テルトブチル過酸化物を用いた一次ヒトメラノサイトにおけるストレス誘発性早期老化を誘導する標準化されたプロトコル

サマリー

tBHPを用いたHNMの早期老化誘導のための標準化プロトコル、成長停止、SA-βガラクトシダーゼ活性、SASP因子などの主要な老化マーカー解析の標準化プロトコル。

要約

紫外線、大気汚染、タバコの煙などの環境ストレス要因が、外因性皮膚の老化を引き起こします。これらの外因性老化要因への曝露は老化細胞の蓄積を促進し、しわや色素沈着障害の形成に寄与します。一次紫外線防護を提供するメラノサイトは、加齢とともに活性が低下します。老化した皮膚にメラノサイトが蓄積し、老化の見た目に寄与します。しかし、メラノサイト老化を研究するモデルは少なく、本研究はさらなる研究のための再現可能なモデルの開発を目指しています。本研究では、よく特徴付けられた酸化ストレス誘導物質であるテルトブチル過酸化物(tBHP)を用いて、ヒト新生児メラノサイト(HNM)の老化モデルを提示します。tBHPは細胞内の抗酸化物質防御を低下させ、過激な過剰産生を促進することで酸化還元恒常性を破壊し、DNAやタンパク質の損傷を引き起こします。私たちは、成長能力制限、形態変化、SA-β-ガラクトシダーゼ活性などの確立された老化マーカーの解析を通じて、tBHP処理メラノサイトの老化表現型を特徴づけます。このモデルは、メラノサイトにおけるストレス誘発性早期老化を調査する貴重なツールを提供し、外因性皮膚老化や色素沈着障害におけるメラノサイトの役割についての洞察を提供します。

概要

皮膚の老化は、内因性老化と外因性老化の2つの明確な要因から成り立っています ^1,2。内在的老化は自然な時間的プロセスや遺伝的要因によって引き起こされ、外因性老化は主に紫外線、大気汚染、タバコの煙、化学物質などの環境ストレス要因への累積曝露により生じ、これらは通常の時間速度を超えて老化を加速させます^3,4.環境曝露は酸化ストレスを生み出し、細胞内の抗酸化物質防御を圧倒し、DNA損傷、タンパク質酸化、脂質過酸化を引き起こします。これらの分子変異は持続的なDNA損傷応答や細胞機能障害を引き起こし、最終的に早期老化を促進します^5,6。このストレス誘発性の老化は、シワ、色素沈着の不均一、弾力の低下、バ^{リア機能の}障害など、老化皮膚の臨床的特徴に寄与しています7。

メラノサイトは基底表皮内に存在し、メラニンを合成して周囲のケラチノサイトに移すことで、紫外線による損傷に対する皮膚の主要な防御として機能します。逆説的に、この保護機能が酸化ストレスや外^因性老化中の早期老化に特に脆弱に^{しています。}メラノ生成過程自体は、チロシナーゼ触媒反応の副産物として大量の活性酸素種を生成し、紫外線や汚染などの環境曝露によってさらに増幅される固有の酸化負荷を生み出します(^10,11)。その結果、慢性的な環境ストレスは酸化損傷、ミトコンドリア機能障害、最終的には細胞老化を引き起こす可能性があります¹²。重要性にもかかわらず、メラノサイトの老化を支配する分子経路と、酸化ストレスがどのようにこの過程を開始するのかという重要な疑問が残っています。さらに、老化メラノサイトが周囲の皮膚微小環境に与える影響は、特にSASP因子の放出を通じて加齢に伴う皮膚変化の駆動要因として、依然として十分に解明^{されていません。}

メラノサイトは特に酸化ストレス誘発性の老化に感受性が高いものの、この過程を研究するための実験モデルは限られている^15,16。ほとんどの老化研究は依然として線維芽細胞における複製的またはストレス誘発的な老化モデルに依存していますが、これらのアプローチはメラノサイト独自の生物学的特徴や、隣接細胞とのクロストークや自身のSASP^{プロファイルを通じて}皮膚老化に影響を与える可能性を捉えきれていません。このギャップは、環境ストレス要因に対するメラノサイト特異的な老化モデルの必要性を強調し、環境ストレス要因に対する生理的応答をより正確に反映するものである^18,19。

