後、5-EUを1細胞期胚に微量注射し、ZGA中に新たに転写されたRNAを代謝的に標識します。新生EU-RNAは、クリック化学介在反応によるビオチニル化後に精製され、次世代シーケンシングを用いて新生トランスクリプトームが決定されます。重要なのは、この手法が高く高感度かつ特異性が高く、低活性化遺伝子の特性解析が可能である点です。したがって、このアプローチは初期発生中の遺伝子転写の動態を研究する強力なツールを提供し、他の胚システムや組織にも一般化可能です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

受精後、胚は卵子内に蓄積された母体因子の制御下にあり、接合ゲノムは一定期間転写的に沈黙します。細胞運命の指定や胚層形成1,2,3,4,5,6を含む数百から数千の遺伝子を転写するために活性化されます。母体から接合体への移行期(MZT)における接合ゲノム活性化(ZGA)現象は、すべての多細胞動物種で高度に保存されていますが、ZGAの発生タイミングは種1、2、3、4、5、6によって異なります。ZGAの調節方法を理解することは、早期発達の基本原理を理解する上で重要であるだけでなく、発達障害の診断・治療や生殖健康の向上のための新しい戦略の開発にもつながります。

ZGA研究の大きな課題は、新しい転写産物を正確に検出し、接合ゲノム活性化(ZGA)におけるその開始時期を特定することでした。初期胚7では母体転写が優勢であるため、これらの転写産物の高レベルがZGA中に新しい転写産物の検出を隠し、特に活性化度の低い遺伝子では従来のバルクRNA-seqを用いて検出されることがあります。この課題を克服するため、私たちは新生トランスクリプトームを5-エチニルウリジン(5-EU)で代謝標識し、続いてクリックケミストリーによる新生EU-RNAのビオチニル化とシーケンシングのために精製する方法を開発しました8,9,10。4-チオリジン(4sU)11,12など他の新興転写プロファイリング法と比べて、5-EU標識はクリック化学による非常に特異的であり、イメージングとシーケンスの両方に利用可能で、化学的変換を必要としません。さらに、新興のEU-RNA-seqは非常に感度が高く、数百の遺伝子を検出します。これらの遺伝子の活性化は従来のバルクRNA-seq8では検出できません。このアプローチにより、個々の接合遺伝子活性化の開始を正確に特定し、初期胚発生8期におけるZGAの独特な時空パターンをプロファイリングすることも可能となりました。

ここでは、Xenopus laevisの初期胚をモデルに用いて、EU-RNA-seqのサンプルを準備し、新生トランスクリプトームをプロファイリングするための詳細な手順について説明します。このプロトコルは、以前の手法10,13を基に、5-EUを1細胞期胚に微量注射し、クリック反応による新生EU-RNAのビオチニル化、シーケンスのための精製など、手順に若干の最適化を加えています(図1)。再現性を確保するために、初期胚の段階ごとに新生転写産物の量が異なる場合、総RNAの1〜10 μgを入力として使用すべきですが、より少な量でも使用可能です。このプロトコルはショウジョウバエ14やゼブラフィッシュ15など他の胚系や、他の組織13にも適用可能です。この方法は、遺伝子転写や様々な生物学的プロセスにおける調節機構の理解に強力なツールであり、初期胚発生の新しい原理を明らかにすることにもつながります。

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プロトコル

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本研究で記述された動物実験は、サウスカロライナ大学の動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されています。実験室の安全性および廃棄物処理は、機関の規則を遵守すべきです。

1. 試薬およびバッファーの調製

  1. 20倍MMR(マークの改良リンガー)溶液:100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl2、40 mM CaCl2を混合します。NaOHでpHを7.8に調整してください。オートクレーブして常温で保存します。
  2. 3% フィコル(w/v)/0.5x MMR:磁気攪拌棒で優しくかき混ぜながら、フィコル400を50mLの0.5倍MMRにゆっくり加え、フィコルが完全に溶けるまで加えます。オートクレーブ処理し、使用まで4°Cで保温します。
  3. 5-エチニルウリジン(5-EU)ストック溶液:50 mMのストック溶液を作るには、372.8 μLのバッファー(マイクロインジェクション対応のバッファーなら1倍TBS、pH 7.6など)を5 mgバイアルに加えます。よく混ぜて2μLのアリコートを作ります。-80°Cで保存します。

