頭蓋内乳がん脳転移マウスモデルは髄膜および嗅球における免疫および間質細胞の特徴付けに用いられています

サマリー

このプロトコルは、頭蓋内予防接種を通じて乳がんの脳転移を特定し、脳免疫を調節する主要なリンパおよび免疫細胞のサブセットをフローサイトメトリーで特徴づけます。これらの解析は、脳の微小環境を形作る免疫および間質細胞の動態に関する洞察を提供し、新たな治療戦略の開発に寄与します。

要約

中枢神経系(CNS)は、髄膜や嗅球などの特殊な免疫インターフェースに囲まれており、これらは転移性定着の許可経路であると同時に、抗腫瘍免疫応答の入口としても機能します。転移進行中にこれらの構造内で免疫細胞の動態がどのように進化するかを理解することは、脳内の腫瘍成長を支えるか制限するかのメカニズムを特定する上で不可欠です。このプロトコルは、E0771乳がん細胞をC57BL/6マウスに頭蓋内注射することで乳がん脳転移(BCBM)マウスモデルの確立を詳細に行っています。腫瘍発生後、髄膜と嗅球は慎重に解剖され、酵素的に消化され、単細胞懸濁液として処理されます。これらの集団は、多パラメータスペクトルフローサイトメトリーを用いて解析され、CNS関連免疫ニッチ内のリンパ、骨髄、間質細胞のサブセットを包括的に特徴づけます。このワークフローにより、腫瘍を持つ対照群と非腫瘍対照群の比較解析が可能となり、腫瘍免疫回避の基盤となる中枢神経系免疫界面の変化を特定し、潜在的な治療標的となる可能性があります。全体として、このプロトコルはBCBMの研究とCNSと末梢免疫系の界面における免疫調節の検証に再現可能なアプローチを提供します。追加のがん細胞株、免疫療法、または遺伝子マウスモデルに適応し、脳の微小環境における免疫抵抗機構や治療応答を調査することが可能です。

概要

脳転移は中枢神経系(CNS)に影響を及ぼす最も一般的な悪性腫瘍であり、原発性脳腫瘍よりも頻繁に発生します。肺がん、乳がん、メラノーマは、最も頻繁に脳に転移する主要ながんです^。これらの中でも、乳がん脳転移(BCBM)は主要な臨床課題であり、転移性患者の10%〜30%に影響を及ぼし、全身療法の改善や神経画像技術の進歩により発生率が増加しています^。BCBM患者の予後は依然として悪く、利用可能な治療法(手術、放射線療法、化学療法など)は主に緩和的であり、神経症状は生活の質に深刻な影響を与えます^。標的治療と免疫療法は補完的な戦略として検討されていますが、脳転移における免疫療法の臨床的利益は依然として限定的です ^4,5,6。

最近の研究により脳免疫の理解が深まり、髄膜⁷ や鼻粘膜⁸のリンパ管を含む中枢神経系に関連する機能的リンパ経路への関心が再燃しました。これらの構造は脳を取り囲む連続したリンパネットワークを形成し、嗅球と篩板に隣接し、最終的には頸部リンパ節に接続します。このシステムは、中枢神経系と末梢リンパ系器官間の流体恒常性、免疫監視、免疫細胞輸送において重要な役割を果たし^ます。脳腫瘍や転移に対する免疫療法への関心が高まる中、これらのリンパ-免疫インターフェースは、全身免疫が頭蓋内病変と相互作用する有望な経路として浮上していますが、まだ十分に研究されていません。さらに、免疫細胞が脳腫瘍微小環境に誘導されるメカニズムや、これらの細胞がこの独特な環境内でどのように相互作用するかについても、まだ十分に解明されていません。これらのギャップは、腫瘍と免疫の相互作用を包括的に分析し、脳転移に対する抗腫瘍免疫を改善する戦略の開発を支援する前臨床モデルと手技の必要性を強調しています。

