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方法論記事

初期胚の単一細胞における接合ゲノム活性化の可視化

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DOI:

10.3791/70592

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2026年4月3日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

この記事について

サマリー

我々は、初期胚発生における単一細胞における受精ゲノム活性化中の新生転写を可視化する方法を記述します。

要約

早期胚発生には、母体から接合子への接合体移行(MZT)が必要であり、これが接合ゲノム活性化(ZGA)を必要とします。ZGAでは、数百から数千の遺伝子が転写され、胚の生存維持、細胞運命の指定、生殖層形成など、初期胚発生のさまざまな過程に不可欠です。ZGA研究における大きな課題の一つは、初期胚の個々の細胞でZGAを直接可視化することでした。ここでは、初期胚の単一細胞において、5-エチニルウリジン(5-EU)を用いた新生転写産物の代謝標識を行い、その後クリック化学で新生EU-RNAを蛍光色体と結合させ、ゼロ ツメガ エルをモデルにして全マウント胚内で共焦点顕微鏡で可視化する方法を説明します。この手法により、全胚における単細胞ZGAの追跡が可能となり、早期胚発生におけるZGAの空間的・時間的不均一な発症を明らかにしました。他の胚系や組織でも、単一細胞レベルでの遺伝子転写やゲノム調節の研究に利用できます。

概要

初期の発達段階では、胚は母体から接合子への移行(MZT)を経て、発生制御が母体因子から接合遺伝子へと徐々に切り替わります。MZTは、最初に休眠状態だった接合ゲノムの活性化を必要とし、これを接合ゲノム活性化(ZGA)と呼びます。ZGAで発現する遺伝子は、初期の細胞運命指定、原腸形成、軸形成に必要です。1,2。重要なのは、ZGAはすべての多細胞動物で保存されており、ZGAの発生タイミングは厳密に制御されているが、種3,4によっては異なる点である。ZGAの調節不全は、発達障害から流産などの胚死に至るまで深刻な結果をもたらすことがあります。したがって、ZGAのメカニズムの研究は遺伝子調節の基礎を理解する上で重要であるだけでなく、臨床上にも重要な意味を持ちます。

ZGA研究における大きな課題は、初期胚における大規模なZGAを直接可視化し、そのメカニズムを単細胞レベルで調査することでした。この課題を克服し、ZGA中に新生転写産物を5-エチニルウリジン(5-EU)で代謝標識し、その後クリック化学と共焦点顕微鏡による全マウント胚の全マウント胚の可視化を用いて、新生EU-RNAを蛍光色体に結合させる方法を開発しました。モデルはアフリカツメガエルをモデルにしています。大きなツメガエル胚(直径約1.2mm)は細胞サイズの勾配を持ち、大規模なZGAは中間胚盤期(第7期頃、第9期頃にピーク)に現れ、ZGA5のパターン研究に理想的なモデルとなっています。初期ゼノメガエル胚に5-EU標識を用いることで、全粒初期胚の個々の細胞における大規模ZGAを直接可視化・定量化でき、これにより主に細胞サイズ5,6によって調節される新しい時空間的ZGAパターンを発見しました。

ここでは、最適化5,7を用いた従来の研究から適応したこのアプローチの詳細を説明します。これには、5-EUを用いた新生転写母の代謝標識後に胚を固定し、クリック反応8を用いて蛍光色体と新生EU-RNAを共役させ、亜細胞マーカーの免疫染色を行い、その後共焦点イメージングのために胚をクリアする方法が含まれます。この方法はゼブラフィッシュ9,10を含む他の胚システムにも適用でき、また新生トランスクリプトーム11のプロファイリングに用いられ、さまざまなサンプルや分析における一般的かつ広範な応用を支援します。全体として、この方法は単一細胞におけるゲノム調節機構を研究する新たな重要な手段を提供します。

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プロトコル

ここで述べる動物の活動は、サウスカロライナ大学の動物管理・利用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. プロトコル開始前の準備