2. 5-EUを1細胞胚に微量注射

  1. ツメガエルの胚を入手するには、標準的なプロトコルに従って体外受精(IVF)を行う必要があります(例:Siveら、2007年参照)16。胚は0.1倍のMMRで、使用準備が整っているはずです。
  2. 標準のガラススライド(25mm x 75mm)から作ったマイクロインジェクションチャンバーに3%フィコル/0.5x MMRを1mL加えます。プラスチックのトランスファーピペットを使って、20個(必要に応じてそれ以上)の胚をマイクロインジェクションチャンバーの中央に移植します。
  3. 細いピンセットでガラス針の非常に細い先端を慎重に切り、針を垂直に(先端が下向きに)ベンチの壁のモデリングクレイに当てます。P2ピペットにマイクロローダーチップを使い、ガラス針の上部から50 mM 5-EUを0.5 μL加えます。
  4. 針をマイクロマニピュレーターに組み立てます。P10ピペットを使ってステージマイクロメーターに10μLのハロカーボンオイルを加え、立体顕微鏡で観察します。
  5. 注入量を校正するには、まず足でパッドをマイクロインジェクターに連結した床に押し込み、マイクロメーターのハロカーボンオイルに液滴を注入します。液滴の大きさに応じて、マイクロインジェクターの圧力と注入時間を調整し、注入容積を10 nL、すなわちマイクロメートル上で直径0.27 mmとします。
  6. 片手にピンセットで胚を保持し、もう一方の手でマイクロマニピュレーターを持ち、1細胞段階の胚に50 mM EUを10 nL注入します。胚内の5-EUの最終濃度は~0.5 mMです。
  7. マイクロインジェインス後、プラスチックトランスファーピペットを使い、胚を注入チャンバーから3%フィコル/0.5倍MMRを含む新しいガラス皿に移します。注射した胚はフィコルで~1時間保管してください。
  8. 慎重にフィコル溶液を取り除き、ミディウムを0.1倍のMMRに置き換えてください。胚は0.1倍のMMRで使用し続けてください。胚の発育を常に監視し、必要に応じて異常胚を摘出してください。
  9. 胚が望ましい発育段階に達したら、プラスチックのトランスファーピペットを使って10個の胚を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移植します。P200ピペットを使ってチューブ内の残留培地を慎重に除去し、胚を液体窒素でスナップ冷凍します。
    注:厳密性と再現性を確保するために、外見から正常な胚のみを採取してください。対照群と比較して。異常な胚は除去し、さらなる解析から除外してください。必要に応じて、マイクロインスインプなしでネガティブコントロールと同じ数の胚を採取してください。
  10. 胚は-80°Cの冷凍庫で保存し、使用まで待ってください。

3. 総RNA抽出および濃度測定

注意:初期胚から総RNAを分離するにはシリカ膜ベースの全RNA抽出キットを使用し、RNAの濃度を決定するには蛍光ベースの高感度RNA定量キットを使用してください。キットの説明に従ってください。以下の手順はマニュアルから少し修正されています。以下の工程で使用されるすべての溶液および試薬はRNaseフリーであるべきです。

  1. -80°Cの冷凍庫からサンプルを氷に入れます。
  2. 各チューブにRNA抽出キットからバッファーRLTを700μL追加します。P1000ピペットを使って、少なくとも15回、またはすべての胚が溶けるまで上下にピペットを動かします。
  3. サンプルは20分間氷で保管してください。胚を完全に均質化するために、ピペットで上下に少なくとも10回優しく混ぜます。
  4. 均質化された胚に70%エタノール700μLを加えます。ピペットを上下に動かしてよく混ぜ、700μLの混合物をスピンカラムに移します。
  5. カラムを10,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーは捨てましょう。残りの混合物が完成するまで遠心分離機を繰り返します。
  6. バッファーRW1を350μL加え、10,000 x g でカラムを1分間遠心分離します。フロースルーは捨てましょう。
  7. カラムの膜の中心に80μLのDNase Iを慎重に添加します。室温で15分間孵化します。
  8. バッファーRW1を350μL加え、10,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーは捨てましょう。
  9. バッファーRPEを500μL加え、10,000 x g でカラムを1分間遠心分離します。フロースルーは捨てましょう。もう一度洗濯を繰り返してください。
  10. カラムを10,000 x g で再度遠心分離して2分間乾燥させます。
  11. カラムを新しいRNaseフリーチューブに移します。カラムの膜の中心にRNaseフリーH2Oを慎重に35 μL加えます。
  12. カラムを10,000 x g で1分間遠心分離します。溶出したRNAを採取し、冷やしておきましょう。
  13. RNA濃度を測定するには、まずRNA定量キットを用いてRNAバッファー内でRNA試薬(染料)を1:200で希釈して作動溶液を準備します。標準基準の総数に応じて作業溶液の総体積を計算し、各標準または試料ごとに200μLを準備します。
  14. 0.2mLの8チューブストリップを設置します。各標準を希釈するには、作動溶液の190μLに10μLを加えます。各試料を希釈するには、作業溶液の1 μLに1 μLを加えます。よく混ぜて。
  15. 8本管のストリップを蛍光計に入れてください。RNAアッセイを選択し、標準基準で較正し、サンプルの濃度を読み取ります。

