方法論記事

小児喘息ラットモデルにおける脊椎ピンチ操作の標準化プロトコルの確立

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DOI:

10.3791/70623

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2026年10月1日

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1College of Acupuncture and Massage, Nanjing University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

本記事では、若齢ラット喘息モデルにおける脊髄つまみ操作（SP）の標準化プロトコルを提示します。このプロトコルは、OVA誘発喘息モデルにおける気道炎症、気道過敏性およびリモデリングを軽減しました。本研究は、メカニズムの探索および臨床応用に向けた基礎となる可能性があります。

要約

喘息は小児において最も一般的な慢性炎症性気道疾患であり、慢性の気道炎症、気道過敏性（AHR）、および気道リモデリングを特徴としています。伝統中国医学（TCM）において、脊柱揉法（SP）は喘息やその他の小児疾患の管理に広く用いられている小児マッサージ技法です。1,000年以上の臨床使用歴があるにもかかわらず、SPは中国以外ではほとんど知られていません。さらに、SPの根底にあるメカニズムについては十分に解明されていません。本論文では、臨床現場で用いられている必須の手順を再現した、実行可能で標準化されたSPのプロトコルについて記述します。このプロトコルの適用により、若齢ラット喘息モデルにおいて気道炎症、AHR、および気道リモデリングが改善されました。再現性を高めるため、指圧、操作頻度、反復回数、介入期間を含む主要な操作パラメータを標準化しました。本研究における標準化プロトコルは、実験的小児喘息におけるSPの標準化およびそのメカニズムに関する今後の研究の参照資料となる可能性があります。

概要

小児喘息は、慢性の気道炎症、気道過剰反応性（AHR）、および気道リモデリングを特徴とする1,2。多くの場合、幼児期に発症し、学童期の子供における最も一般的な慢性疾患である。現在の標準的な治療法には、吸入ステロイド薬、β₂受容体作動薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、および生物学的製剤による治療が含まれる3,4。しかし、世界的に見て、喘息患者の子供の44.1％、および青少年の55.4％しか十分な疾患コントロールを達成できていない5。さらに、全身性または吸入ステロイド薬の反復投与は、コントロール不十分な喘息を有する小児において、成長遅延を招く可能性がある6。

伝統的な外治法であるマッサージ（中国では推拿として知られる）は、費用対効果が高く、忍容性に優れ、一般的に小児にとっても安全であると考えられています。マッサージは、小児喘息の予防および治療のために、中国と欧米諸国の両方で古くから用いられてきました7。系統的レビューおよびメタ解析では、小児喘息の管理におけるマッサージ療法の良好な結果が報告されています7,8。脊柱圧迫刺激（SP）は、中国伝統の小児マッサージにおいて古典的かつ広く実践されている技法です。中医学（TCM）の理論によれば、背背にある督脈（GV）および膀胱経（BL）を刺激することで、臓腑の機能が調節され、それにより全身の恒常性が維持され、疾患の予防や治療につながるとされています9,10,11。先行研究では、SPが小児のアトピー症状および徴候を改善させるだけでなく、若齢ラットの喘息モデルにおける慢性気道炎症を軽減させることが示されています12,13,14。臨床利用に加えて、SPは家庭でのヘルスケア介入としても一般的に実践されています11,15。1,000年以上の臨床歴史があるにもかかわらず、SPは中国国外では比較的知られておらず、その根底にあるメカニズムについても広範な調査が行われていません。したがって、SPのメカニズムを解明し、より広範な科学的評価と応用を裏付けるためには、標準化された動物モデルが不可欠です。