注意:プロトコル開始前に、RNaseフリーの水を使って以下の溶液を準備してください。

  1. トリスバッファー生塩水(TBS)、pH7.6:50 mM Tris-HClおよび150 mM NaClを1×準備します。pHを7.6に調整してください。常温で保存してください。バッファは2ヶ月以内に使ってください。
  2. トリスバッファード生理食塩水1× Tween 20(TBST)、pH 7.6を準備します:最終濃度0.1%(vol/vol)のTriton X-100をRNaseフリー水で調製した1× TBS(pH 7.6)に加えます。常温で保存してください。バッファは1ヶ月以内に使いましょう。
  3. 4%パラホルマルデヒド(PFA)/1×MEMを調製します:16%PFAストック1バイアル(10mL)と10×MEM(1000 mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸[MOPS] pH 7.4、20 mM EGTA、10 mM MgSO4)を混合します。RNaseフリーの水を40mLに加えます。分割して-20°Cで保存します。 6ヶ月以内に使いましょう。
  4. 70%、50%、25%のメタノールを0.5×SSCで調製します。メタノールと0.5×SSCをそれぞれ3:1、1:1、1:3で混合します。6ヶ月以内に解決策を使いましょう。
  5. 漂白液を準備します:RNaseフリー水で最終濃度2%(vol/vol)H2O2、5%(vol/vol)、0.5× SSCの濃度に混合します。使用直前にこの溶液を新しく準備してください。
  6. ブロッキング溶液を準備します:最終濃度のヤギ血清10%(vol/vol)と0.2%(wt/vol)BSAを1×TBSTに加えます。-20°Cで保存します。 6ヶ月以内に使いましょう。
  7. BABBクリアリング試薬を準備します:ベンジルアルコール(BA)1とベンジルベンゾエート(BB)2を混ぜます。常温で保存してください。6ヶ月以内に使いましょう。

2. 5-EUマイクロ注入胚の固定

  1. 5-エチニルウリジン(5-EU)を1細胞胚に微量注射するには、前述の手順に従ってください。11。胚はZGAの望ましい段階、例えばZGAが胚のほとんどの細胞で活性化している段階9まで発達させます。
  2. 5-EUマイクロ注入胚を固定するには、まず約1.8mLの4% PFA/1× MEMを2mLのシンチレーションガラスバイアルに加えます。その後、プラスチックのトランスファーピペットを使って約20個の胚をガラスバイアルに移します。ガラスバイアルに添加する培地の量は最小限に抑えてください。
  3. ガラスバイアルの上部に4%のPFA/1× MEMを追加で満たします。瓶をキャップで閉じる;気泡を残してはいけません。
  4. ガラス瓶を回転装置に置き、室温で少なくとも2時間、低速(例:10rpm)で胚を回転させます。
  5. ピペットを使って固定剤を慎重に取り除いてください。ガラス瓶に100%メタノールを入れます。ガラス瓶を回転装置に置き、胚を低速で5分間回転させます。
  6. 慎重にメタノールを取り除き、新しいメタノールを加えます。胚を完全に脱水させるために、回転と脱水を少なくとも2回繰り返してください。
  7. 胚は-20°Cのメタノールに保存します。
    注:プロトコルはここで一時停止可能です。胚を少なくとも2日間メタノールに浸してから、次の手順を進めてください。胚は2ヶ月以内に使用可能です。

3. クリック反応による蛍光団との新生RNAの共役

  1. 胚を再水和させるには、まずガラスバイアルからメタノールを取り出し、その後75%メタノール2mLを0.×5 SSCに加え、キャップでバイアルを閉じます。ガラス瓶を回転装置に置き、胚を低速で5分間回転させます。
  2. 回転後にガラス瓶の中の液体を取り出します。上記のステップを連続して繰り返し、0.5×SSCに50%メタノール、0.5×SSCに25%メタノール、0.5×SSCを使用します。胚を完全に再水和させるには、最終洗浄を0.5× SSCで少なくとも2回繰り返します。
  3. 新たに調製した漂白液2mL(2% H、2O2 、5% ホルマミド、0.5× SSC)をガラスバイアルに加えます。ガラス瓶をアルミホイルの上に置き、サンプルが過熱しない距離でLEDライトの下に置きます。
  4. すべての色素が白くなるまで光の下で胚を漂白し、通常5〜6時間かかります。H2 O2がO2に分解されるため、小さな気泡が発生し胚を浮かせることがあります。胚を定期的に(例:30分ごと)チェックし、ガラスバイアルを優しく回転させて胚が漂白液に沈着するのを待ちます。
  5. 漂白バッファーを慎重に取り除きます。0.5×SSCを2mL加えて胚を素早くすすいでいます。必要ならもう一度素早くすすぎを繰り返してください。
  6. ガラスバイアルに1×TBSTを2mL加えます。ガラスバイアルをローテーターに置き、胚を低速で1時間回転させます。回転後にガラス瓶の中の液体を取り出します。
  7. 上記のステップを少なくとも5回繰り返してください。以下のステップでは胚の徹底的な洗浄が非常に重要です。
  8. ガラスバイアルに1×TBSを2mL加えます。ガラス瓶を回転装置に置き、胚を低速で5分間回転させます。回転後にガラス瓶の中の液体を取り出します。
  9. 上記の手順をもう一度繰り返します。
  10. 1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブ内でクリック反応用に、以下の試薬を加えて100 mM Tris-HCl(pH 8.5)、1 mM CuSO4、25 μMテトラメチルホダミン(TAMRA)-アジド、100 mMアスコルビン酸の最終濃度を得ます。反応の最後にアスコルビン酸を加えます。ピペットを上下に動かしてよく混ぜます。
  11. ガラスバイアル内の胚に200μLの反応混合物を加えます。反応混合物の容量がすべての胚をバイアルに浸すのに十分であることを確認してください。暗闇の常温で12時間孵卵します。
  12. クリック反応の混合物を慎重に取り除いてください。胚には非特異的な蛍光が見られることに注意してください。胚を1×TBSTで素早く2回洗い、その後1×TBSTで少なくとも5回洗い、上記の通り1時間ごとに溶液を変えます。
  13. 胚を洗浄し続け、2時間ごとに1×TBSTを交換し、4°Cの回転筋で一晩放置します。非特異的な蛍光がほとんど見えないときは洗うのをやめてください。クリック反応の残基は下流の免疫染色に有害になる可能性があるため、次の段階に進む前に胚を1〜2日間しっかり洗浄してください。