ここでは、E0771細胞の立体的頭蓋内接種を用いて再現可能で免疫能力のあるBCBMマウスモデルの生成と、髄膜および嗅球の分離および解離によるスペクトルフローサイトメトリーによる免疫表現型解析を組み合わせたプロトコルを説明します。このアプローチにより、BCBMの制御モデリングにより治療介入の安全性と有効性を評価でき、脳リンパ-免疫界面における免疫および間質集団の詳細な特徴付けが可能となり、脳腫瘍の微小環境を形成し治療反応に影響を与える細胞の関与者について洞察を提供します。

動物モデルは脳転移の研究に欠かせません。なぜなら、転移進行の多くの重要な側面は 体外で再現できないからです。脳転移を生成するためにいくつかの 生体内 マウスモデルが開発されており、それぞれに特有の利点と制限があります。¹⁰.自発転移モデルは、オルトトピックインプラントや遺伝子操作マウスモデルなどで、臨床疾患の進行により近いものの、頭蓋内病変をほとんど発生させず、長い実験的タイムラインを必要とし、広範な頭蓋外疾患のために高い変動をもたらすことが多いです。心臓内注射、頸動脈内注射、尾静脈注射などの全身的アプローチは、腫瘍細胞を循環に導入し、血原性の拡散、血脳関門の漏出、定着をより効果的に模倣します。しかし、これらのモデルは原発性腫瘍浸潤の初期段階を捉えておらず、特に肺において広範かつ変動する頭蓋外転移を頻繁に生じさせます。全身モデルの中では頸動脈内注射が最も変動が少ないですが、高度な外科的専門知識が必要です。また、頭蓋内注射は腫瘍位置の正確な制御、腫瘍の迅速かつ再現性の高い発生、実験間の変動性の低減など、いくつかの利点を提供します。このアプローチは、転移経過をより正確に模倣するために、原発腫瘍の直位性腫瘍移植と外科的切除を組み合わせることもあります。頭蓋内注射は転移の全カスケードを再現するものではなく、早期浸潤や転移の研究には適していませんが、確立された病変に対する治療効果の評価や脳微小環境内の相互作用を調査するための堅牢なモデルを提供します。既知の制限としては、注射自体が局所的な神経炎症を引き起こし、免疫指標に影響を与える可能性があり、注射済みマウスと非注射マウスの免疫プロファイルを比較することで評価できます。

髄膜および嗅球の免疫特性解析は、依然として比較的新しく、十分に研究されていない分野です。ほとんどの研究は脳全体または子宮頸部のリンパ節サンプル¹¹に依存しており、これらのリンパ関連組織の細胞組成や専門的な免疫機能を捉えきれていません。両方の構造を回復することで、脳免疫についてより広く、かつ有益な視点が得られます。マルチパラメトリックスペクトルフローサイトメトリーと組み合わせることで、このワークフローはCNS末梢免疫コミュニケーションに関与する豊富かつ希少な免疫細胞集団の高スループットプロファイリングをサポートします。これには、細胞のサブセットの特定、活性化状態の評価、治療による変化の評価など、表面および細胞内マーカーの定量化が含まれます。このプロトコルでカバーされていない他のCNS免疫解析の方法には、免疫組織化学(IHC)や免疫蛍光法(IF)があり、これらは免疫細胞の空間的分布を保持しますが、マーカーの多重化が低く、主観的定量化が少なく、希少細胞の過小代表によって制限されます¹²。近年では、単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)により、高解像度で細胞状態や転写プログラムの発見が可能となり、CNS免疫集団のプロファイリング能力が拡大しています。強力なトランスクリプトム的洞察を提供する一方で、scRNA-seqはコスト、解離アーティファクト、転写本のドロップアウト、タンパク質レベル分解能の低下に制限されています^13,14。フローサイトメトリーは空間解析を欠き、解離関連の影響に敏感ですが、高度な多パラメータパネルを通じて優れた表現型解像を提供し、堅牢な定量的免疫プロファイリングを提供します。