ストレス誘発性の老化アプローチが利用可能であるにもかかわらず、一次ヒトメラノサイトへの実装は技術的に困難であり、しばしば大きな変動と関連しています。メラノサイトは特に酸化ストレスに敏感であり、効果的な老化誘導と過剰な細胞毒性の間の実験的ウィンドウが狭くなります。さらに、一次細胞の調製におけるドナー依存的な差異も、研究間で結果の不一致に寄与しています。これらの課題はしばしば過小報告され、プロトコルは標準化が不十分で、再現性を制限しています。本プロトコルは、最適化され再現性の高い治療計画、定義された投与スケジュール、標準化された測定値を提供することで、一次ヒトメラノサイトにおける老化の信頼できる誘導と評価を図ることで、このギャップを埋めています。

テルトブチルヒドロペルオキシド(tBHP)は、活性酸素種を生成し細胞内の抗酸化防御を低下させることで老化を促進する、よく特徴づけられた酸化ストレス誘導剤です。この薬は、細胞の^{生存率を維持し}つつ、皮膚線維芽細胞の老化を誘発するために広く使用され^{ています。}tBHPは定義された生化学的経路を通じて持続的な酸化ストレスを発生させるため、酸化ストレスによる老化の研究や、酸化損傷と老化プロセスの分子メカニズムの研究に再現可能かつアクセス可能なシステムを提供します(^22,23)。UVベースのモデルと対照的に、tBHPは放射線パラメータに依存しず、特殊な装置を必要としない制御された再現可能な酸化ストレス誘導が必要な場合に特に有利です。

HNMは外因性老化メカニズムの研究に関連したモデルを提供します²⁴。包皮由来の一次細胞として、ストレス応答経路を保持し、遺伝子改変や不死化に関連する人工物を避けます²⁵。新生児メラノサイトは、基線損傷が最小限であるため、環境ストレス要因による老化経路の明確な評価を可能にする最適な実験モデルを提供します^26,27。

本研究は、非メラノサイトおよび不死化細胞モデルの限界を克服し、一次ヒト新生児メラノサイトにおけるtBHP誘発酸化ストレスを用いる。メラノサイト特異的な老化メカニズムを調べ、確立されたマーカーを用いた老化表現型の特徴付けを標準化したプラットフォームを提供します。全体として、このプロトコルはメラノサイトにおける酸化ストレス誘発性の老化を研究するための再現可能で生理学的に関連性の高いモデルを提供します。

プロトコル

このプロトコルは、tBHPによるストレス誘発性早期老化のメカニズムを研究するために、ヒト新生児メラノサイト(HNM)の一次研究に最適化されました(図1)。メラノサイトは新生児の白人包皮(淡色素型)から得られ、商業的な供給源から入手されました。供給者の文書によると、ヒト組織は、ヘルシンキ宣言や適用されるデータ保護規則を含む確立された倫理的・法的枠組みに従い、十分に情報を受け同意したドナーから採取されます。細胞は非識別化された形で提供されました。本研究での使用に追加の倫理的承認は必要ありませんでした。すべての実験は一貫性を確保するために同じメラノサイト系統を使用して実施されました。異なる一次細胞株を使用する場合は、培養条件や濃度、取り扱い手順をさらに調整する必要がある場合があります。

1. 準備

注:tBHP治療を開始するには、メラノサイトを少なくとも3日前に解凍し、十分な回復と結合を図る必要があります。処理段階は4日間で、種まき日はDay 0とされています。本研究で使用されるすべての材料の詳細は 材料表に記載されています。

1. 培養培地を準備するために、メラノサイト基礎培地と対応する成長因子を組み合わせます。各バイアルの蓋を炎で加熱してから培地に加え、汚染を最小限に抑えます。調製培地に1%(v/v)のペンストレップを加え、使用まで4°Cで保存します。
2. 種まき前に、大豆トリプシン阻害剤をDPBSで希釈してトリプシン阻害剤溶液を準備します。溶液を0.22μmの膜に通し、アリコート(アリコート)を経て−20°Cで保存します。 解凍後は最大10日間使用可能です。

2. 細胞解凍(3日目)

注意:ヒト細胞に接触するすべての物質は、生物学的に汚染されたものとみなされ、機関のバイオセーフティガイドラインに従って廃棄されるべきです。老化を評価するために、成長停止、SA-β-gal活性、その他の分子マーカーを評価する補完アッセイを用います。ここでは、これらのアッセイのプロトコルと、老化指標を扱う際の予想される結果を紹介します。

