片側性虚血再灌流損傷および遅延性対側腎摘出術 による 腎線維症のマウスモデル確立

サマリー

ここでは、片側虚血再灌流損傷と遅延性対側腎摘出術を用いて、腎線維症のマウスモデルを構築するプロトコルを提示します。この戦略により、AKIからCKDへの移行の縦断的研究や、エンドポイントにおける残存腎機能の正確な評価が可能になります。

要約

腎虚血再灌流損傷(IRI)は急性腎障害(AKI)に寄与し、慢性腎疾患(CKD)への進行の主な要因です。不適応修復および線維化メカニズムの評価を促進するためには、再現可能な動物モデルが必要です。本研究では、片側虚血再灌流損傷(uIRI)と対側腎切除術(CNx)によって確立された腎線維症の標準マウスモデルを報告します。この戦略は、病気進行中の長期的な動物生存を確保しつつ、収穫時の損傷した腎臓の残存腎機能の正確な評価を可能にします。雄のC57BL/6マウスは37°Cで28分間温かい虚血状態に曝され、各研究エンドポイントの24時間前にCNx検査が行われました。マウスは、IRI後2日、5日、1週間、2週間、3週間、4週間の時点で、組織学的および免疫組織化学的評価のために生贄にされました。術後2日目と5日目には、主に腎臓に細管壊死が見られ、特に皮質髄髄膜接合部に見られましたが、間質性線維症の証拠はありませんでした。手術から1週間後から、これらの病理的特徴は炎症性細胞浸潤と早期の管萎縮に置き換えられました。間質性線維症も現れ、2週目には重症度がピークに達しました。手術後3週目と4週目にかけて、腎臓に広範な管状萎縮が見られ、使用不足と一致しました。注目すべきは、間質性線維症が2週目と比べて減少し、静止性かつ低細胞瘢痕期への進行を示していることです。このモデルは、AKIからCKDへの移行の臨床シナリオを効果的に再現し、線維化メカニズムの探究や治療的介入のスクリーニングのための信頼できるプラットフォームを提供します。

概要

腎虚血再灌流損傷(IRI)は、^{臨床現場における}急性腎障害(AKI)を引き起こす重要な要因の一つです。一般的な病因には、腎移植(冷・温性虚血の後にドナー腎の再灌流を伴う)、一時的な血管閉塞を必要とする心血管または腎臓手術、重度の外傷、大出血、または敗^血症2による全身低灌流状態が含まれます。

IRIの病態生理は複雑な二相性過程を含みます。初期の虚血期には、酸素や栄養供給の遮断により代謝障害、ATP枯渇、腎管上皮細胞(TEC)の細胞骨格障害が起こります³。その後、再灌流中の血流回復は虚血組織の救済に必要であるものの、より複雑な「二次的攻撃」を引き起こします。⁴ この損傷の段階は、活性酸素種(ROS)の爆発による酸化ストレス、内皮機能障害、好中球やマクロファージなどの炎症細胞の大量浸潤、^{補体の活性}化など、一連の出来事によって駆動されます。これらの複雑なカスケードが集団としてTECsのアポトーシスと壊死を悪化させ、AKIの主な病理的症状を形成します。

注目すべきは、IRIは急性で可逆的な損傷に限られません。十分な証拠は、腎IRI後の不完全または不適応な修復が長期慢性病態への移行を駆動する中核的なメカニズムであることを示しています。生理学的条件下では、腎臓はAKI後に修復プログラムを開始し、損傷した細胞を効果的に除去し、残存TECの増殖と分化を促進して損傷した細管の構造と機能を回復させます。しかし、重度または繰り返しのIRI損傷の後、この修復過程が調節不全となり、最終的には卵管萎縮、腎間質性線維症、慢性腎疾患(CKD^)の進行と進行を加速させる可能性があります^5,6。

したがって、AKIからCKDへの移行メカニズムの解明と治療的介入の開発が緊急の課題です。齧歯類モデル、特にマウスモデルは、 生体内で 不可欠かつ不可欠な存在となっています。明確な遺伝的背景とヒトの疾患進行との類似性から、IRI後線維症の研究に向けたツールです。しかし、現在のIRI手法には(例:虚血の持続時間、体温管理、片側性か両側性損傷)に大きな異質性が存在し、再現性が低く、研究間比較可能性も限られています⁷。

