方法論記事

代謝機能異常関連脂肪性肝疾患における早期心代謝評価の標準化プロトコル

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DOI:

10.3791/70593

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2026年9月29日

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1Clinical Research Department, Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory, 2Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), Laboratory of Biochemistry and Experimental Medicine, 3Cardiology Department, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), 4Facultad de Enfermería y Nutrición, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, 5Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada (CICATA), Instituto Politécnico Nacional (IPN)

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患（MASLD）の成人における早期心代謝評価のための標準化されたワークフローについて説明します。これには、食事性炎症評価、生化学的バイオマーカー、心エコー検査、および頸動脈超音波検査の統合に加え、再現性を向上させるための標準化されたデータ取得、品質管理、およびデータ検証手順が含まれます。

要約

代謝異常関連脂肪性肝疾患（MASLD）は、慢性的で軽度の炎症および心血管疾患のリスク増加に関連しています。食事による炎症評価と客観的な心血管イメージングを統合した標準的なプロトコルが限られているため、潜在的な心代謝変化を早期に特定することは依然として困難です。本プロトコルでは、MASLDと診断された成人における、食事の炎症誘発能と早期心代謝変化との関連を評価するための再現可能なワークフローについて記述します。参加者は標準化された適格基準に基づいて登録され、超音波検査によって肝脂肪変性が確認されます。食事摂取量は、妥当性が検証された半定量的な食物摂取頻度調査票（FFQ）を用いて評価し、そこから元の文献に基づいた手法を用いて食事炎症指数（DII）を算出します。心代謝評価には、人体計測、空腹時生化学分析、トリグリセリド対高密度リポタンパク質コレステロール（TG/HDL-C）比および血漿アテローム形成指数（AIP）の算出、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）による炎症バイオマーカーの定量、組織ドップラー由来のE/e′を用いた経胸壁心エコーによる左室拡張機能評価、および頸動脈内中膜複合体厚（CIMT）測定のための両側頸動脈超音波検査が含まれます。手法の一貫性と再現性を確保するため、標準化された取得手順、定義済みの品質管理チェックポイント、およびデータ検証ステップが組み込まれています。代表的な結果は、DII分類、炎症バイオマーカープロファイル、心エコー指標、CIMT測定値など、本プロトコルによって生成された標準化データを示すものであり、確定的な生物学的関連性を意味するものではありません。本プロトコルは、MASLD患者における食事の炎症負荷と早期心代謝変化との関係を調査する臨床およびトランスレーショナル研究を実施するための、詳細で再現可能な手法の枠組みを提供します。

概要

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患（MASLD）は、世界で最も一般的な慢性肝疾患であり、成人人口の約3分の1に影響を及ぼしています。進行性の肝損傷に加え、MASLDは慢性的で軽度の炎症、インスリン抵抗性、内皮機能不全、および加速された動脈硬化を特徴とします1,2。心血管疾患はMASLD患者における罹患率および死亡率の主要な原因となっており、臨床的に明らかな心血管疾患を発症する前に、初期の心代謝変化を特定するための信頼性の高いアプローチの必要性が強調されています3,4。本プロトコルの目的は、MASLDの成人患者における食事性炎症負荷、全身性炎症、および早期の潜在的な心血管機能不全を統合的に評価するための、標準化された再現可能なワークフローを提供することです。本プロトコルは、この集団において臨床的に有意な心血管疾患に先行する初期の心代謝リスクを調査する臨床およびトランスレーショナル研究を対象としています。

蓄積された証拠により、食事はMASLDの発症および進行において極めて重要な役割を果たすことが示されています。超加工食品、飽和脂肪酸、精製炭水化物、および添加糖類の摂取量が多い食事パターンは、酸化ストレス、内皮機能不全、免疫活性化、および慢性的な全身性炎症を促進します5,6。対照的に、食物繊維、ポリフェノール、オメガ3脂肪酸、および抗酸化微量栄養素を豊富に含む食事パターンは、代謝機能不全および心血管疾患に関連する炎症経路を減弱させます6,7

食事性炎症指数（Dietary Inflammatory Index: DII）は、C-reactive protein (CRP)、interleukin (IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-10、およびtumor necrosis factor-α (TNF-α)を含む炎症性バイオマーカーに対する45種類の食事成分の影響に基づいた、文献由来のスコアリングシステムを用いて、習慣的な食事摂取の炎症誘発性を推定するために開発されました8。多様な集団において、DIIスコアが高いほど、血中炎症メディエーターの増加、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、2型糖尿病、および心血管疾患との関連が認められています9,10.