ここで述べた手法は、中枢神経系リンパ界面におけるBCBMのモデリングと免疫動態の検証に柔軟かつ強力なプラットフォームを提供し、脳腫瘍微小環境およびそれに関連する免疫調節経路の両方を標的とした治療の前臨床開発を支援します。

プロトコル

すべての動物処置はリスボン大学薬学部のガイドラインに従って行われました。これらのプロトコルは、ポルトガルの動物保護権限当局であるDireção-Geral de Alimentação e Veterinária(リファレンス0421/000/000/2021)によって審査・承認されました。

1. 生体内 移植のためのE0771細胞の準備

1. 滅菌フード内で、E0771細胞をT75フラスコで培養し、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10%(v/v)胎児牛血清(FBS)と1%(v/v)ペニシリンおよびストレプトマイシン(PEST)を補足します。
   1. 供給者からの受領時にSTRプロファイリングで細胞が認証され、定期的な検査でマイコプラズマフリーであることを確認しましょう。脳移植前に解凍後少なくとも2〜8回分の腫瘍細胞を培養します。
2. 着床当日には、細胞が健康で80〜90%の合流率を保ちます。培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。
3. フラスコにトリプシンを加え、37°Cで5分間培養します。 次に、補給培地(DMEMに10% v/v FBSおよび1% v/v PESTを含み)を3倍の量に加え、トリプシンを中和し細胞を解離させます。
4. 細胞をチューブに移し、室温(RT)で300 x g の遠心分離機で5分間投与します。上清液を取り除き、ペレットをPBSに再懸浮させて細胞計数を行います。
5. 再び遠心分離機(300 x g で5分間)、上清液を廃棄し、1 x 10⁵ E0771細胞を2 μLに2 μLで PBS 中に再懸濁します。腫瘍接種まで細胞懸濁液を冷やしておきましょう。注射直前に細胞懸濁液を準備してください。

2. 立体誘導装置を用いた頭蓋内腫瘍接種

1. 6〜8週間齢の雌のC57BL/6マウスを入手し、手術の少なくとも7日前から動物施設に慣れさせてください。家ネズミは12時間の明暗サイクルで管理され、 自由に餌や水を与えてください。
   注:腫瘍保有疾患と対照疾患間の意味のある比較免疫プロファイリングに十分な統計的検出力を確保するために、実験群あたり最低5頭の動物を推奨します。
2. 手術開始前に手術部位と必要なすべての材料を準備してください:
   1. 手術器具:メス刃、ハサミ、鉗子、針ホルダー、縫合ワイヤー。
   2. 機器およびその他のもの:立体走行器、ガラス注射器、ドリル、シェーバー、綿棒、温熱パッド。
   3. 麻酔:ケタミンキシラジン(K-X)(それぞれ25 mg/mLおよび2 mg/mL)をPBSで15 mLのチューブ内に調製します。
   4. 鎮痛:15 mLのPBSで15 μg/mLのブプレノルフィンを15 mLのチューブ内に準備します。
   5. その他の溶液:ポビドンヨウ素、過酸化水素3% v/v(H₂O₂)、眼科軟膏。
      注意:_H2O₂ は飲み込むと有害で、皮膚刺激を引き起こす可能性があります。
3. マウスを腹腔内注射(ip.)でK-X(体重10gあたり100μL)投与して麻酔します。足の指を挟みても反応がないことで十分な麻酔を確認しましょう。
4. 脱水を防ぐために両目に眼科軟膏を塗り、処置中ずっと温熱パッドの上にマウスを置いてください。
5. 頭皮を剃り、手術部位をポビドンヨウ素で消毒してください。頭蓋骨を露出させるために、正中線に沿って縦に1cmの切開を入れます。
6. 露出した頭蓋骨を_H2O₂ で綿棒で円を描くように洗浄し、ブレグマを視覚化します。泡が多ければ、乾いた綿棒で取り除きましょう。
7. マウスを立体走位フレームに位置付けます。ブレグマを基準点(0.0)に設定し、ブレグマの外側2.5mm、前方0.5mmを測定します。注射部位をマークしろ。
8. マウスを外して、指定された座標に小さな穴を開けます。脳損傷を防ぐために、深く掘りすぎないようにしましょう。
9. 注射器にシリンジを取り付けてください。細胞を再懸垂させ、2回の注射(4–5 μL)に十分な容量をガラス注射器に充填します。細胞沈着を防ぐため、一度に2回以上の注射を準備しないでください。
10. マウスを立体誘導器に位置を変え、針を穴に合わせて、ゆっくりと脳実質の奥深く3.0mmまで下げます。細胞(または偽の制御用として無菌PBS)を1 μL/minで注入します。
11. 注射後は針を少なくとも1分間そのままにし、1.5mm引っ込めてさらに1分ほど保持し、その後完全に抜きます。これにより逆流を最小限に抑え、適切な細胞堆積が保証されます。
12. 切開部を縫合糸で閉じ、ポビドンヨウ素を塗布します。ブプレノルフィン(100 μL)を皮下投与。
13. 麻酔から完全に回復するまで、マウスを温熱パッドの上に置いたままにしてください。ネズミは清潔なケージに戻し、毎日苦痛、神経症状、感染の有無を監視してください。