4. 細胞内マーカーを用いた胚の免疫染色(任意)

  1. 胚をブロックするには、上記の最終洗浄工程でガラスバイアルから1×TBSTを取り出し、ブロッキング溶液200μL(ヤギ血清10%/BSA/1TBST)を加え×します。ガラス瓶をアルミホイルで包んで胚を光から守ります。ガラス瓶をヌーターに置き、胚を室温で少なくとも1時間(または4°Cで一晩)優しく振ってください。
  2. 一次抗体(例:抗H3抗体)を1:1,000で希釈し、10%ヤギ血清/TBSTを200 μLで溶かします× TBST。希釈した抗体をガラスバイアルに加え、アルミホイルで包みます。胚は4°Cの低速でナテーターで一晩培養します。
  3. ガラスバイアルから抗体を慎重に取り出してください。1×/TBSTを2mLガラスバイアルに入れて取り出し、胚を素早く2回すすいでください。
  4. ガラス瓶に1×TBSTを2mL加え、アルミホイルで包みます。ガラスバイアルをローテーターに置き、胚を低速で1時間回転させます。回転後にガラス瓶の中の液体を取り出します。
  5. 上記のステップを少なくとも5回繰り返してください。
  6. 二次抗体(例:ウサギのAlex Fluor 488抗体)を1:1,000で希釈し、10%ヤギ血清/TBSTを200 μLで溶×します。DNA染色が必要な場合は、二次抗体とともにDNA染料(例:TO-PRO-3)を希釈します。
  7. 希釈した抗体をガラスバイアルに加え、アルミホイルで包みます。胚は4°Cの低速でナテーターで一晩培養します。
  8. ガラスバイアルから抗体を慎重に取り出してください。1×/TBSTを2mLガラスバイアルに入れて取り出し、胚を素早く2回すすいでください。
  9. ガラス瓶に1×TBSTを2mL加え、アルミホイルで包みます。ガラスバイアルをローテーターに置き、胚を低速で1時間回転させます。
  10. 上記のステップを少なくとも5回繰り返してください。

5. 共焦点画像検査前の胚の除去

  1. 胚を脱水させるには、最終洗浄後にガラスバイアル内のバッファーを慎重に取り出し、100%メタノール2mLを加えます。ガラス瓶をアルミホイルで包み、回転装置に置き、胚を5分間低速で回転させます。回転後にガラス瓶の中の液体を取り出します。
  2. 上記のステップを少なくとも5回繰り返してください。
  3. 胚を完全に脱水させるには、上記の手順を100%無水メタノール2mLを使い、少なくとも5回繰り返します。
  4. ガラスバイアルからできるだけ多くのメタノールを慎重に除去してください。
  5. ガラスピペットを使って、透明剤BABBを500μLゆっくりとガラスバイアルに追加します。胚はBABB内で浮かび、10分間待ってすべての胚がガラスバイアルの底に落ち着きます。胚はほとんど見えなくなるので注意し、BABBを慎重に取り除き、胚を傷つけないようにしてください。
  6. 上記の手順を少なくともあと2回繰り返し、シュリーレン線が見えなくなるまで繰り返します。胚を完全に除去するには、画像検査前に1〜2日間BABB内に保持してください。
  7. VHBテープから小さな四角形(例:~5 mm× 5 mm)を切り取り、厚さは胚と同じ大きさ、サイズは~10 mm×10 mm)を作り、それを24 mm×40 mmのカバーガラスに接着します。
  8. クリアした胚を慎重にチャンバーに移し、さらに別の蓋付きのグラスで覆います。胚はカバーグラスのサンドイッチの中に収められ、両面を画像化できます。
  9. 共焦点顕微鏡下での画像診断を行います。