動物研究のための標準化されたマッサージプロトコルを確立した研究がいくつか存在します。先行研究では、心血管系の興奮性反応を抑制するために、約 20 cm/s の速度と 100 mm H₂O の圧力による標準的な背部または腹部のストローキングプロトコルが開発されました16。より最近では、機械的刺激装置を用いて督脈（GV）に沿って反復的な一方向の脊髄触覚刺激を行うことで、自閉症の若齢マウスモデルの内側前頭前皮質においてシナプスリモデリングが促進されることが示されました。そのプロトコルでは、不快感や損傷を与えない範囲で、約 15.3 cm/s の速度で約 30–50 g の適度な圧力が加えられました。刺激は、尾側から項部（後頭部）に向かって一方向に、1日2回、1回 10分間、21日間にわたって行われました17。しかし、手技による操作は機械的刺激とは根本的に異なり、現在、SP の特徴的な動きを再現できる機械的な装置は存在しません。さらに、喘息やその他の小児疾患のラットモデルを用いて SP のメカニズムを調査した研究はいくつかありますが18、動物研究における SP に必要な刺激強度と速度を定義する標準化されたプロトコルは確立されていません。したがって、再現性を向上させ、メカニズムの解明を促進するためには、標準化された SP プロトコルの開発が不可欠です。

アレルギー性喘息は、小児喘息において最も一般的な表現型です19。そのため、オバルブミン（OVA）による感作および誘発は、小児喘息の実験モデルを構築するために最も広く用いられている手法です20。ラットは体サイズが大きく、手技による操作が容易であるため、マッサージによる介入の研究に特に適しています。さらに、ラットモデルは、Th2偏向性炎症、気道過敏性（AHR）、および気道リモデリングを含むアレルギー性喘息の主要な病理学的特徴を確実に再現します21。

先行研究により、OVA感作および誘発後の若齢ラットにおいて、SPが気道炎症を軽減することが示されています11,14。したがって、本研究では、SPの基礎的なメカニズムに関する今後の調査を促進するため、小児喘息の若齢ラットモデルにおける標準化されたSPプロトコルを確立することを目的としました。この標準化されたプロトコルは、メカニズム研究および、小児喘息の動物モデルにおけるSPの今後のトランスレーショナルリサーチに向けた、再現性のある実験的枠組みを提供します。

プロトコル

本研究は、南京中医药大学の動物実験委員会（承認番号：202306A032）によって承認されました。すべての手順は、米国国立衛生研究所（NIH）の実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインおよびARRIVE 2.0ガイドラインに従って実施されました。

体重45–55 gの3週齢の雄の特定病原体フリー（SPF）Sprague-Dawley（SD）ラット30匹を使用した。ラットは、22 ± 2 °C、相対湿度30%–40%、12時間の明暗サイクル条件下で、SPFバリア施設内に（1ケージにつき3匹で）飼育し、標準飼料と水に自由的にアクセスさせた。若齢ラットの喘息モデルを用いた先行研究11,14に基づき、3Rsの削減原則に従って動物の使用数を最小限にするようサンプルサイズを決定した。7日間の順化期間の後、ベースラインの体重を記録し、各ラットに固有の識別番号を割り当てた。ラットをベースライン体重で層別化し、乱数表を用いて各層内で5つの群に1:1:1:1:1の割合で割り付けた（各群n = 6）：対照群（CN）、喘息群（AS）、喘息＋SP群（AS+SP）、喘息＋メチルプレドニゾロン群（AS+MP）、および喘息＋SP＋メチルプレドニゾロン群（AS+SP+MP）。ランダム化シーケンスおよび群への割り付けは、その後の介入やアウトカム評価に関与しない研究者によって作成された。

組み入れ基準は、週齢3週、ベースライン時の体重が45～55 gで、正常な呼吸パターンを示し、規則的な身体活動が見られる健康なオスSPF SDラットとした。疾患の兆候がある場合、または体重の偏差がのある場合は、ラットを除外した。 >順化期間中のコホート平均から20%以上乖離した場合、または介入フェーズの完了前に死亡した場合。処置の間、白衣、使い捨てマスク、手袋を含む適切な個人用保護具を着用した。動物の死骸および組織は二重構造のバイオハザード袋に入れ、−20 °C 廃棄前に。汚染された敷材はバイオハザード固形廃棄物として廃棄し、鋭利物は承認済みの耐刺 punctures コンテナに廃棄した。最終組織採取のため、20%ウレタン（5 mL/kg、腹腔内投与）を投与し、足底逃避反射および角膜反射の消失により深麻酔を確認した。