これらの課題に対応するため、本研究では修正された片側虚血再灌流損傷(uIRI)モデルの標準化されたプロトコルを詳細に示しています。また、このプロトコルには研究評価項目の24時間前に実施された対側腎摘出術(CNx)も含まれています。この戦略は両側虚血に伴う高い死亡率を克服しつつ、損傷した腎臓の残存腎機能や線維化進行の正確な評価を可能にします。このモデルは、AKIからCKDへの動的な移行を正確に再現し、堅牢な in vivoを提供します。 機構的探求と治療スクリーニングのためのプラットフォームです。

プロトコル

すべての動物実験は、実験動物に関する事務管理規則に従って実施されました。この実験プロトコルは、広州ジェンニオバイオテック有限公司の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました(承認番号:ジェニオ-IACUC-2025-A053)。すべての処置は、実験動物のケアと使用に関するガイドおよび機関のガイドラインに厳格に従って行われ、3R原則に完全に従っています。研究のタイムライン、犠牲のポイントやサンプル採取は 図1にまとめられています。

1. 動物および器具の準備

1. 研究には、特定の病原体フリー(SPF)施設に飼育された雄のC57BL/6マウス(生後8週、体重20〜25g)を使用します。
2. マウスをランダムにuIRIグループとシャムグループに分けます。6つの指定された時間点(2日、5日、1週間、2週間、3週間、4週間)それぞれに、グループごとにn=4匹のマウスを割り当てます。
   注:マウスは12時間の光と12時間の暗いサイクルで飼育され、餌と水は自由に利用されていました。実験の少なくとも1週間前から実験室環境に慣れさせていました。
3. すべての手術器具を滅菌してください 。使用前に高圧蒸気オートクレーブ処理。
4. 体温を37.0°C±0.5°Cに厳密に維持し、直腸プローブを備えた恒温モニタリングシステムで継続的な体温モニタリングを行います。麻酔誘導直後に潤滑プローブを直腸に挿入し、処置中ずっとそのままにしてください。
5. 小動物用ガス麻酔システムを用いてイソフルラン(誘導時5%、維持時1.5%、校正済み蒸気器 による 酸素流量1.0 L/min)でマウスを麻酔します。
   注意:足の引き込み反射がないことで深麻酔を確認してください。すべての外科的処置は、マウスが深麻酔状態に達した後にのみ行われなければなりません。
6. 左側背側の毛を剃りましょう。

2. 手術

1. uIRIモデル(第0日目)
   1. マウスを右側のデキュビトゥスに位置させ、左側面を露出させます。
   2. 左背中に1cmから1.5cmの縦皮膚切開を行い、その後筋肉切開で後腹膜空間に入ります。
   3. 生理食塩水で湿らせた滅菌綿棒で左腎臓を優しく押し出します。
      注意:腎臓は腎周脂肪パッドを操作するか、滅菌綿棒を使用してのみ移動させるべきです。鉗子は腎臓表面に触れてはいけません。
   4. 腎根を細かい鉗子で慎重に切り離し、腎動脈と静脈を周囲の結合組織から隔離します。
   5. 外傷性のない血管マイクロクリップで左腎脚を挟み、虚血を誘発します。
      注意:腎基郭解離は清潔かつ完全に行う必要があります。この処置では尿管はクランプの適用から明確に除外されるべきです。不注意な尿管クランプは、ハイブリッドIRI/片側尿管閉塞(UUO)損傷を引き起こし、永久的な閉塞性成分を導入する可能性があります。
   6. クランプをした直後にタイマーを始めてください。虚血の持続時間は厳密に28分に設定されています。
   7. 虚血を目で確認してください:腎臓の色は数秒で明るい赤から濃い紫に変わります。
   8. 腎臓を温かい生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで覆います。
   9. 28分後にクランプを外して再灌流を開始します。
   10. 再灌流を目で確認してください:腎臓の色は数分以内にピンクや赤に戻るはずです。
   11. 腎臓を優しく腹腔に戻します。
   12. 筋肉層は5-0吸収性縫合糸で閉じ、皮膚切開部は5-0ナイロン縫合糸で閉じます。
2. シャム作戦(0日目)
   1. 2.1ステップで説明した麻酔、切開、腎臓外出の手順を同じように行います。
   2. 腎ペディクルを切り離しますが、血管を挟まないでください。
   3. 腎臓を同じ期間(28分)外側に置いたまま、その後腹腔に戻して切開部を閉じます。
3. CNx手術
   注意:各グループごとに予定されたサンプル採取エンドポイントの24時間前にCNxを実施し、損傷した腎臓の残存機能を評価してください。
   2日間のグループでは、IRI後1日目にCNxを実施してください。
   5日間のグループについては、IRI後の4日目にCNxを実施してください。
   1週間のグループについては、IRI後6日目にCNxを実施してください。
   2週間のグループについては、IRI後13日目にCNxを実施してください。
   3週間のグループでは、IRI後20日目にCNxを実施してください。
   4週間のグループについては、IRI後27日目にCNxを実施してください。
   1. ステップ1.5で説明した通りにマウスを麻酔します。次に、右背側の毛を剃り、消毒します。
   2. 右側に小さな脇腹切開をして、右の腎臓を露出させます。
   3. 右腎臓を外側に開出し、腎脚を優しく切り離してください。
   4. 腎脚(動脈、静脈、尿管)を4-0非吸収性シルク縫合糸でしっかりと結紮します。
   5. 結紮の先位にある右腎臓を切除してください。
      注意:切断部からの活発な出血がないか確認してください。
   6. 脚根を腹腔に戻し、ステップ2.1.12で説明した通り切開部を閉じます。
   7. マウスが温熱パッドで回復するのを待ちましょう。