DIIは不利な代謝アウトカムとの関連が認められていますが、MASLD患者における早期の心血管変化を検出するために、食事性炎症評価と客観的な心血管イメージングを統合した研究は比較的少数です4,11。心代謝障害の最も早期の徴候の一つに、組織ドプラ由来のE/e′比で評価される不顕性左室拡張能不全があります。これは左室充満圧の上昇を反映しており、糖尿病性および代謝性心筋症の早期の特徴となります12,13。また、頸動脈内中膜複合体厚（CIMT）は、不顕性動脈硬化の検証済みサロゲートマーカーであり、将来の心血管イベントを独立して予測します14,15。

主に人体計測、ルーチンの生化学的検査、および個別の心血管リスク因子に依存する従来の心代謝評価と比較して、本プロトコルでは、食事性炎症評価、炎症バイオマーカープロファイリング、拡張機能の心エコー評価、および頸動脈超音波検査を単一の標準化されたワークフローに統合しています。この統合的アプローチにより、臨床研究設定で広く利用可能な非侵襲的技術を用いて、食事への曝露、全身性炎症、および潜在的な心血管リモデリングを同時に評価することが可能になります。代謝性疾患における早期心血管機能不全の特性評価を向上させるためにマルチモーダルなアプローチが提案されてきましたが、標準化された実施プロトコルは依然として限られています。

従来の脂質プロファイル評価を補完するため、本プロトコルでは、中性脂肪/高密度リポ蛋白コレステロール（TG/HDL-C）比および、log (TG/HDL-C) として算出される血漿動脈硬化指数（AIP）も組み込んでいます。AIPは、動脈硬化性リポ蛋白と抗動脈硬化性リポ蛋白のバランスを反映しており、小型高密度低密度リポ蛋白（LDL）粒子、インスリン抵抗性、内皮機能不全、および残存心血管リスクのサロゲートマーカーとして注目されています。その結果、AIPは動脈硬化性脂質異常症のより包括的な評価を可能にし、特にMASLD16,17などの代謝性疾患を有する心血管リスクの高い個体を特定する上で、優れた識別能を示すことが実証されています。

さらに、本プロトコルでは、食事の炎症能とMASLDにおける心代謝損傷を結びつける生物学的メカニズムをさらに詳細に特性付けるため、血中炎症バイオマーカーのパネルを組み込んでいます。これらのバイオマーカーは、白血球のリクルート、自然免疫の活性化、前炎症性および抗炎症性シグナル伝達、内皮機能不全、およびインスリン抵抗性において中心的な役割を果たすため選択されました。これらのメディエーターを同時に評価することで、CRP単独よりも包括的に全身性炎症を特性付けることができ、食事による炎症負荷とMASLDにおける早期心血管損傷との関係についてのメカニズム的な洞察を深めることができます1,18,19。

したがって、本プロトコルは、食事評価、炎症バイオマーカープロファイリング、生化学的分析、心エコー検査、および頸動脈超音波検査を統合することにより、MASLD患者における食事の炎症誘発能と早期心代謝変化との関連を評価するための、標準化および再現可能な手法を提供します。標準化された測定手順と定義済みの品質管理チェックポイントを組み込むことで、本ワークフローは、研究者や施設間での再現性を促進し、MASLDにおける早期心代謝リスクに関する臨床的およびトランスレーショナル研究を支援するように設計されています。

プロトコル

本研究プロトコルは、メキシコシティ（メキシコ）の国立医療センター「20 de Noviembre」、国家労働者社会保障・サービス機関（ISSSTE）の機関研究・研究倫理委員会の承認を得ている（承認ID：04-118-2025）。すべての手順は、ヘルシンキ宣言および人間を対象とした研究を規定する適用可能な国内規制に従って実施すること。登録前に、すべての参加者から書面によるインフォームド・コンセントを得ること。すべての臨床、検査、食事、および画像データにコード化された研究識別子を使用し、参加者の機密性を保護すること。

1. 被験者の募集および適格性の評価

  1. 参加者の募集
    1. 2025年から2026年の間に、代謝機能障害関連ステアトティック肝疾患（MASLD）が疑われる18歳以上の成人を募集する。
    2. 登録前に、研究目的、手順、潜在的なリスク、および機密保持措置について説明する。
    3. 研究手順を実施する前に、各参加者から書面によるインフォームドコンセントを得る。
  2. MASLDの確定診断
    1. 施設で標準化された手順を用いて腹部超音波検査を実施する。
    2. 腎皮質と比較して肝エコー輝度が上昇し、後方減衰を伴っていることを確認して、肝ステアトーシスを確定させる。
    3. 現在のコンセンサス基準に従い、肝ステアトーシスと、少なくとも1つの心代謝リスク因子の存在を確認してMASLDと診断する。
      注：検者による変動を最小限に抑えるため、すべての超音波検査は同一の撮像プロトコルを用い、可能な限り同一の経験豊富な放射線科医が実施すること。
  3. 適格性の評価
    1. 事前に定義されたすべての適格基準を満たし、書面によるインフォームドコンセントを提供した参加者を組み入れる。
    2. 有意なアルコール摂取がある参加者は除外する。
    3. ウイルス性肝炎（HBVまたはHCV）、自己免疫性肝疾患、薬剤性肝障害、遺伝性肝疾患、妊娠、活動性悪性腫瘍、非代償性心不全、または心代謝評価に影響を及ぼす可能性のあるその他の慢性肝疾患を有する参加者は除外する。
      注：各参加者にコード化された研究識別子を割り当て、研究データベースから氏名、診療録番号、およびその他の個人識別情報を削除し、心エコーおよび頸動脈超音波画像を施設の安全なデータベースに保存することで、参加者の機密性を保護すること。