4. EU-RNAビオチニル化と精製の初期段階

注:クリック化学ベースの新生RNAキャプチャキットを用いて、新生EU-RNAをビオチニル化し、引き出します。キットの指示に従って、以下の手順を少し修正します。注射されていない胚からのRNAや、ビオチニル化を伴わないEU-RNAは、プルダウン特異性の背景対照として利用可能です。

  1. RNAビオチニル化とクリーニング
    1. 各サンプルごとに、1.5 mLのマイクロ遠心分離管で以下の成分を混合し、50 μLクリック反応を起こします:総RNA(1–10 μg)、EUバッファー1個、2 mM CuSO4、0.25 mM ビオチンアジド、10 mM 添加物1、および12 mM添加物2。
    2. 反応混合物を室温でナテーターで30分間孵化します。
    3. 上記の各反応に、グリコーゲン1μL、7.5M酢酸アンモニウム50μL、冷却100%エタノール700μLを加えます。ピペットを上下に5回してよく混ぜます。
    4. チューブを-80°Cの冷凍庫に入れて一晩保管します。
    5. チューブを13,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 ペレットを乱さずに上澄液を慎重に取り除きます。
    6. 75%エタノールを700μL加え、優しく混ぜてペレットを再懸浮させます。チューブを13,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットを乱さずに上澄液を慎重に取り除きます。もう一度洗濯を繰り返してください。
    7. ペレットは室温で5〜10分自然乾燥させます。ペレットを10 μLのRNaseフリーH2Oに再懸浮させます。
  2. EU-RNA精製
    1. 新生のEU-RNAを引き出すために、各サンプルごとにストレプタビジン被覆磁気ビーズ5μLを新しい1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブに投与します。
    2. ウォッシュバッファー2を9μL追加します。よく混ぜて、チューブを磁気ラックに置きます。2分間そのまま置いてください。上清液を取り除きます。洗濯をさらに2回繰り返します。ビーズを5μLのウォッシュバッファー2に再懸浮させます。
    3. 新しい1.5 mLマイクロ遠心分離管(各サンプル15 μL)で以下のマスターミックスを準備します:RNA結合バッファー(成分G)12.5 μL、希釈した1:10 RNase OUT 0.2 μL、RNaseフリーH2O2 O2.3 μL。RNAサンプルを含む各チューブに15 μLのミックスを加えます。
    4. 69°Cのヒートブロックで5分間培養します。 チューブを氷にしておけ。
    5. 上記の洗浄済みビーズをRNAサンプルを含む各チューブに5μL加えます。室温のニューテーターで30分間孵育します。
    6. ウォッシュバッファー1を50μL加えます。よく混ぜて、チューブを磁気ラックに置きます。2分間そのまま置いてください。上清液を取り除きます。洗濯をさらに4回繰り返します。
      注:最初の洗浄後の上清液は、おそらく母体トランスクリプトームのみを含むもので、母体トランスクリプトームの測定のために採取可能です。
    7. ウォッシュバッファー2を50μL加えます。よく混ぜて、チューブを磁気ラックに置きます。2分間そのまま置いてください。上清液を取り除きます。洗濯をさらに4回繰り返します。
    8. ビーズを5μLのウォッシュバッファー2に再懸浮させます。EU-RNAを含んだビーズは、直接cDNA合成とライブラリー準備の準備が整っています。
      注:ライブラリ準備に進む前に、既知の個別遺伝子の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて測定することで、新生転写産株の濃縮を評価できます。

5. RNAライブラリーの調製と配列決定

  1. 市販のキットを使用してcDNAライブラリを作成し、キットの指示に従ってください。NEBNext Library Quant Kit for Illuminaを使ってライブラリを定量化し、プールしてください。
  2. 一般的に使われている次世代シーケンシングキットの指示に従ってライブラリをプールします。ライブラリを~1.8 pMに希釈してからベンチトップシーケンサーにロードし、シーケンス中に最適な クラスター密度~200k/mm²を実現します。一般的に使われている次世代シーケンシングを使ってライブラリをシーケンスします。ペアエンド75塩基対シーケンスを用いて、サンプルあたり約2,000万回のリードを行った。
  3. サーモン17を用いてツメガエルのゲノムビルド9.2に配列をアラインメントし、DESeq218を用いた差異遺伝子発現解析を行い、トランスクリプトミックリードを定量化します。ゲノムブラウザでピークを可視化するには、配列をSTAR19を使ってゲノムにマッピングし、統合ゲノミクスビューア(IGV)19に表示します。