3. 術後ケアとモニタリング

1. マウスは意識と動きが完全に回復するまで温熱パッドの上に置いておく。
2. ネズミは清潔なケージに戻し、簡単に手に入る餌と水を用意してください。
3. マウスの健康状態を毎日監視してください。
   1. 毎日死亡率をチェックしましょう。
   2. グルーミングの変化、痛みや苦痛の兆候、姿勢を監視してください。
   3. 切開部に感染、炎症、裂け目の兆候がないか検査してください。

4. 術後評価

1. サンプル採取
   注:マウスはIRI後2日、5日、1週間、2週間、3週間、4週間の指定時点で生贄として生贄を置き、損傷および線維化の進行状況を評価しました。
   1. マウスには3%イソフルランで麻酔します。
   2. 必要に応じて血清生化学分析のために血液サンプルを採取してください。
   3. マウスは子宮頸部脱臼で安楽死します。
   4. 左腎臓(負傷した)を素早く摘出してください。
   5. 腎組織を切開する:一部を市販の4%パラホルムアルデヒドで固定し組織学的分析を行い、残りの組織を液体窒素で急速凍結して-80°Cで分子分析のために保存します。
2. 組織処理と切片
   1. FeldmanとWolfe⁸が説明した組織処理プロトコルに厳密に従い、脱水・透明化・埋め込みをパラフィンワックスに埋め込む。
   2. パラフィンブロックを4μmの厚さでロータリーマイクロトームを用いて切片します。
   3. 組織切片をガラススライドに取り付け、60°Cで2時間焼いて組織の接着を確保します。
3. ヘマトキシリンと嗜酸(H&E)染色
   1. 組織スライドをキシレンで脱硫し、降下順にエタノール系列を経て蒸留水に再水和させます。
   2. 形態的損傷を評価するためにH&E染色を行います。FeldmanとWolfe⁸による標準化されたプロトコルに詳細に記載された染色および洗浄工程を正確に実行してください。
   3. 染色したスライドを脱水し、クリアし、樹脂性のマウントメージでカバースリップします。
4. マッソンのトリクロム染色
   1. 組織切片を脱水・再水和して蒸留水にします。
   2. 媒染剤、核染料、細胞質染料、コラーゲン染料を順に適用し、コラーゲン沈着と腎線維症の評価を行います。IslamとKumar⁹で定められた正確な試薬の培養時間と洗浄手順に従ってください。
   3. スライドをすすぎ、脱水、クリア、カバースリップで顕微鏡観察を行います。
5. 免疫組織化学(IHC)
   1. 組織切片を脱硫し、再水和させます。
   2. Magakiらの説明通り、0.05%トゥイーン-20(pH6.0)を含む10 mMクエン酸ナトリウムバッファーを使用して熱誘起エピトープ回収^{を行います。}
   3. 3%過酸化水素で切片を培養することで内因性過酸化酵素活性を阻害します。
   4. 5%牛血清アルブミンをPBSで室温で30分間ブロックします。
   5. 切片を抗α平滑筋アクチン(α-SMA)の一次抗体(希釈1:400)で4°Cで一晩インキュベートします。
   6. スライドを洗浄し、室温で二次抗体と1時間培養します。
   7. DABを用いて標的抗原を可視化し、マガキらの手順に従いヘマトキシリンでカウンター染色します。¹⁰。
   8. 脱水し、クリアし、最終画像撮影のためにカバースリップを装着します。