2. 食事頻度調査票

  1. 食事アセスメントツールの選択
    1. 研究対象集団に適した、妥当性が検証済みの半定量的食物摂取頻度調査票（FFQ）を選択する。
      注：24時間食事回想法や食事記録による繰り返し検証が行われたFFQを使用すること。本プロトコルでは、過去7日間の習慣的な摂取量を評価するために、ENSANUT 140項目の半定量的FFQを使用した20,21。
  2. 食事アセスメントの準備
    1. 参加者のリクルート前に、標準化された書面による指示書を用いて、すべてのインタビュアーにトレーニングを行う。
    2. 質問票の実施方法、ポーションサイズの推定、回答の解釈、およびデータ記録について、すべてのインタビュアー間で標準化する。
  3. FFQの実施
    1. 対面インタビュー形式でFFQを実施する。
    2. FFQで指定された参照期間における、習慣的な食物および飲料の摂取量を報告するよう参加者に指示する。
    3. 平日と週末の両方で摂取した食品を含める。
    4. 急性の疾患、入院、または短期間の治療的介入に伴う一時的な食事の変化は除外する。
  4. 食事摂取量の記録
    1. あらかじめ定義されたFFQの頻度カテゴリーを用いて、食品の摂取量を記録する。
    2. 標準化された家庭用器具、食品モデル、写真、または参照用サービングガイドを用いて、ポーションサイズを推定する。
    3. 参加者の回答に影響を与えない範囲で、不慣れな食品、サービングサイズ、または頻度カテゴリーについて確認を行う。
      注：インタビュー直後に、完了した各FFQをレビューしてデータの質を確認する。未回答や矛盾した回答を特定し、データを研究データベースに入力する前に、参加者に直接確認して不一致を解消する。
  5. 1日あたりの食事摂取量の算出
    1. 報告された摂取頻度を、1日あたりの平均摂取量（回/日）に変換する。
    2. FFQマニュアルに従い、ポーションサイズを1日あたりのグラム（g）またはミリリットル（mL）に変換する。
    3. 適切な食品組成データベースおよび栄養分析ソフトウェアを使用して、1日あたりの栄養素摂取量を算出する。
    4. すべての参加者に対して、同一の栄養素算出手順を適用する。
      一時停止ポイント：品質検証後、完了したFFQを安全に保管し、後で栄養分析および食事炎症指数（DII）の算出を行う。

3. 食事性炎症指数の推定

注：食事炎症指数（DII）は、検証済みの食事アセスメントツールを用いて収集されたデータから、日常的な食事摂取の炎症潜在性を推定する、文献に基づいたアルゴリズムである8。

  1. 食事摂取データの準備
    1. 標準化された食品成分データベースと栄養解析ソフトウェアを用いて、すべてのFFQ回答を1日あたりの栄養素摂取量に変換する。
    2. すべての参加者に対して同一の栄養素計算手順を適用する。
  2. 食事成分の選択
    1. DII算出に利用可能な食事成分を特定する。
    2. 選択したFFQおよび食品成分データベースで確実に把握された食事成分のみを用いてDIIを算出する。
    3. すべての参加者に同一の食事成分セットを適用する。
      注：測定されなかった食事成分に0の値を割り当てないこと。
  3. 標準化スコアの算出
    1. 各食事成分の摂取量を、元のDII手法8に記載されている対応する世界的な参照平均値および標準偏差と比較する。
    2. 以下の式を用いて標準化スコアを算出する。
    3. 標準化スコア = (参加者の摂取量 − 世界的な参照平均値) ÷ 世界的な参照標準偏差
  4. 中心化パーセンタイルの算出
    1. 元のDII手法に従い、各標準化スコアを中心化パーセンタイルに変換する。
    2. 以下の式を用いて中心化パーセンタイルを算出する。
    3. 中心化パーセンタイル = (パーセンタイル × 2) − 1
  5. 成分別DIIスコアの算出
    1. 中心化パーセンタイルに、元のDIIデータベース8で各食事成分に割り当てられている炎症影響スコアを乗じる。
    2. 利用可能なすべての食事成分について、この計算を繰り返す。
    3. 成分別DIIスコア = 中心化パーセンタイル × 炎症影響スコア
  6. 総合的な食事炎症指数（DII）の算出
    1. 成分別DIIスコアを合算し、各参加者の総合的なDIIスコアを求める。
    2. 負の値は、より抗炎症的な食事パターンとして解釈する。
    3. 正の値は、より炎症促進的な食事パターンとして解釈する。
  7. 参加者の分類
    1. DIIスコアに基づいて参加者を順位付けする。
    2. 研究集団の分布に基づき、参加者を四分位に分ける。
  8. 品質管理の実施
    1. すべての参加者に対し、同一のFFQ、食品成分データベース、栄養解析ソフトウェア、およびDII算出法を使用する。
    2. 解析前に、すべての食事記録について、情報の欠落、不自然なエネルギー摂取量、およびデータ入力ミスがないかを確認する。
    3. 計算精度の検証のため、無作為に抽出した参加者サンプルについてDIIを独立して再計算する。
    4. DII算出に含まれたすべての食事成分を記録し、利用不可能であった成分を報告する。