1. 若齢ラット喘息モデルの作製

注：以下の手順を用いて、若齢ラット喘息モデルを確立しました12。

  1. 各回注射の直前にOVA/Al(OH)₃懸濁液を調製する。2 mgのGrade V OVAを1 mLの4% Al(OH)₃ゲルに直接溶解し、均一な懸濁液が得られるまでボルテックスで撹拌する。
    注意：注射前に懸濁液が均一であることを確認すること。沈殿が生じた場合は、短時間ボルテックスして混合物を再懸濁させる。懸濁液は氷上で保存し、調製後2時間以内に使用すること。
  2. 実験日の1日目、8日目、および15日目に、OVA/Al(OH)₃懸濁液1 mLを腹腔内投与する。CN群のラットには、同スケジュールで滅菌生理食塩水（0.9% NaCl）1 mLを投与する。
  3. 実験21日目から42日目まで、超音波ネブライザーを用いて2% Grade II OVA溶液でラットに抗原刺激を行う。感作後の増悪を誘導するため、最後の2回連続の刺激では3% OVAを投与する。
  4. 3週間にわたり、1日おきに30分間のネブライゼーションを行う。各ラットを、超音波ネブライザー（超音波周波数：1.7 MHz ± 10%、ネブライゼーション速度：≥3 mL/min、粒子径：<5 µm）に接続された密閉式曝露チャンバーに個別に配置する。
    注意：くしゃみ、呼吸時の頭部振動、口開呼吸、腹筋の収縮、および喘鳴を観察し、喘息モデルが正常に確立されたことを確認すること。

2. Finger TPSシステムソフトウェアの操作とアプリケーション

  1. センサープラグを回路基板のインターフェースに垂直に挿入します。操作に十分な柔軟性を持たせるため、長さ約 40 cm の USB-C ケーブルを使用して、回路基板をコンピュータに接続します。
  2. 手指およびフィンガープロテクターを消毒します。操作者の右手の親指と人差し指をセンサー付きフィンガースリーブに挿入します。柔軟なセンサーを指先の中心に配置し、皮膚に密着させ、しわがないように固定します。
  3. 力測定のシステムキャリブレーションおよび品質管理を実施します。
    1. 各操作トレーニングセッションの前にセンサーと接続ケーブルを点検し、デバイスが正しく接続されていることを確認します。
    2. 測定単位として「N」を選択し、測定範囲を −3.5 から 32 N に設定します。
    3. センサーに外力がかかっていないことを確認します。「Tare」機能を実行して、システムをゼロ点調整します。
    4. 無負荷状態のベースラインを 30 s 間記録します。ベースラインの変動が 0.02 N 未満に維持された場合にのみ、力の測定を開始します。
    5. センサーの位置やスリーブの締め付けを調整した場合、またはベースラインのドリフトが観察された場合は、その都度ゼロ点調整の手順を繰り返します。
    6. 操作トレーニング中は Finger TPS システムを使用して、印加されている力をモニタリングします。規定の速度と頻度を維持しながら、バックストローキング中は 5 ± 0.6 N、SP 中は 12 ± 2 N の力を維持します。
    7. ベースラインが安定しており、信号の中断や飽和が発生せず、かつ印加された力が指定されたターゲット範囲内にある場合にのみ、力曲線を受け入れます。
  4. ダイナミック力曲線をモニタリングしながら、バックストローキング操作および SP を行います。安定した力曲線が得られるまで、必要に応じてフィンガースリーブの締め付けを調整します。
  5. リアルタイムの力曲線をモニタリングしながら、操作を練習します。バックストローキング中はターゲットとする力を 5 ± 0.6 N、速度を約 5 cm/s に維持し、SP 中はターゲットとする力を 12 ± 2 N、頻度を 6–8 repetitions/min に維持します。操作技法、指の力、および SP 頻度の基準を 5 回連続の練習試行で満たした場合にのみ、操作者は有能であると見なします。
    注：ターゲットとする力および動作パラメータを一貫して達成できた場合にのみ、操作者は適格であると見なします。ラットへの過剰な触覚刺激を避けるため、正式な SP 手順を行う前にフィンガープロテクターを取り外してください。ただし、本プロトコルを SP 研究のリファレンスとして採用する場合、本研究における操作者間再現性テストは考慮しないでください。