5. 統計分析

1. すべての定量データは平均±標準偏差(SD)として提示してください。
   注:統計解析およびグラフ生成はGraphPad Prismソフトウェアバージョン10.0を使用して行われました。複数のグループ間の差異と単一の対照群(Sham)は、通常の一方向分散分析(ANOVA)を用いて解析し、その後ダネットの多重比較検定を用いました。P値は<統計的に有意とみなされ、P値は統計的に有意<とされました(*P 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P. < 0.0001)。NSは有意な違いを示さない。

結果

実験期間全体を通じて、シャム群とuIRI群の両方で生存率は100%でした(n=各4人)。初回のuIRI手術およびその後の遅延CNx手術では死亡は観察されませんでした。この結果は、通常尿毒症による死亡率が高い両側性虚血モデルと比較して、この二段階プロトコルの高い安全性プロファイルと信頼性を裏付けています。

H&E染色、マソン染色、およびα-SMAに対するIHC染色は6つの時点で実施され(図2)、腎病変の動的変化を調べました。定性的組織病理学に加え、マッソンのトリクロム切片(コラーゲン陽性面積の割合)に対する線維化面積の定量的形態計測解析と、間質α-SMA信号の定量化、そして時間点を超えた統計的比較が行われました(図3C,D)。

偽グループの腎臓は正常な皮質および髄質構造を示しました。異常なコラーゲン沈着や間質性...

ディスカッション

本研究では、uIRIを用いた腎間質性線維症のマウスモデルを構築する標準化されたプロトコルを記述し、その後、研究エンドポイントの24時間前にCNxを実施しています。動的組織病理学スクリーニングにより、明確な病理学的段階が明らかになりました。急性卵管壊死は2〜5日以内にピーク発生し、その後1〜2週間で活動性線維新生および筋原線芽細胞活性化がピークを迎え、特に3〜4週目には組織が安定したコラーゲン沈着を伴う慢性期に移行し、間質性α-SMA発現の著しい低下が見られました。本研究で用いられたマウスモデルは、AKIからCKDへの移行の有効なモデルを示し、組織学的進行と残存腎機能の相関を可能にします。

uIRIモデルの再現性は^{環境要因に}非常に敏感であることが示されています7。まず、体温維持は怪我の重症度を決定づける最も重要な要素の一つであり、温度は厳格に37^°Cで維持され^ていま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗アルファ抗体	プロテインテック	14395-1-AP	IHCで用いられる一次抗体は、&α;-SMA発現を検出し、筋線維芽細胞の活性化を評価するために使われます
血尿素窒素(BUN)アッセイキット	南京建成生物技術研究所有限公司	C013-2-1	残存腎機能評価のための血清BUNレベルの定量化に使用されました
クレアチニン(CRE)アッセイキット	南京建成生物技術研究所有限公司	C011-2-1	残存腎機能評価のための血清クレアチニンレベルの定量化に使用されました
ガス麻酔システム	南京カルビンバイオテクノロジー有限公司	KW-MZJ-4	全身麻酔用のイソフルランを装備
GraphPad プリズムソフトウェア	グラフパッド・ソフトウェア株式会社	該当なし	統計解析およびデータのグラフィカルな表現に使用(https://www.graphpad.com)
恒温モニタリングシステム	科学の実践	CS-HS-0001	直腸プローブを装備し、閉ループで連続的な体温モニタリングと調整を行います
ImageJソフトウェア	国立衛生研究所	該当なし	線維化領域およびIHC信号の形態計測に用いられるオープンソースソフトウェア
イソフルラン	RWDライフサイエンス株式会社およびnbsp;	R510-22	手術中に使用される吸入麻酔薬
マッソンs トリクローム染色キット	ビヨタイム	C0189M	コラーゲン沈着を定量化するために
外傷性のない血管マイクロクリップ	ロボズ外科機器会社	RS-5481T	腎ペディクルを28分間クランプするために使用しました
パラホルムアルデヒド(4%)	ビヨタイム・バイオテック株式会社	P0099-100ml	採取した腎臓組織サンプルの迅速な固定に使用されます
クエン酸ナトリウムバッファー(10 mM、pH 6.0)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック社およびnbsp;	005000	免疫組織化学染色前の熱誘導エピトープ回収に使用されます
立体定位外科顕微鏡	北京中天広正科技有限公司	TS-39NK	IRI手術の実施に使用