4. MASLDの評価

  1. 1.2.2に従い、肝脂肪変性を確認する。
    注：操作者による変動を最小限に抑えるため、可能な限り、同一の習熟した放射線科医が同一の撮像パラメータを用いてすべての検査を行うこと。
  2. アルコール摂取量を評価する
    1. 標準化された臨床面接を用いてアルコール摂取量を評価する。
    2. アルコール摂取量がMASLDの現在の診断閾値を超える参加者を除外する。
  3. 肝脂肪変性の二次的原因を除外する
    1. 慢性ウイルス性肝炎（HBVまたはHCV）のある参加者を除外する。
    2. 自己免疫性肝疾患、薬剤性肝障害、遺伝性肝疾患、妊娠、活動性悪性腫瘍、または心代謝アセスメントを妨げる可能性のあるその他の慢性肝疾患を有する参加者を除外する。
  4. 心代謝リスク因子を評価する
    1. ボディマス指数（BMI）を測定し、BMI ≥25 kg/m2を過体重または肥満として分類する。
    2. 空腹時血漿血糖値 >125 mg/dLを用いて2型糖尿病を評価する。
    3. 以下の基準のうち少なくとも2つを満たしていることを確認し、代謝異常を評価する：腹囲の増加、血圧 ≥130/85 mmHg、トリグリセリド ≥150 mg/dL、HDL-C（男性 <40 mg/dL、女性 <50 mg/dL）、空腹時血漿血糖値 100–125 mg/dLまたはHbA1c 5.7%–6.4%、またはHOMA-IRなどのインスリン抵抗性マーカーの上昇。
  5. 現在のコンセンサス基準に基づき、肝脂肪変性が確認され、かつ少なくとも1つの心代謝リスク因子がある場合にMASLDと診断する。