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結果

1細胞期のゼノップス・ラエビ胚は5-EUを顕微注射し、9期の胚は胚全体で大規模なZGAが進行している際に固定されました。胚は上記のプロトコルに従って処理されました。胚中の新生RNAはクリック反応でTAMRA-azideで標識され、ヒストンH3は抗ヒストンH3抗体を用いて標識され、DNAはTO-PRO-3で標識されました。胚は10×対物レンズを用いた共焦点顕微鏡下で画像化されました。図1に示すように、胚細胞の核内で新生のEU-RNA(赤色)が検出され、H3(緑色)とDNA(マゼンタ色)が核マーカーとして用いられ、これらの胚細胞で非常に活性化されたZGAが存在していることを示唆しています。したがって、代謝標識されたEU-RNAは、胚発生初期におけるZGAの単一細胞解析において、感度が高く便利な方法を提供します。

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ディスカッション

ZGAは胚発生の最も初期段階における最も重要な移行の一つを示しています。ここでは、全額マウント初期ツメガエル胚でZGAを直接可視化するための詳細な手順を説明しました。これには、5-EUマイクロ注入胚の固定、クリック反応による新生RNAと蛍光体の結合、クリック反応後の細胞内マーカーの免疫染色、共焦点イメージングのための胚のクリアリングなどが含まれます。.取り込まれた5-EUの量は進行中の転写に比例するため、各核内の蛍光信号の強度は単細胞レベルでのZGAの定量的読み取りを提供します。この方法により、個々の細胞におけるZGAの活性を定量・監視し、胚内の細胞間で比較でき、胚発生初期におけるZGAの新しい空間パターンとメカニズムの発見につながりました。

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開示事項

著者は競合する利害関係を一切主張していない。

謝辞

ペンシルベニア大学のマシュー・グッド研究室の皆様に感謝いたします。この研究は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立児童健康・人間発達研究所(R03HD105802)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16% パラホルマルデヒド(PFA)EMS15710-S固定液を作るために
20回以上;SSCメディアテックMT46-020-CM漂白液を作るために
3DナテイティングミキサーVWR76595-802ナチューン胚の場合
9mmネジ山バイアル(2 mL)VWR46610-722胚の処理のために
抗ヒストンH3抗体アブカムAB1791免疫染色のために
アスコルビン酸シグマ・オルドリッチA7506クリック反応を起こすために
ベンジルアルコールシグマ・オルドリッチ305197胚のクリアリングのために
ベンジルベンゾエートACROSオーガニックス105860010胚のクリアリングのために
牛血清アルブミン(BSA)シグマ・オルドリッチA3059ブロッキング解を作るために
9mmネジ山バイアル(2 mL)用キャップVWR46610-712胚の処理のために
カバーガラス(24mm&40mm)VWR48393-060イメージングチャンバーの製造
CuSO4シグマ・オルドリッチ61230クリック反応を起こすために
エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸(EGTA)サーモフィッシャー・サイエンティフィックAC409915000固定液を作るために
フィジーイメージJNIH画像処理のために
ホルマミドサーモフィッシャー・サイエンティフィックAC181090010漂白液を作るために
グラスパスツールピペットVWR14673-010BABBの転送について
ヤギ抗ウサギ Alex Fluor 488 二次抗体サーモフィッシャー・サイエンティフィックA27034免疫染色のために
ヤギ血清アブカムAB7481ブロッキング解を作るために
過酸化水素シグマ・オルドリッチH1009漂白液を作るために
硫酸マグネシウム(MgSO4)サーモフィッシャー・サイエンティフィックM65-500固定液を作るために
メタノールサーモフィッシャー・サイエンティフィックA4524胚の脱水のために
メタノール、無水シグマ・オルドリッチ322415胚の脱水のために
MOPSサーモフィッシャー・サイエンティフィックAC172631000固定液を作るために
マルチモードのナテーティングミキサーVWR76595-812ナチューン胚の場合
プラスチックトランスファーピペットサーモフィッシャー・サイエンティフィック13-711-9AM胚移植のために
カミソリの刃サーモフィッシャー・サイエンティフィック18-100-970テープを切断するために
RNaseフリーの水サーモフィッシャー・サイエンティフィックBP561-1RNASEフリー溶液の製造
ロトミニPLUS(ローテーター)VWR470313-912輪状胚の場合
テトラメチルホダミン(TAMRA)-アジドアブカムAB146486クリック反応を起こすために
TO-PRO-3サーモフィッシャー・サイエンティフィックT3605DNA染色のために
トライトン X-100シグマ・オルドリッチ10789704001洗浄バッファーの製造
トリズマ基地(Tris Base)シグマ・オルドリッチT1503Trisバッファを作るために
VHB 3M GPH-110GFテープ(45ミル)VWR76524-608イメージングチャンバーの製造
ツァイスLSM 700共焦点顕微鏡ツァイス共焦点イメージング用

参考文献

  1. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  6. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  7. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  8. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  9. Chan, S. H., et al. Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  10. Adar-Levor, S., et al. Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).
  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

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