1. 室温で50mLの円錐形チューブに20mLのDulbeccoリン酸バッファー生理食塩水(細胞培養グレード)をピペットで移します。細胞入りのバイアルは解凍するまで氷の上に置いたままにしてください。
2. 細胞を入れたバイアルを開ける前に蓋に火をつけ、ネジを外して側面を再度炎で焼き付けて汚染を防ぎます。
3. 細胞入りバイアルに500μLのDPBSを移します。ピペットで上下にピペットして細胞を優しく解凍し、その後全ての内容物をチューブに移します。
4. 室温で100× g の遠心分離機で5分間加熱します。できたペレットはベージュから茶色っぽく(またはドナーの人種によってはより濃い色)に見えるはずです。
5. T75フラスコに14mLのメラノサイト培地を準備します。
6. ガラス製パスツールピペットを火で焼き(メラノサイトを扱う際には毎回炎を点火)、DPBSを慎重に吸引し、ペレットを1mLの培地に再懸浮させます。
7. 用意したフラスコに移します。
8. 37°C、CO₂5%で培養し、毎日顕微鏡で観察します。少なくとも48時間ごとに培地を変えてください。
   注:各クライオ保存バイアルには約1×10〜⁶個の一次ヒトメラノサイトが含まれています。すべての実験は9番目のパッセージの細胞を用いて行われました。

3. 細胞シーディング(0日目)

1. 種まき日に細胞の80〜90%が一致するようにしてください。
2. フラスコから培地を吸引し、DPBSで2回洗います。
3. トリプシン-EDTA溶液2mLを加え、37°C、5% CO₂で5分間培養することで細胞を剥離します。
4. フラスコを優しく叩き、顕微鏡で観察して細胞剥離を完全に確認します(必要に応じて培養時間を延長してください)。
5. トリプシン阻害剤の量を1.5倍にして反応を止めます。
6. 細胞懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移し、DPBSで希釈して最終体積10 mLにします。
7. セルの懸濁液を100× g で5分間遠心分離します。
8. 上澄液を吸引し、所定の容量に再懸濁します。
9. tBHP処理済みの培地の場合、10cm皿あたり6×⁵ セル10個を種まきます。対照プレートの場合は、1枚のプレートに4個×^10個5 セルをシードします。
   注意:tBHP処理済みのプレートについては、実験に十分な細胞数を確保するために細胞密度を高くしてシッドしてください。処理中に増殖速度が徐々に低下するためです。顕微鏡実験のためにカバースリップに細胞をシーディングする場合、カバースリップは0.1 mg/mLのポリDリジンでコーティングされ、細胞シーディング前に完全に乾燥させる必要があります。
10. 37°Cで5%のCO₂で一晩培養します。コントロールプレートは48時間ごとに培地を交換してください。

4. tBHP治療(1日目〜4日目)

1. tBHPの原料(DPBSまたは培地で希釈)から10 mMの作動溶液を準備します。
   注意:TBHPは光に敏感なので、作業時は容器を覆ってください。作動液は、適切に4°Cで保存すれば最大1週間使用可能です。 治療スケジュール:種まきの翌日1日目がtBHP曝露の開始となります。メラノサイトは1日2回、施用間隔は少なくとも4時間空けて処理されます。このレジメンは1日目から4日目まで繰り返し、合計4日間の治療期間です。選定されたtBHP濃度と治療スケジュールは、従来の皮膚線維芽細胞での研究から適応されており、低濃度でも老化を誘発するのに十分でした。しかし、一次メラノサイトでは、強固な老化誘導を達成するためにより高い濃度が必要であり、老化誘導と細胞生存率のバランスを取った滴定実験により、100μM tBHPが最適と特定されました
2. 1回の処理で1時間、細胞に100μM tBHPを加えます(開始時には適切な量の作業液を加え、液体培地にピペットで挿入してください)。
3. プレートを前後や左右に動かして、tBHP(重金属力)を均等に媒質全体に分散させます。
   注意:円運動は金属媒体内でtBHPの分布が不均一になる可能性があるため避けてください。
4. 5%のCO₂を含み、37°Cで正確に1時間培養します。
5. tBHP治療を終了するには、培地を吸引してください。
6. 予熱されたDPBS(37°C)で2回洗盤を洗います。
7. 皿に適量の新鮮な培地を加えます。
8. 細胞をインキュベーター内で少なくとも4時間回復させてから、次の処理を開始してください。
9. 同じ日に2回目の治療も同じ日に繰り返し、残りの日も続けます。処理終了後も9日目まで培養中に細胞を保持し、老化マーカーを評価してください。
10. 制御板と通路が合流している場合は監視してください。