5. 心代謝リスクの評価

  1. 人口統計学的および人体計測学的測定
    1. 参加者の年齢、性別、既往歴、現在服用中の薬剤、および2型糖尿病や高血圧を含む診断済みの心代謝疾患を記録する。
    2. 校正済みの機器を用いて、身長と体重を測定する。
    3. 体重 (kg) を身長 (m2) の2乗で除して、BMI（体格指数）を算出する。
    4. 伸縮しない測定用テープを用いて、最終肋骨の下縁と腸骨稜の中間点における腹囲を測定する。
  2. 日常的な自動臨床検査法を用いて、心代謝リスクの生化学的マーカーを決定する。
    1. 施設内の検査手順に従って、空腹時血液サンプルを採取する。
    2. 日常的な自動臨床検査を用いて、総コレステロール、HDL-C、LDL-C、トリグリセリド、空腹時血漿血糖、HbA1c、および空腹時インスリンを含む生化学的マーカーを測定する。
      注：自動臨床検査では、通常、総コレステロールとトリグリセリドは酵素比色法で、HDL-CとLDL-Cは直接均一酵素比色法で、空腹時血漿血糖は酵素ヘキソキナーゼ法で、HbA1cは高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で、空腹時インスリンは化学発光免疫測定法で決定される。
    3. インスリン抵抗性の homeostasis model assessment (HOMA-IR) を算出する。
    4. トリグリセリド/HDLコレステロール (TG/HDL-C) 比を算出する。
    5. 血漿アテローム指数 (AIP) を次のように算出する：
      AIP = log (TG/HDL-C)
  3. 血漿炎症バイオマーカーの測定
    注：ヒト生物学的検体は、施設のバイオセーフティ規定および標準的な予防措置に従って取り扱うこと。適切なPPEを着用し、滅菌材料と無菌操作を用い、検体は密封容器で輸送し、生物学的廃棄物は施設規定に従って廃棄すること。
    1. 血液サンプルの採取および処理
      1. 無菌操作を用いて、肘正中静脈から空腹時静脈血 15 mL を適切な抗凝固剤入りチューブに採取する。
      2. チューブをゆっくりと 8～10 回転倒混和させる。4 °C で 2,000 × g、10 分間遠心分離する。
      3. 血漿上清をラベル付きの滅菌チューブに移し、必要に応じて分注する。分析まで分注したサンプルを −80 °C で保存する。
    2. ELISAの実施
      1. 標準品とサンプル希釈液を準備する。指定された抗体コーティングウェルに、標準品、コントロール、および適切に希釈した血漿サンプルをそれぞれ 100 µL ずつ、2連（duplicate）で加える。
      2. 室温で緩やかに撹拌しながら 2.5 時間インキュベートする。内容液を吸引し、0.05% polysorbate 20 を含む PBS (PBST)、pH 7.2–7.4 を 300 µL 用いてウェルを3回洗浄し、最終洗浄後に残液を除去する。
      3. 検出抗体 100 µL を加え、室温で 1 時間インキュベートする。プレートを洗浄し、streptavidin-HRP 100 µL を加えて室温で 30～60 分間インキュベートする。洗浄ステップを繰り返す。
      4. 発色用の TMB 基質 100 µL を加える。暗所で室温にて 20～30 分間インキュベートする。停止液を加える。
      5. マイクロプレートリーダーを用いて 450 nm で吸光度を測定する。標準曲線から分析物濃度を算出する。
      6. 各血漿サンプルを2連で分析し、統計解析用に平均値を算出する。
      7. すべての分析ランに校正標準品と品質管理サンプルを含める。
      8. 2連測定値が事前に定義された変動係数（CV）基準を満たしているか確認する。基準を超えた場合、または技術的エラーが検出された場合は、測定を繰り返す。
      9. コード化された参加者識別子を用いて最終結果を記録する。臨床分析を通じて検体の匿名性を維持する。
  4. 心エコー検査による左室拡張機能の評価
    1. 参加者および機器の準備
      1. 画像取得前に、参加者を少なくとも 10 分間静かに休ませる。
      2. 参加者を左側臥位にし、心周期同期のためにECGリードを装着する。
      3. 呼吸による動きを最小限に抑え、安静呼吸中にすべての画像を取得する。
      4. パルス波ドプラおよび組織ドプライメージングが可能な 2–5 MHz フェーズドアレイ・トランスデューサを備えた高解像度超音波システムを使用する。
      5. 可能な限り、研究全体を通じて同一の超音波機器、トランスデューサ設定、および取得パラメータを維持する。
        注：すべての検査は、米国心エコー学会および欧州心血管イメージング学会の最新の推奨事項に従って実施すること12,22。
    2. 標準的な心エコー画像の取得
      1. 標準的な胸骨傍長軸像、胸骨傍短軸像、心尖四腔像、心尖二腔像、および心尖長軸像を取得する。
      2. ドプラ取得前に、ゲイン、深度、セクタ幅、およびフレームレートを最適化する。
    3. 僧帽弁流入血流の測定
      1. 心尖四腔像において、パルス波ドプラのサンプルボリュームを僧帽弁尖の先端間に配置する。
      2. 僧帽弁流入血流の早期 (E) および後期 (A) 流速を記録する。
      3. 解析のために、少なくとも3回連続する心周期を取得する。
    4. 組織ドプライメージングの実施
      1. 心尖四腔像において、パルス波組織ドプライメージングを起動する。
      2. サンプルボリュームを、僧帽弁輪の中隔側と側壁側に順次配置する。
      3. 超音波ビームを心筋の動きできるだけ平行に維持する。
      4. 各弁輪位置で 3 回連続する心周期を記録する。
    5. 弁輪速度の算出
      1. 中隔側および側壁側の e′ 速度を測定する。
      2. 各弁輪部位について、3つの心周期の平均を出す。
      3. 平均弁輪 e′ 速度を算出する。
    6. E/e′ 比の算出
      1. 僧帽弁 E 速度を平均弁輪 e′ 速度で除して、平均 E/e′ 比を算出する。
      2. 利用可能な場合は、中隔側と側壁側の E/e′ 比を個別に報告する。
        注：品質管理のため、安定した呼吸中に少なくとも 3 回連続する心周期を取得し、各心エコー変数について 3 回の独立した測定値の平均を算出すること。すべてのデジタル画像を保存し、検査データおよび食事データについて盲検化された、少なくとも 2 名のトレーニングを受けたオペレーターによるオフライン解析を行い、最終データ解析前にオペレーター間再現性を評価すること。
  5. 頸動脈内中膜厚の測定による潜在的なアテローム形成の評価
    1. 参加者および機器の準備
      1. 7–15 MHz リニアアレイ血管用トランスデューサを備えた高解像度超音波システムを用いて、頸動脈超音波検査を実施する。
      2. 画像取得前に、参加者を仰臥位で少なくとも 10 分間休ませる。
      3. 頸部をわずかに伸展させ、頭部を検査側から反対方向に約 30–45° 回転させる。
      4. 血管の幾何学的形状を維持し画像品質を最適化するため、過度な頭部回転を避ける。
      5. 可能な限り、すべての参加者に対して同一の超音波システム、トランスデューサ、取得設定、および解析ソフトウェアを使用する。
    2. 頸動脈超音波検査の実施
      1. 右および左の頸動脈を個別に検査する。
      2. 横断面上において、総頸動脈、頸動脈球、内頸動脈、および外頸動脈を特定する。
      3. トランスデューサを回転させ、腔・内膜界面および中膜・外膜界面が明確に定義された縦断像を取得する。
      4. 測定を行う前に、画像の深度、フォーカルゾーン、および全体的なゲインを最適化する。
    3. 頸動脈内中膜厚の測定
      1. CIMT を、腔・内膜界面の前縁から中膜・外膜界面の前縁までの距離と定義する。
      2. 頸動脈球から近位に約 10 mm の位置にある、総頸動脈遠位部の遠壁のプラークのないセグメントを選択する。
        注：これらの領域が事前に定義された研究アウトカムである場合を除き、主要な総頸動脈 CIMT 測定に頸動脈球または内頸動脈を含めないこと。
    4. CIMT の算出
      1. 各頸動脈から少なくとも 3 回の測定を行う。
      2. 右および左の頸動脈について、個別に平均 CIMT を算出する。
      3. 左右の平均値の平均として、全体の平均 CIMT を算出する。
      4. 二次的な記述変数として、各側の最大プラークフリー CIMT を記録する。
    5. CIMT の解釈
      1. CIMT は主に連続変数として分析する。
      2. 適切な場合に限り、代表的なカテゴリ分析のためだけに、事前に定義された研究固有の CIMT 閾値 (<0.7 mm または ≥0.7 mm) を適用する。
      3. 頸動脈プラークを CIMT 測定とは別に記録する。
        注：代表的な分析にのみ ≥0.7 mm の CIMT 閾値を使用し、利用可能な場合は年齢および性別特異的な参照値を使用すること。トレーニングを受けたソノグラファー、コード化された画像、および少なくとも 2 名の調査者による盲検独立解析を用いて品質管理を行う。95% 信頼区間を伴う ICC を用いて検者間および検者内信頼性を評価し、動脈界面の可視化が不十分な場合は測定を繰り返すこと。