3. 脊髄ピンチ操作の詳細手順

  1. ラットを一方の手のひらの上で、腹臥位になるように優しく保持します。親指と人差し指で前肢の腋窩を軽く囲むようにして支え、前肢を自然に垂らした状態にします。ラットが落ち着いており、呼吸が安定していることを確認してください。鳴き声を出したり、暴れたり、排便があった場合は、一旦ラットを放して2～3分間順応させてから、再度保持してください。図1).
  2. 右手の人差し指、中指、薬指を用い、督脈（GV）に沿って肩領域から尾の付け根に向かって背中を2回撫でる。SP（刺激）の前に、ラットを落ち着かせるため、約5 Nの力を加える。
  3. 右手の親指を後方に、人差し指と中指を前方に配置し、尾の付け根の皮膚をつまみます。皮膚を軽く持ち上げ、ねじるようにしながら、脊椎に沿って大椎（GV14）に向かって頭側へ指を動かします。明らかな不快感を与えないように注意してください。指圧は約12 Nに維持し、1分間に6～8回の頻度で操作を行います。実験1日目から21日目までは15回、22日目から44日目までは25回、この操作を繰り返します。
  4. ステップ3.2で説明したバックストローキングの手順を繰り返し、処置セッションを終了させてラットを落ち着かせる。
    注：伝統中国医学（TCM）の理論に基づき、督脈（GV）および膀胱経（BL）を刺激するため、脊柱に沿って脊柱プレス（SP）を行います。図2）。督脈（GV）は尾根から大椎（GV14）まで背面の正中線に沿って走行し、一方で膀胱経（BL）は体格に応じて正中線から約3〜6mm外側に位置しています。22大椎 (GV14) は、第7頸椎と第1胸椎の中間に位置する。臨床的な治療法を模倣するため、年齢に応じてSP（刺激）の反復回数を増やす。背部のストローキング中は、ラットがリラックスし、穏やかに呼吸し、防御行動を示さないことを確認する。SP中は、軽度の背中の反りやひげの広がりが見られることが予想されるが、ストレス誘発性の排尿、排便、激しい抵抗、発声、または逃避行動が見られないようにする。

4. 介入プロトコル

  1. CN群のラットには、疾患特異的な介入を行わない。ハンドリングによる影響を制御するため、AS+SP群と同時間、ラットを優しくハンドリングする。メチルプレニゾロン投与と同じスケジュールで、生理食塩水（1 mL/kg）を腹腔内投与する。
  2. AS群のラットにOVA感作および惹起を行う。CN群で用いたものと同様のハンドリングおよび生理食塩水注入の対照処置を適用する。
  3. AS+SP群のラットにOVA感作および惹起を行う。モデル導入前に、1日1回SPプロトコルを適用する。
  4. AS+MP群のラットにOVA感作および惹起を行う。各OVA惹起の30分前に、メチルプレニゾロン（10 mg/kg；生理食塩水で2 mg/mLに調製）を腹腔内投与する。
  5. AS+SP+MP群のラットに、AS+MP群と同様の処置を行う。メチルプレニゾロン投与前に、1日1回SPプロトコルを適用する。
    注：AS+SP群およびAS+SP+MP群を除き、非特異的なハンドリングの影響を制御するため、他のすべての群に同様のハンドリング処置を適用する。すべての注射には滅菌使い捨てシリンジを使用し、針は耐穿刺性の鋭利物廃棄容器に廃棄すること。内臓損傷のリスクを最小限にするため、腹腔内注射の針は腹部正中線から外側に挿入する。非SP群における触覚刺激を制御するため、SP群と同じ介入の時間に、毎日4回ラットを撫でる。撫で方はSP群で使用したものと同じ背中撫での手順を用いる。