3. マウス心内灌流

1. マウスにはK-X(体重10gあたり100μL)を注射して麻酔します。足の指を挟みても反応がないことで十分な麻酔を確認しましょう。
2. ハサミを使って腹壁に5〜6cmの切開をし、肋骨を2回切開して鎖骨まで行います。大きな血管を切らないように気をつけてください。
3. 心臓を露出させた状態で、右心房を切って血流を促します。25G×1インチの針を装着した20mLシリンジで左心室に氷のようなPBSを注射します。
4. 流れる液体に血液が消えたら灌流を止めてください。成マウスの場合、約20mLのPBSが必要です。

4. マウス髄膜と嗅球の分離

1. 心内灌流の後、外科用ハサミでマウスの首を切断します。頭皮を完全に取り除いて頭蓋骨を露出させます。
2. ハサミを使って、後方から目にかけて横面の頭蓋骨を切り、下の脳組織を傷つけないように注意します。細かい鉗子を使って脳を優しく取り出し、内側の頭蓋骨表面に接触したり擦ったりするのを避けてください。
3. 脳摘出後も硬膜髄膜は内頭蓋表面に付着したままです。髄膜の完全な分離を促進するために、頭蓋骨を氷のように冷たいPBSに少なくとも5分間浸してください。
4. 脳の前方から嗅球を切り離し、氷のように冷たいPBSに移して一時的に保存し、処理まで待つ。
5. 細かい鉗子を使い、薄い組織層を慎重に持ち上げて剥がし、髄膜を内側の頭蓋骨表面から優しく剥がします。髄膜を氷のように冷たいPBSに移し、さらに処理するまで待つ。組織を裂かないようにして、最適な下流細胞回復を図りましょう。