6. 統計解析

  1. サンプルサイズの推定
    1. 主要研究目的および期待される効果量に基づき、必要サンプルサイズを推定してください。
    2. 有意水準（α）0.05、および80%以上の統計的検出力を設定した。
  2. Shapiro–Wilk検定などの適切な正規性検定を用いて、連続変数の分布を評価します。
  3. 統計検定の選択
    1. 正規分布に従う連続変数は、Studentのt検定を用いて分析してください。 t-テスト。
    2. マン・ホイットニー検定を用いて、正規分布しない連続変数を分析する U テスト。
    3. 一元配置分散分析（one-way ANOVA）またはクラスカル・ウォリス検定（Kruskal–Wallis test）のうち、適切な方を用いて、3群以上の比較を行ってください。
    4. カイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定を用いて、カテゴリー変数を分析します。
    5. ピアソン相関分析を用いて、正規分布する変数間の関連性を評価する。
    6. スピアマンの順位相関係数分析を用いた非正規分布変数の関連性の評価23,24,25.
  4. 共変量による調整
    1. 必要に応じて多変量回帰分析を行い、食事炎症指数（Dietary Inflammatory Index）と心代謝アウトカムとの独立した関連性を評価する。
    2. 年齢、性別、ボディマス指数（BMI）、腹囲、併存疾患、喫煙状況、身体活動量、および炎症性バイオマーカーに影響を及ぼす可能性のある薬剤を含む、臨床的に関連する共変量を用いて回帰モデルの調整を行う。26.
  5. 両側を検討してください p 値 <0.05で統計的に有意。
  6. 統計解析の報告
    1. 連続変数は平均値として提示する ± 適宜、標準偏差または中央値（四分位範囲）を併記する。
    2. カテゴリ変数については、頻度とパーセンテージで提示してください。
    3. 該当する場合、効果推定値とそれに対応する95%信頼区間を併せて報告してください。

結果

すべての参加者は、標準的な肝臓超音波検査によりMASLDであると確認されました。研究集団は年齢および性別を一致させており、最も多く見られた併存疾患は、Table 1にまとめられている通り、2型糖尿病、全身性高血圧症、および脂質異常症でした。代表的な分析の根拠となる生データは、Supplementary File 1に提供されています。

本プロトコルの代表的な適用例として、食事性炎症指数（DII）を食事による炎症潜在性の指標として分析した。探索的分析の結果、DIIとE/e′比の間には中程度の正の相関が認められたが（Spearman's ρ = 0.50, p < 0.05）、DIIとCIMTの間には有意な相関は見られなかった（Spearman's ρ = 0.40, p = 0.81; Figure 1）。したがって、DIIとCIMTの相関は、探索的で有意ではない結果として解釈されるべきである。

代表的な生化学的分析により、MASLDの参加者は血漿グルコース、HbA1c、トリグリセリド濃度が高く、トリグリセリド/HDLコレステロール（TG/HDL-C）比およびAtherogenic Index of Plasmaの上昇に反映されるように、心血管リスクが高いことが示されました。不顕性動脈硬化については、CIMTに基づいた参加者の層別化によってさらに評価されました。代表的な分析の結果、CIMTの増加は体重、BMI、または腹囲とは関連していませんでしたが、MASLDの存在とは関連していることが示されました（表2）。

本プロトコルの適用性は、事前定義された参加者の分類基準によってさらに明確になります。DIIの最高四分位群（Q4）に割り当てられた参加者は、食事による炎症負荷が最も大きいサブグループを表し、Q1に割り当てられた参加者は炎症への曝露が最も低いグループを表します。同様に、CIMT ≥0.7 mmの参加者は、不顕性動脈硬化の亢進があるとして分類され、E/e′値 ＞14は左室充満圧の上昇および拡張不全を示します。これらの事前定義された閾値は、食事、血管、および心機能に関する所見を解釈するための標準化された枠組みを提供し、参加者グループ間での心代謝リスクの再現可能な比較を可能にします。

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図1: 食事性炎症指数と初期心血管代謝指標との代表的な関係。(A) 食事性炎症指数 (DII) と、左室充満圧の心エコーマーカーである E/e′ 比との相関。 (B) DII と、連続変数として解析した頸動脈内中膜複合体厚 (CIMT) との相関。あらかじめ定義された 0.7 mm という CIMT の閾値は、代表的なカテゴリー解析にのみ使用されており、普遍的な診断カットオフ値として解釈されるべきではない。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