結果

体重は、若齢ラットにおける成長の重要な指標です。実験的処置の前には、5つの群間で体重に有意な差は見られませんでした。喘息モデルの導入後、AS群はCN群よりも有意に低い体重を示しました（P = 0.000; Figure 3A）。AS群と比較して、AS+SP群は有意に高い体重を示しましたが（P = 0.008; Figure 3A）、AS+MP群では有意な差は見られませんでした（P = 0.975; Figure 3A）。同様に、AS+SP+MP群においても、AS群と比較して体重の有意な増加は見られませんでした（P = 0.925; Figure 3A）。これらの結果は、若齢ラットの小児喘息モデル作成およびメチルプレドニゾロン（MP）治療において、SPが体重増加を促進することを示唆しています。

OVA challenge後、CN群のラットには、呼吸困難、くしゃみ、頭部の揺れ、開口呼吸、腹筋の収縮、または喘鳴などの呼吸 distress の兆候は見られなかった。対照的に、AS群のラットは、呼吸困難、くしゃみ、頭部の揺れ、開口呼吸を含む小児喘息の典型的な症状を示した。これらの臨床兆候は、SP、MP、またはそれらの併用投与による治療後、著しく軽減された。

実験的喘息モデルの若齢ラットにおけるSPの抗炎症効果を評価するため、既報の手順12に従い、20%ウレタン（5 mL/kg, i.p.）による深麻酔後に肺組織を採取した。慢性気道炎症を評価するためにヘマトキシリン・エオジン（HE）染色および前炎症性遺伝子発現の解析を行い、気道リモデリングの評価にはマッソン染色を用いた。気道過敏性（AHR）は、全身プレチスモグラフィー（WBP）を用いて拡張休止時間（Penh）を測定することで評価した。

通常のHE染色およびMasson染色手順23に従い、肺切片をヘマトキシリン・エオシンで染色し、修正0–4スコア24を用いて気管支周囲の炎症を評価した。喘息モデル群は、CN群よりも有意に高い炎症スコアを示した（P = 0.000）。AS群と比較して、AS+SP群、AS+MP群、およびAS+SP+MP群のすべてで炎症スコアが有意に低下しており（それぞれ P = 0.005、P = 0.006、P = 0.000）、これら3つの治療群間に有意な差は認められなかった（Figure 4A、Table 1）。

気道リモデリングの評価は、Masson染色を用いて細気管支周囲のコラーゲン沈着量を定量することで行った。コラーゲン沈着量は、基底膜周囲長で正規化したコラーゲン陽性面積（µm2/µm）として算出した。AS群はCN群よりも有意に高いコラーゲン沈着を示した（P = 0.000）。CN群と比較して、AS+SP群およびAS+MP群ではコラーゲン沈着が緩やかに増加したが（それぞれ P = 0.050 および P = 0.051）、AS群よりは有意に低かった（いずれの比較においても P = 0.001）。AS+SP+MP群は、CN群との間に有意な差は認められなかったが（P = 0.105）、AS群と比較してコラーゲン沈着が有意に減少していた（P = 0.001）。3つの介入群間には、有意な差は認められなかった（Figure 4B, Table 1）。

Finger TPSシステムを用いて得られた代表的な力曲線が図5に示されています。オペレーターのトレーニング中、バックストローキング時に記録された力曲線は約5 Nで安定していましたが（図5A）、SP中に記録された力曲線では、ピンチ操作に対応する力のピークが繰り返し現れ、印加された力は事前に定義された目標範囲内に維持されていました（図5B）。これらの力プロファイルは、オペレーターのトレーニング中に用いられた標準化された力の特性を示しています。