5. 組織が単一細胞に解離する

1. 髄膜炎
   1. 髄膜を3 mLのRPMI 1640に移し、0.05%のコラーゲン酵素IIとDNase Iを含みます。37°Cで20分間インキュベートし、10分ごとに優しく攪拌します。過剰消化は細胞の生存率を低下させ、避けるべきです。
   2. 消化組織を40μmの細胞ストレーナーに通し、50mLのチューブに入れます。シリンジプランジャーをストレーナーに優しく押し当てて、5mLのPBSで洗浄し、残った組織を機械的に解離させます。
   3. 遠心分離機で300 x g で4°Cで5分間加熱します。 上澄液を捨て、ペレットを3 mL PBSに再懸濁させます。
   4. 遠心分離を繰り返します。上清液を廃棄し、最終ペレットを残存体に再懸浮させ、U型下部96ウェルプレートに移します。
2. 嗅球
   1. PBSを除去し、シリンジプランジャーを使って組織を機械的に解離します。ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)に0.02%コラーゲン酵素IIを含む3 mLの消化液を加えます。37°Cで20分間孵育し、10分ごとに優しくかき混ぜます。
   2. 細胞懸濁液を70μmのストレーナーに通し、50mLのチューブに通し、10mLのPBSで洗浄します。
   3. 遠心分離機で300 x g で4°Cで5分間加熱します。 上清液を捨て、残った体積で最終ペレットを再懸濁します。U型ボトムの96ウェルプレートに移します。
3. プレートは4°Cで保存し、染色ができるまで保管します。
   注意:最適な細胞生存率を確保するために、染色は同日に行ってください。

6. 細胞染色およびフローサイトメトリー取得

1. パネル設計
   1. 表 1をご覧ください。
      注:このプロトコルのパネルは、4基のレーザー(紫、青、黄緑、赤)と合計51個の検出器(蛍光48個+散乱チャネル3個)を備えたスペクトルフローサイトメーター用に設計されています。パネルはフローサイトメーターの構成と関心のあるタンパク質・マーカーに基づいて設計する必要があります。
2. 細胞染色
   1. U型底面の96ウェルプレートを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄液は慎重に捨ててください。この段階からは、プレートを光から守りましょう。
   2. 適切なウェルに50μLの生存性染料(FVD、PBSで1:5000希釈)を加え、RTで20分間培養します。150μL PBSで洗浄し、300 x g で遠心分離機で4°Cで5分間過ごし、上清液を廃棄します。生存可能性のコントロールやサンプルにはバイアビリティ染料のみを加えてください。
   3. Fc受容体を凍結して、30μLの抗CD16/CD32抗体(FACSバッファーで0.01μg/mL:PBSに2 mM EDTAおよび0.5% BSAを含む)を氷上で10分間インキュベートして細胞をブロックします。170μLのFACSバッファーで洗浄し、300 x g で遠心分離機で4°Cで5分間処理し、上清液を廃棄します。
   4. 30μL抗体混合液または単色対照菌(材料表に記載された抗体希釈量に従ってFACSバッファーで調製)を加え、氷で20分間培養します。170μLのFACSバッファーで洗浄し、300 x g で遠心分離機で4°Cで5分間処理し、上清液を廃棄します。
   5. 細胞を100μLの2%パラホルマルデヒド(PFA)でPBSに20分間RTで固定します。100μLのPBSで洗浄し、遠心分離機で300 x g で4°Cで5分間、上清液を廃棄します。
      注意:細胞内マーカーの場合は、この工程を市販のバッファーセットを用いた固定と透過化に置き換え、最終再懸濁前に細胞内染色を行います。
   6. 最終細胞ペレットを200μLのFACSバッファーに再懸浮させます。プレートはフローサイトメーターで取得するまで4°Cで保存します。
3. 単色染色および蛍光マイナス1(FMO)コントロール
   1. アンミクシングの最適化には単色染色サンプルが必要です。セルは、陽性および負性ピークを示すマーカーの単色染色サンプルに使用されます。それ以外の場合は、最適なアンミクシングを得るために補償ビーズの使用が推奨されます。製造元のプロトコルに従い、蛍光結合抗体用の補償ビーズを準備してください。
      注:FMOコントロールの準備は、特に明確な正負ピークが示されないマーカーに対して適切なゲーティングを達成するために重要なステップです。必要に応じて異なるフルオロクロム用の複数のFMOサンプルを準備します。
   2. 細胞表面抗原用FMOサンプルはパート6.2の手順に従い、目的の抗体はステップ6.2.4で抗体混合物から除外します。
4. フローサイトメトリー取得と解析
   1. サイトメーターを起動し、フローサイトメーター取得ソフトウェアを起動し、12×75mmのサンプルチューブに品質管理ビーズ(300μL PBSに1滴)を準備し、機械がウォームアップしている間(少なくとも30分)準備します。
   2. 器具を洗浄する方法は、3分間10%のv/v漂白剤、30分H_2O、高流量で使用してください。次のステップのために流量を低く設定してください。
   3. QCタブを選択し、チューブを装填し、スタートボタンを押してビーズを流します。QCが完了すると、「Passed(合格)」というメッセージが表示されます。
   4. 取得タブに行き、実験を選択しまたは作成し、FSCとSSCごとにセルをゲートして取得を開始します。染色されていない単色コントロールを入手し、アンミキシングウィザードを実行して設定を保存してください。染色されたサンプルを入手してください。