MASLDなしMASLDを伴うp値
(n = 10)(n = 15)
年齢（歳） 42 (37 – 48)41 (39 – 43)0.37
男性 n (%)4 (40.0)8 (53.3)0.4
空腹時血糖値 (mg/dL)88 (83 – 94)105 (98 – 125)0.01
HbA1c5.9 (5.5 - 6.1)6.4 (6.0 – 7.2)0.02
TG (mg/dL)120 (74 – 147)219 (108 – 297)0.02
HDLコレステロール値 (mg/dL)41 (37 – 46)48 (30 – 57)0.43
TG/HDL-C比2.5 (1.8 – 4.9)5.1 (2.6 – 6.7)0.04
AIP0.32 (0.24 – 0.41)0.42 (0.35 – 0.62)0.04
CRP (mg/dL)0.8 (0.4 – 1.0)1.1 (0.2 – 1.3)0.23

表1：MASLDの状態別における代表的な人口統計学的、生化学的、および心代謝的特性MASLD非保有の参加者およびMASLD保有の参加者におけるベースラインの人口統計学的特性と代表的な生化学的および心代謝的パラメータ。連続変数は中央値（四分位範囲）で示し、カテゴリ変数はn (%)で示す。群間比較は、連続変数についてはStudentのt検定またはMann–Whitney U検定を用い、カテゴリ変数についてはフィッシャーの直接確率検定を用いて行った。略語：MASLD = 代謝機能障害関連ステアトティック肝疾患、HbA1c = 糖化ヘモグロビン、TG = トリグリセリド、HDL-C = 高密度リポタンパク質コレステロール、AIP = 血漿アテローム形成指数、CRP = C反応性タンパク質。

早期動脈硬化形成高度なアテローム形成p値
頸動脈内膜中膜厚（CIMT） < 0.7 (n = 18)CIMT ≥ 0.7 (n = 7)
体重 (kg) 73.4 ± 18.070.0 ± 10.60.4
BMI (kg/m2) 30.0 ± 5.2429.0 ± 4.430.46
腹囲 (cm)90.5 ± 7.596.5 ± 2.890.48
代謝異常関連脂肪性肝疾患（MASLD）8 (44.4)7 (100)0.01

表2：頸動脈内中膜複合体厚に基づく代表的な人体測定学的特性頸動脈内中膜複合体厚（CIMT）で層別化した代表的な人体測定学的特性およびMASLD有病率。参加者は、早期亜臨床的動脈硬化（CIMT <0.7 mm）または進行した亜臨床的動脈硬化（CIMT ≥0.7 mm）に分類された。連続変数は平均値 ± 標準偏差で、カテゴリー変数は n (%) で的に示している。群間比較は、適宜、Studentの t検定、Mann–Whitney U検定、またはカイ二乗検定を用いて行った。略語：BMI = 体格指数、WC = ウエスト周囲径、CIMT = 頸動脈内中膜複合体厚。

補足ファイル1：本研究で述べられている解析に使用した生データ。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本稿で述べる手法は、肝臓に関連する代謝機能不全が早期の動脈硬化形成に寄与するという仮説に基づき27,28、心代謝および動脈硬化性の負荷が代謝機能障害関連脂肪性肝疾患（MASLD）と関連しているかどうかを調査するための標準化されたワークフローを提供する。提案するワークフローでは、方法論的な一貫性と再現性を向上させるため、参加者の選定、食事アセスメント、バイオマーカーの定量、心血管イメージング、品質管理、およびデータ検証に関する標準的な手順を確立している。可能な限り、すべての測定は、検者間および施設間の操作者依存的なばらつきを最小限に抑えるため、同一の機器、標準化された収集パラメータ、トレーニングを受けた人員、二重検証、および盲検化された画像解析を用いて実施される。構造化され画像でサポートされた食物摂取頻度調査票（FFQ）を用いた食事アセスメントは、DIIの算出が自己報告による食事摂取量の正確性に依存するため、極めて重要な構成要素となる。標準的な参照ポーションと視覚的補助資料の使用により、想起バイアスが軽減され、個人間の比較可能性が向上する29,30。同様に、45の食事パラメータからなるグローバル参照データベースを用いて食事炎症指数（DII）を推定することで、異なる集団間での食事の炎症潜能の標準的な評価が可能となる8,9。この段階での食事摂取量の誤分類は、心代謝アウトカムとの関連性を弱める可能性がある。さらに、生化学的マーカー、左室拡張機能の心エコー評価（E/e′）、および頸動脈内中膜複合体厚（CIMT）を統合することで、早期の心代謝リスクの包括的な評価が可能となる。ガイドラインで推奨されるプロトコルを厳格に遵守することで、操作者依存的なばらつきを最小限に抑え、信頼性と再現性のある心血管測定が保証される12,15,22。

