方法論記事

ツノメガピスのミニ胚を生成するための物理的操作

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DOI：

10.3791/70602

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2026年4月10日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

この記事について

サマリー

アフリカ ツメガ エルの1細胞胚からミニ胚を作る物理的収縮法を記述します。

要約

早期胚発生の特徴は、胚の体積が一定のままである一方で、個々の細胞サイズが急激かつ指数関数的に減少することです。核細胞質(N:C)比率は、早期胚発生に不可欠な細胞および分子活動の調節に重要な役割を果たします。したがって、胚のサイズの物理的操作は、これらの発生メカニズムを調査する重要な方法を示しています。ツ メガエル の初期胚は直径1.2mmの大きさと高い発生可塑性を持ち、発達の調節機構を探るための物理的解剖や操作に理想的なモデルとなっています。ここでは、毛結び目を持つ1細胞の ゼノップス・ラエビス 胚を収縮させることで、細胞質体積とN:C比率が変化したミニ胚を生成する手法を説明します。得られたミニ胚は、細胞サイズの縮小とN:C比率の成長によって直接誘導される早期受精ゲノム活性化(ZGA)を開始することが示されています。これらのミニ胚は他の胚システムにも一般化できるため、初期胚発生の大きさ媒介メカニズムを解明するための独自で強力なツールを提供します。

概要

初期胚発生の最も顕著な特徴の一つは、一定の体積を維持する胚内で個々の細胞サイズが指数関数的に減少することです。急速なDNA合成と細胞サイズの縮小により、核細胞質比(N:C比)が増加し、これは接合遺伝子転写、細胞周期延長、細胞運動率1,2,3,4など、モデル胚系における中間胚盤遷移(MBT)のいくつかの特徴的な活動の調節に重要な役割を果たします.DNA倍数変化によるN:C比率の操作は、複数のモデルシステム3,4,5,6における初期胚発生における機能的重要性を支持しています。

胚のサイズの物理的操作は、初期胚発生における調節機構を研究する重要な技術です7。吸引による細胞質除去は、初期マウス胚のN:C比を変化させ、早期圧縮を誘発します。さらに、ゼブラフィッシュ胚のサイズをチョッピングで縮小したことで、勾配に基づく新しいソマイトスケーリングのメカニズムが明らかになりました。さらに、 ツメガエル 胚の細胞質体積を減少させることで、N:C比率に依存する細胞周期の動態が明らかになりました10。重要なのは、細胞サイズを縮小してツ メガエル のミニ胚を作り出し、単一細胞で新生転写産物を5-エチニルウリジン(5-EU)で標識することで、細胞サイズを縮小することで線量依存的に接合ゲノム活性化(ZGA)を誘導することを示したことです(11)。これらの結果は、早期胚形成における細胞サイズの重要な役割を支持しています。

ここでは、毛の結び目を用いた物理的操作によるツメガエルのミニ胚を生成する詳細な手順を説明します(図1)10,11。このアプローチは、NewportとKirschner(1982)による初期ゼノップス胚1に対するヘアループ収縮の基礎的利用を基盤とし、実験ツールとしてミニ胚を生成する明確で信頼性の高いプロトコルを提供します。さらに、この方法は他の胚システムにも適用可能であり、早期胚発生の新たなメカニズムの解明を容易にします。

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プロトコル

ここで述べる動物の活動は、サウスカロライナ大学の動物管理・利用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 材料の準備

  1. 解決策の準備
    1. 20×MMRは100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl2、40 mM CaCl2を混合して準備します。NaOHでpHを7.8に調整してください。オートクレーブして常温で保存します。
    2. 3%密度勾配培地(wt/vol)溶液を、1.5gの密度勾配培地を0.5× MMRの50mLに混ぜて調製します。磁気かき棒で優しくかき混ぜてポリマーが溶けるまで続けます。使用まで4°Cで保ちます。
    3. 60mmペトリ皿に1%アガロースゲルを、0.5gのアガロースを0.1× MMRの50mLに混ぜて調製します。電子レンジで加熱してアガロースを溶かし、その後5mLのアガロースを加えて60mmのペトリ皿の底に薄い層を塗ります。
  2. 収縮する胚のための毛結びの準備
    1. 細い毛をいくつか取って、5cmほどの大きさに切ります。
    2. ピンセットを使って、髪の片端を深さ約~1cmのP10型の先端に差し込みます。
    3. スプーンにワックスをつけて温めて溶かします。髪の毛で付いたP10の先端をワックスに素早く浸し、1分間乾かします。P10の先端で毛が固定されていることを確認してください。
    4. ピンセットを使って、髪を優しくオーバーハンドの結び目にします。ループのサイズを~1.5mmに調整します。必要に応じて張り出しを切り詰めてください。結び目は後で使うために脇に置いておきましょう。
    5. 必要に応じて上記の手順を繰り返して、さらに髪の結び目を作ります。