実験全体のタイムラインを図6にまとめる。7日間の馴化期間後、規定のスケジュールに従ってOVA感作を行い、続いてOVAによる反復的な誘発を行った。指定された介入期間中に、AS+SP群およびAS+SP+MP群にSPを投与し、対応する治療群ではOVA誘発前にメチルプレドニゾロンを投与した。最終誘発後に、WBP評価および組織採取を行った（図6）。

全身プレチスモグラフィーは、意識があり拘束されていない齧歯類において、重大な損傷や苦痛を与えることなくPenhを評価するために広く用いられています25。Penhは呼吸タイミングや環境要因に影響される間接的な指標ですが、気道抵抗を直接測定するには麻酔と気管切開が必要となり、それが気道生理学的な変化を誘発する可能性があります26。それにもかかわらず、Penhは肺抵抗の侵襲的測定値と相関することが報告されています27。最終的なOVAチャレンジの24時間後、ラットを非拘束チャンバーに配置し、エアロゾル化したPBS、次いでアセチルコリン（Ach）を3.125、6.25、12.5、25、および50 mg/mLの濃度で順次投与しました。各エアロゾルチャレンジは2分間行い、その後5分間の記録期間を設けました28。AS群はCN群よりも有意に高いPenh値を示しましたが、SP、MP、またはそれらの併用投与により、Penh値は有意に減少しました（P = 0.005; Figure 3B）。この結果は、SPが喘息ラットの呼吸機能を改善させたことを示していますが、この知見については、直接的な気道抵抗（Raw）測定と併せたさらなる検証が必要です。

インターロイキン-4 (IL-4) は Th2 介在性の好酸球性炎症を誘発し、一方で腫瘍壊死因子-α (TNF-α) は AHR および気道リモデリングに寄与しており、これらは共に小児喘息の病態形成において中心的な役割を果たしている29。気道炎症をさらに評価するため、定量的に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) を用いて肺組織における IL-4 および TNF-α の発現レベルを定量化した。CN 群と比較して、AS 群では IL-4 および TNF-α の発現が有意に増加していた (P = 0.000 および P = 0.000；Figure 3C,D)。両サイトカインの発現は SP または MP 治療後に有意に減少し、SP と MP の併用により最大の減少が認められた (P = 0.001 および P = 0.000；Figure 3C,D)。

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図1: ラットにおける脊柱つまみ操作（SP）の詳細手順。 (A) ラットを術者の手のひらの上で腹臥位に保持する。 (B) 尾根元の皮膚をつまむ。 (C) つまんだ皮膚を持ち上げる。 (D) 指をひねりながら、脊柱に沿って大椎（GV14）に向かって頭側へ進める。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図2ラットにおける督脈（GV）、足太陽膀胱経（BL）、および大椎（GV14）の概略図。 この図は、脊柱圧迫操法の標的部位となる督脈（GV）、足の太陽膀胱経（BL meridian）、および大椎（GV14）の解剖学的位置を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 3: 若年ラットにおける脊椎ピンチ操作が体重、気道過敏性および肺炎症因子に及ぼす影響。 (A) 実験群間における体重の比較。 (B) 強化ポーズ（Penh）値の比較。 (C) 肺組織におけるインターロイキン-4 (IL-4) の相対的遺伝子発現。 (D) 肺組織における腫瘍壊死因子-α (TNF-α) の相対的遺伝子発現。データは平均値 ± SD として提示。 *P < 0.05 および **P < 0.01 はCN群に対する値。 #P < 0.05 および ##P < 0.01はAS群に対する値。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図4: 肺組織における代表的な組織病理学的変化。 (A) 肺細気管支周囲の炎症を示すヘマトキシリン・エオジン（HE）染色。 (B) コラーゲン沈着および気道リモデリングを示すマッソン・トリクローム染色。画像は200×の倍率で取得した。スケールバー = 100 µm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5Finger TPSシステムを用いたスパインピンチ操作中に記録された代表的な力曲線。 (A) バックストローキング操作中に記録されたフォースカーブ。 (B) スパインピンチ操作（SP）中に記録された力曲線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 6: 実験タイムライン。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