DIIは、MASLDの診断や心代謝疾患の独立した予測を目的とするものではなく、食事による炎症ポテンシャルの個人間変動を特徴づけるためのものであることを強調しておくことが重要です。したがって、MASLD患者の全員がDIIスコアの上昇を示すとは限らず、またDIIが高いからといって必ずしも進行した心代謝異常を示唆するわけではありません。その代わりに、本プロトコルではDIIを層別化変数として用い、食事による炎症負荷の増加が、MASLDのスペクトラム全体にわたって進行性の亜臨床的心血管変化に関連しているかどうかを調査します。実行可能性を高めるため、本プロトコルでは臨床現場での実施を容易にする集団適応型のFFQを組み込んでいます。包括的な食事調査票はより広範囲の栄養素を捉えることができますが、簡略化されたFFQであっても、DIIおよび食事に関連する炎症パターンの推定において許容可能な妥当性が示されています31。

本プロトコルには、ラボ評価および画像評価における再現性を向上させるための標準化された品質管理手順も組み込まれています。標準化された採血、迅速な検体処理、適切な保存条件、コード化された検体識別、ラボ測定の二重実施、および品質管理サンプルの導入により、分析的なばらつきが最小限に抑えられます。同様に、標準化された患者のポジショニング、ドップラーのアライメント、撮像断面、および複数の心周期の平均化により、心エコー測定のばらつきが低減されます。一方、標準化されたプラークのない総頸動脈遠壁セグメントを用いた両側CIMT評価と、独立したブラインド画像レビューにより、血管測定の再現性が向上します。このワークフローはさまざまな研究環境に適応可能であり、ラボのインフラが限られている施設であっても、利用可能なリソースと研究目的に基づいて、分子マーカーや炎症マーカーを追加する前に、食事アセスメント、人体計測評価、および超音波による心血管アセスメントを実施することができます。

このワークフローのさらなる利点は、不一致な表現型を持つ参加者を特定できる点にあります。例えば、非常に炎症を促進する食事パターンを持ちながら心代謝異常の証拠がない個人や、逆に心代謝機能障害が認められるにもかかわらずDII値が比較的低い個人などが挙げられます。このような知見は、食事パターン、インスリン感受性、内臓脂肪、身体活動、遺伝的およびエピジェネティックな要因、薬物療法、睡眠の質、および心代謝健康のその他の環境決定因の間の複雑な相互作用に関する洞察を与える可能性があります。この標準化されたプロトコルを導入した縦断的研究により、MASLDにおける食事性炎症負荷と心代謝疾患の進行との関係がさらに明確になる可能性があります。

本プロトコルには、いくつかの限界があることを考慮する必要があります。横断的研究デザインであるため、食事の炎症潜能と心代謝障害との関係について因果推論を行うことはできません。加えて、DIIは急性の炎症反応ではなく習慣的な食事パターンを反映しており、自己報告による食事評価は想起バイアスの影響を受けやすくなります32。全身性炎症マーカーとしてC反応性蛋白（CRP）に依存することは、より広範なサイトカインプロファイリングと比較して、微細な炎症変化を過小評価する可能性があります33。同様に、CIMTの再現性は、評価する動脈セグメント、壁の選択、心周期のタイミング、および測定回数に依存します。したがって、連続的なCIMT解析および集団固有のパーセンタイルに基づく解釈が望ましく、代表的な結果で使用された≥0.7 mmという閾値は、普遍的な臨床的閾値ではなく、あらかじめ定義された研究特有の解析カットオフ値として考慮されるべきです。重要な点として、本プロトコルは診断または予後判定アルゴリズムではなく、早期の心代謝リスク評価ワークフローとして意図されています。MASLD患者に対する従来の心代謝スクリーニングアプローチは、心血管リスクの推定に主に身体計測、血圧測定、血糖状態、肝関連生化学検査、および脂質プロファイルに依存していますが34,35、本ワークフローは以下の5つの相補的な領域を統合しています：(i) DIIによって定量化された食事性炎症負荷、(ii) 生化学的心代謝プロファイリング、(iii) 血中炎症バイオマーカー、(iv) E/e′比を用いた心エコーによる左室拡張機能評価、および(v) 早期の不顕性動脈硬化マーカーとしてのCIMTです。これらの相補的な評価を組み合わせることで、従来の心代謝スクリーニングを代替するのではなく補完しつつ、臨床的に明らかな心血管疾患が発症する前の早期の代謝および血管の変化を特定するための、標準化された非侵襲的で再現可能な枠組みを提供します1,3,12,15,34,35,36,37,38,39。

開示事項

著者に開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者は、Institutional Program E015からの資金提供を受けています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ELISAアッセイキット Abcamab65328ELISAアッセイキット、比色法、Abcam、96ウェルプレート用
吸光度測定用マイクロプレートリーダー、SunriseTecan 30190079検出モード：吸光度、波長範囲：340 nm - 750 nm、フィルター波長：405 nm, 450 nm, 492 nm, 620 nm、プレート形式：96ウェルプレート
血圧計在宅ケアANEROIDE 1000フック付き綿100%自己調整可能ブレスレット、成人用動脈指標カフ。
超音波による頸動脈内膜中膜複合体厚（CIMT）の測定Philips EPIQ7L12-3 広帯域リニアアレイトランスデューサリニアプローブ（広帯域リニアアレイプローブ）

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