5. 成長曲線解析

1. シーディングプロトコルに従って、tBHP処理細胞と対照群をカウントしてください。
2. tBHPプレートの6個×10個^5個セル より少ない場合は、同じ初期密度またはすべてのセルを再シードしてください。
3. 培養の4日目、9日目、15日目に細胞数を実施。
4. 成長曲線は以下の式で計算します。
   lg (カウント) - log (シード)/ 0.301 + cPDL
   カウント:パッセージの終わりに得られるセルの数。
   シード:通過開始時に最初にプレートされた細胞の数。
   cPDL:累積個体数倍増レベルが前述から引き継がれた数値。

6. SA-β-ガラクトシダーゼ活性

1. 9日目に、PBSで細胞を2回洗浄し、その後2%ホルムアルデヒドと0.4%グルターアルデヒドで固定します。
2. PBSで細胞を2回洗浄します。
3. pH6.0(150 mM NaCl、2 mM MgCl、5 mM フェリシアン化カリウム、5 mM フェロシアン化カリウム、40 mM クエン酸、12 mM リン酸ナトリウム、1 mg/mL 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド(X-gal))の染色液で固定細胞を培養します。
4. CO₂を含まない状態で37°Cで18時間の培養後、PBSで2回セルを洗浄します。
5. 光学顕微鏡による画像。
6. 顕微鏡下で青色染色された細胞の数を数え、その数をフィールド内の細胞数で割って定量化します。結果は陽性細胞の割合で表します。

7. 免疫蛍光染色

注意:ホルムアルデヒド、グルターアルデヒド、パラホルムアルデヒド含有廃棄物は有害化学廃棄物として取り扱い、機関の安全規則に従って処分しなければなりません。

1. 0.1 mg/mLのポリ-D-リジンであらかじめコーティングされたカバースリップ上で培養した細胞を使用します。
2. 9日目には細胞を2回洗浄し、その後4%パラホルムアルデヒドで15分間固定します。
3. PBSで細胞を2回洗浄します。
4. PBS中に0.3%トリトンXと0.1%クエン酸ナトリウムを用いて透過化します。
5. 室温で30分間、PBS-Tに1%のBSAをブロックします。
6. 一次抗体γH2AXを細胞に培養し、加湿チャンバーで4°Cの夜間に恒久的なDNA損傷応答を検出します。
7. 翌日はPBSで2回洗いをします。
8. 室温で1時間の二次抗体を適用します。
9. 希望すればDAPIで核を染色してください。
10. PBS-Tで2回洗浄し、その後PBSで2回、ddH_2Oで2回洗浄します。
11. カバースリップを取り付けて完全に乾かしてから画像撮影をしてください。
12. ImageJソフトウェアを用いて平均蛍光強度および/またはγH2AX焦点を解析します。

8. RNA単離とRT-qPCR

注意:βメルカプトエタノールは非常に有毒で、排気フードで取り扱う必要があります。βメルカプトエタノールを含む廃棄物は有害化学廃棄物として処分されるべきです。

1. 9日目に、2mLのトリプシン-EDTAを使って細胞をトリプシン化します。
2. 反応を止めるために、1.5倍の量のトリプシン阻害剤を塗布してください。
3. 細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機で100 x g で5分間投与します。
4. 上清液を慎重に吸引してください。
5. 1%のβメルカプトエタノールを含む350μLのRLTバッファーに再懸浮させることで、溶成細胞ペレットを生成します。
6. カラムベースのRNA精製キットを用いてRNAを単離します。
7. 分光光度計(260 nm)を使ってRNA濃度を測定します。
8. cDNA合成では、標準的な逆転写ミックス(RTバッファー、dNTP、ランダムプライマー、逆転写ター、RNase阻害剤を含む)を使用し、総反応体積10μLのRNAを1μg使用し、製造元の指示に従って熱循環条件を用います。
9. SASP因子に対してRT-qPCRを実施
   注:選ばれたSASP因子(IL-8、IL-6、MMP-1)は、老化に関連する分泌表現型の確立された構成要素であり、炎症シグナル伝達や細胞外マトリックス再構築を含む皮膚生物学との関連性に基づいて選定されました
   IL-6(前方方向:5' AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3' 回転速:5' TGTCCTGCACCCACTGGTTC 3')
   IL-8(前舷:5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' 回転:5' AAACTGCACCTTCACACAGAG 3')
   MMP-1(前方方向:5' CATCGTGTGTGCAGCTCATGA 3' 回転数:5' ATGGGCTGGAGGAGGATTTTG 3')
   GAPDH(前方:5' GAGTCAACGGATTTGGTCGTGT 3' 回転:5' GATCTCGCTCCTGGGAGAGTG 3')
10. ΔΔCt法を用いて、ハウスキーピング遺伝子GAPDHへの正規化を用いて相対mRNA発現を解析します。