2. ツメガエル のミニ胚の作り方

  1. ツノメガエルの胚を入手するには、標準的なプロトコルに従って体外受精(IVF)を行う必要があります(例:Siveら、2007年参照)12。胚は0.1×MMRで、使用準備が整っているはずです。
  2. 初期胚の単一細胞でZGAを可視化し、その調節機構を研究するために、1細胞期胚に5-エチニルウリジン(5-EU)をマイクロインジェインし、新生転写産物11,13を代謝的に標識し、その後次の手順を進めます。
  3. 胚が受精後~1時間(hpf)の時点で、プラスチックトランスファーピペットを用いて、60mmペトリ皿(1%アガロースゲルで覆われた)に~15mLの3%密度勾配培地/0.5×MMRを含んで移植します。
  4. 片手にピンセットを使い、胚を立体顕微鏡で約45〜60度回転させて植物極(淡色半球)にアクセスします。傾いた胚をピンセットで持ち、もう一方の手に30Gの針で慎重に植物の棒を刺します。胚を優しく押さえて細胞質を放出します。
  5. 胚にP10の先端で取り付けた毛結び目を慎重に覆い、動物の棒(暗い半球)が毛の結び目の中に入るようにします。望むミニ胚のサイズに合わせて結び目の位置を調整します。
  6. 片手でP10ピペットを持ち、もう片手でピンセットで結び目の両端を反対方向に引っ張ります。毛の結び目は胚の周りにきつく締まり、動物の極(そのまま)と植物極(細胞質が放出された状態)の間にあります。P10の先端につながる部分で毛の結び目を切り落とします。
  7. 上記のステップ2.4–2.6を繰り返し、望ましい数のミニ胚を作成します。
  8. 胚は3%密度勾配培地/0.5×MMRで~1〜2時間待機させます。その後、胚を乱さずにP1000ピペットで培地を取り出し、0.1× MMRの15mLを補充します。
  9. 胚を望む段階に育て、ピンセットで慎重に結び目を外します。
  10. 胚を採取し、単一細胞でのZGAの可視化など、望ましい分析のために11,13。

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結果

1細胞段階のツメガエルの胚は、上記のように毛の結び目で収縮していました。対照胚とミニ胚は~ステージ9(23°Cで8.5 hpf)で立体顕微鏡で画像化されました。図2に示すように、一部のミニ胚の体積は対照胚の体積の~1/3です。この結果は、初期のツメガエル胚を操作してミニ胚を生成できることを示唆し、細胞大きさが初期胚発生中の細胞周期10およびゲノム活性化11の動態に与える影響を研究する独自のモデルを提供します。このモデルはまた、初期胚発生の調節メカニズムを検証する際に有用なツールとなり得ます。

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ディスカッション

ここでは、ツ メガエル の1細胞期胚を毛の結び目で物理的に収縮させることでミニ胚を生成する方法を説明します。このアプローチは、細胞サイズの縮小がモデル胚11においてZGAを誘導するという直接的な証拠を提供します。

このプロトコルのいくつかの側面は、ミニ胚の生成に成功するために重要です。髪の結び目を作るには、細くて丈夫な髪、できれば赤ちゃんの髪を使うことが大切です。毛が太く繊細なほど、結び目を作ったり使ったりするのは難しくなります。さらに、ヘアダイや人工軟化剤で処理された髪は、胚に有害になる可能性があるため避けるべきです。また、一部の外科的縫合はヘアノットよりも高価ですが、胚を収縮するためにも使われることがあります。ただし、材料によっては、ミニ胚を作る前に強度や柔軟性をテストする必要があります。

収縮する前に、核が得られたミニ胚に含まれるように、毛結び目を胚に位置付けることが重要です。雌前核は動物...

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開示事項

著者は競合する利害関係を一切主張していない。

謝辞

ペンシルベニア大学のマシュー・グッド研究室の研修に感謝します。この研究は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立児童健康・人間発達研究所(R03HD105802)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30G針BDメディカル305128胚を刺すために
60mm使い捨てペトリ皿VWR25384-092胚の孵化に関して
ACCU-SCOPE 3075 ズームステレオ顕微鏡VWR470351-130胚の可視化のために
アガロースシグマ・オルドリッチA-9414ペトリ皿のコーティング用
デュモント・ピンセット、スタイル5電子顕微鏡科学72701-D胚の調整と保持のために
フィコル400シグマ・オルドリッチGE17-0300-10胚の孵化に関して
TipOneピペットチップ、10&マイクロ;LUSAサイエンティフィック1111-3700髪の結び目を取り付けるための
ワックスブロック、黒キャロライナ・バイオカル・サプライ社974228髪の結び目を取り付けるための

参考文献

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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