結果

E0771細胞の頭蓋内接種後、マウスは標的立体定位座標に局所的な乳がん病変を発症しました。紋状体実質を標的とした立体定位座標(外側2.5mm、ブレグマ前方0.5mm、ブレグマ腹側3.0mm)は、標準マウス脳アトラスおよび以前に記載された頭蓋内埋め込みアプローチに基づいて選択されました^15,16。この領域は、腫瘍移植を支援しつつ心室や注射路への漏れを最小限に抑えるため、頭蓋内腫瘍の移植に広く利用されています。このプロトコルでは、1×10⁵ E0771細胞を注入すると、10日目までに明確な腫瘍負荷が確立されました(図1A)。一方、最大腫瘍の増殖は通常13〜14日目頃に起こります。これらの成長動態に基づき、腫瘍拡大の後期かつ攻撃的な段階前の腫瘍-免疫相互作用を調査する実験的評価項目として10日目が選ばれました。しかし、腫瘍の成長速度は注射された細胞の数とその内在的な攻撃性の両方に依存し、実験のタイムラインに影響を与えます。

ディスカッション

頭蓋内腫瘍の移植と髄膜および嗅球の分離、解離、免疫特性評価を組み合わせることで、このプロトコルは脳腫瘍微小環境とCNS関連免疫インターフェースの動的な相互作用を詳細に調査することを可能にします。この方法は、頭蓋内腫瘍の再現性、高品質な細胞懸濁、そして堅牢な免疫サブセットの分解能を提供します。しかし、頭蓋内移植は転移カスケードの初期段階を迂回し、自然転移を完全に再現することはできません。したがって、早期伝達に関心のある研究者は全身接種アプローチを好む可能性があります。それでも、このプロトコルの免疫プロファイリング要素は、さまざまな脳転移モデルに広く適用可能です。

組織処理は追加の課題をもたらします。髄膜と嗅球は細胞数が限られた小さな組織であり、過度の機械的破壊、酵素による過剰消化、または長期の培養は生存可能な細胞回復を大幅に低下させる可能性があります。また、繰り返される遠心分離や洗浄工程でも細胞喪失が起こることがあります。したがって、正確な解剖、バランスの取れた酵素的消化、穏やかな取り扱い、慎重な上清液除去が、流動サ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	1:300希釈で使用
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	1:50希釈で使用
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	1:80希釈で使用
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	ポビドンヨウ素
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	FACSバッファーを調製
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	1:80希釈で使用
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	1:30希釈で使用
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	1:40希釈で使用
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	1:50希釈で使用
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	1:80希釈で使用
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	1:40希釈で使用
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	ブプレノルフィン
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	FACSバッファーを調製
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	1:50希釈で使用
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	バイアビリティダイ（1:5000希釈で使用）
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	ケタミン
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	固定バッファーを調製
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	1:50希釈で使用
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	1:300希釈で使用
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	1:80希釈で使用
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	1:80希釈で使用
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	1:100希釈で使用
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	1:160希釈で使用
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	1:300希釈で使用
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	1:80希釈で使用
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	キシラジン
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	1:50希釈で使用
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639