9. タンパク質単離とウェスタンブロット

1. 9日目にはタンパク質の裂解液を採取します。
2. 培地を吸引し、冷たいDPBSでプレートを2回洗います。
3. 150μLのRIPAバッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5% デオキシコレートナトリウム、0.1% SDS、2 mM EDTA)を追加した後、細胞スクレーパーを機械的に用いてプロテアーゼ阻害剤を補足し、1.5 mLのチューブに移します。
4. 凍結と解凍を3回行い、その後氷上で30分間の孵化を行います。
5. 遠心分離機で9600 x g 、4°Cで10分間加熱。
6. BCAアッセイを用いて上清液のタンパク質濃度を測定します。
7. ポリアクリルアミドゲル上に等量(20μg)のタンパク質を分離し、活性化PVDF膜に移します。
8. 5%脱脂乳の膜をTBS-Tでブロックしてください。
9. 一次抗体pRBとLaminB1を4°Cで一晩インキュベートします。
10. 翌日、膜をTBS-Tで3回洗います。
11. HRP結合した適切な二次抗体で室温で1時間インキュベートします。
12. 化学発光によるタンパク質の検出と密度分析を行うこと。

結果

tBHP治療はヒト新生児メラノサイトにおける成長停止を誘発します。
tBHP治療は未治療対照群と比較してメラノサイトの増殖を抑制します(n=3)(図2A)。9日目までに処理細胞は1.4 cPDLにまで到達し、対照群は3.1 cPDLに達します。この分岐は時間とともに拡大し、治療されたメラノサイトは15日目には1.9 cPDLの接合期に近づき、対照群はほぼ5.1 cPDLまで拡大し続けています。増殖能力の持続的な低下は、ストレス誘発性の早期老化表現型と一致しています。

細胞サイズの増加と形態の変化は細胞老化の特徴を強調しています。
tBHPで処理されたメラノサイトは、すべての測定時点(n=3)で対照群と比較して細胞表面積が増加しています(図2B–C)。tBHPと対照群を比較すると、拡大は...

ディスカッション

このプロトコルは、tBHPを用いてヒト新生児メラノサイトにおけるストレス誘発性早期老化(SIPS)を誘導するための標準化されたアプローチを確立し、この細胞型における老化を研究するための堅牢なモデルを提供します。増殖、形態、SA-β-gal活性、DNA損傷マーカー、SASP成分の一貫した変化が誘導表現型を支持します。皮膚生理学や色素沈着障害において重要な役割を果たしているにもかかわらず、老化研究で十分に研究されていないメラノサイトに焦点を当てることで^{、このモデル}はこの分野の重要なギャップを埋めるのに役立ちます。一次メラノサイトにおける酸化ストレスの制御誘導は、これらの細胞がストレスにどのように反応するか、また老化が広範な皮膚老化過程にどのように影響するかを調査するための生理学的に関連性の高いシステムを提供します。

この手法はメラノサイトの老化メカニズムの理解を深めることに寄与します。これは、非メラノ細...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 µm membrane filter	Merck	SLGVR33RS
1 M citric acid	Merck	K91567844	水溶液で調製
1 M MgCl2	Merck	A649033	水溶液で調製
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	水溶液で調製
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	水溶液で調製
37% formaldehyde	Sigma	252549
4% paraformaldehyde	CarlRoth	0335.3
5 M Sodium Chloride	Sigma	S3014	水溶液で調製
50% glutaraldehyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (bovine serum albumin)	Sigma	A7030
Chemiluminescent substrate	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Coverslips for cell culture/microscopy	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal Medium	CellSystems	LM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit	CellSystems	LS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Human neonatal melanocytes	CellSystems	FC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)	Abcam	AB16048	5% BSAで1:1000に希釈
Mounting medium containing DAPI	Abcam	AB104139
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P4333
Polyacrylamide gradient gels	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Potassium ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium ferrocyanide	Sigma	P-9387
pRB antibody (rabbit)	CellSignalling	93085	5% BSAで1:1000に希釈
Protease inhibitor cocktail	自家製	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer	自家製	N/A	含有：50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT buffer	Qiagen	1015762	RNeasy Mini Kitに含まれる
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)	Sigma	70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)	Sigma	S4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)	Sigma	T9284
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-mercaptoethanol	CarlRoth	4227.3
γH2AX antibody (rabbit)	CellSignalling	2577S	1:200に希釈