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結果

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受精後5〜9時間(hpf)段階(22°C)のツメガネの胚(4回の生物学的複製)は、ステージ5(大規模ZGAが少ない)からステージ9(高ZGA)までの段階をカバーし、上記の8プロトコルに従って処理されました。全RNA、精製された新生EU-RNA、およびフロースルーRNAがライブラリーの調製に用いられ、シーケンスが行われました。図2に示すように、6–9 hpfの新生トランスクリプトームと5 hpfのトランスクリプトームを比較すると、ZGA中に6〜9 hpfに増加した差異活性化遺伝子の数が検出されました(図2A)。これは、EU-RNA序列を用いたZGAの成功捕捉を示唆しています。さらに、接合遺伝子はEU-RNAによってより高レベルで、かつ早期に検出されており、全RNA-seqと比較して(図2B)。これにより、接合遺伝子の測定においてE...

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ディスカッション

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ここでは、初期胚形成における新生トランスクリプトームの代謝標識に関する詳細なプロトコルを提供しました。これには5-EUを1細胞胚に微量注射し、全RNAを抽出してその濃度を測定し、ライブラリーの調製およびシーケンスのための新生EU-RNAのビオチニル化および精製(EU-RNA-Seq)(図1)が含まれます。この手法は全RNA-seqと比較して高い感度と特異性を持つため、ZGA中の新生トランスクリプトームのレベルと開始時刻を正確に決定しただけでなく、胚の初期発生における個々の遺伝子の新たな時空間的活性化パターンを明らかにすることができました。

このプロトコルを行う前に、実験設計のパラメータ、例えば複製数や分析に含まれる胚の数などを考慮し、決定することが重要です。科学的厳密性と再現性を確保するために、複数の胚(最低5個の胚)、それぞれ少なくとも2...

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開示事項

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著者は競合する利害関係を一切主張していない。

謝辞

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ペンシルベニア大学のマシュー・グッド研究室の研修に感謝します。この研究は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立児童健康・人間発達研究所(R03HD105802)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
µPUPMマイクロインジェクターワールド・プレシジョン・インスツルメンツUPUMPマイクロインジェクション(加圧によるマイクロインジェクション)の場合
5-エチニルウリジンサーモフィッシャー・サイエンティフィックE10345マイクロインジェクション(新生トラクニックスクリプトの標識)について
ACCU-SCOPE 3075 ズームステレオ顕微鏡VWR470351-130マイクロインジェクション(胚の可視化)について
酢酸アンモニウムシグマ・オルドリッチA2706RNA沈殿について
アスコルビン酸シグマ・オルドリッチA7506クリックリアクション用
ホウケイ酸ガラス毛細管ワールド・プレシジョン・インスツルメンツTW100-4マイクロインジェクション(ガラス針の製造)用
遠心分離機エッペンドルフ5425R遠心分離機用
Click-iT Nascent RNAキャプチャキットサーモフィッシャー・サイエンティフィックC10365ビオチニル化および新生RNAの精製のために
CuSO4シグマ・オルドリッチ61230クリックリアクション用
DNase Iロッシュ・ダイアグノスティクス4716728001RNA抽出のために
フィコル400シグマ・オルドリッチGE17-0300-10マイクロインジェクション(胚の培養)の場合
ガラスペトリ皿(60mm)VWR75845-542受精のために
グリコーゲンサーモフィッシャー・サイエンティフィックAM9510RNA沈殿について
ハロカーボンオイル27シグマ・オルドリッチH8773マイクロインジェクション(注入容量の校正)用
L-システインシグマ・オルドリッチ168149胚の解凍のために
マイクロローダーのチップカリバー・サイエンティフィックEPE-5242956003マイクロインジェクション(5-EUをガラス針に装填)用
NEBNext Library Quant Kit for IlluminaNEBE7630ライブラリの定量化のために
NSQ 500/550 ハイ出力KT v2.5(75 CYS)イルミナ20024906シーケンス用
Qubi Flex フルオロメーターサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ33327RNA濃度の測定
量子ビットRNA HS結合キットサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ32852RNA濃度の測定
RNeasyミニキットキアゲン74104RNA抽出のために
ステージマイクロメーターウォードの科学470175-914マイクロインジェクション(注入容量の校正)用
NuQuantを用いたユニバーサルRNA-seq(ユニバーサルRNA-seq)NuGEN0364図書館準備のために

参考文献

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5 RNA

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