群HE炎症スコアコラーゲン面積/基底膜周囲長 (μm²/μm)
CN1.10 ± 0.252.50 ± 0.43
AS2.32 ± 0.50**4.23 ± 0.53**
AS+SP1.66 ± 0.27##3.12 ± 0.56*##
AS+MP1.67 ± 0.31##3.12 ± 0.50*##
AS+SP+MP1.34 ± 0.27##3.01 ± 0.33##

表 1：肺組織病理学的スコア。 肺胞周囲の炎症はHE染色を用いて評価し、気道リモデリングは基底膜周囲長で標準化したコラーゲン陽性面積（µm2/µm）として定量化した。データは平均値 ± SD（1群あたり n = 5）で示す。*P < 0.05、**P < 0.01（CN群との比較）；#P < 0.05、##P < 0.01（AS群との比較）。

ディスカッション

卵白アルブミン（OVA）感作および誘発は、小児喘息の研究で最も広く用いられている実験モデルの一つである30,31。本研究では、標準化された脊柱つまみ法（SP）プロトコルが、慢性気道炎症、気道過剰反応（AHR）、および気道リモデリングを軽減することを実証した。先行する臨床研究により、SPを含む伝統的な小児マッサージが、子供の喘息およびその他のアレルギー性疾患を改善することが示されている11,13,32。さらに、先行する動物実験では、SPが腸内細菌叢を調節することで、若齢ラットの喘息モデルにおける気道炎症を抑制することが示されている12,15。本研究では、標準化されたSPプロトコルの適用が、若齢ラットの喘息モデルにおいて慢性気道炎症、AHR、および気道リモデリングを改善することをさらに実証した。さらに、SPはメチルプレドニゾロン（MP）の治療効果を高める一方で、その成長抑制という副作用を軽減した。

SPは中国で1,000年以上にわたり実践されており、喘息やその他の小児疾患の予防および治療に最も広く用いられている小児マッサージ技法の一つであり続けています12,15,33,34,35。長い臨床適用の歴史があるにもかかわらず、SPは中国国外では比較的あまり知られていません。中医学の理論によれば、督脈（GV）と足の太陽膀胱経（BL）は脊柱に沿って、あるいはその隣接して走り、内臓と連通しています。したがって、督脈と膀胱経を刺激することで、内臓機能が調節され、免疫活性が調整され、疾患への抵抗力が強化されると考えられています。SPは、脊柱に沿って皮膚をつまみ、持ち上げ、ひねり、進める操作で構成され、これにより督脈と膀胱経の両方を刺激します。この操作は、皮膚と下層の筋膜に圧縮力と牽引力を同時に加え、適度な機械的刺激を与えます。臨床現場では、刺激を緩和し患者の快適性を向上させるため、SPの前後に穏やかな背中のなでつけ（back-stroking）操作が日常的に行われます。背中のなでつけは、背中に沿って優しく下方へなでる操作であり、小児マッサージで広く用いられています。したがって、臨床的関連性、実現可能性、簡便性、および再現性の原則に基づき、本標準プロトコルにはSPと背中のなでつけ操作の両方が組み込まれています。

先行研究により、SPは免疫調節メカニズムを介して肺と海馬の両方で炎症を軽減することが示されています12,36。小児喘息は、免疫調節異常と密接に関連したTh2偏向性の炎症を特徴としています37。過去の実験的研究では、100–150 mmH₂O (7–11 mmHg) の圧力および約 3 cm/s の速度で手またはブラシによるストローキングを行った際に、マウスの免疫反応が調節されたことが報告されています38。さらに、臨床研究では、約 1–10 cm/s で行われたストローキングの方がより心地よいと感じられたことが報告されています39。これらの知見に基づき、標準化プロトコルでは、適切な鎮静効果を得るために 5 ± 0.6 N の背中のストローキング力と 5 cm/s の速度を採用しました。SPの圧力、頻度、および繰り返し回数は、先行研究12,15および他の研究グループによる関連調査40,41に基づいて決定されました。過去の研究では、げっ歯類における心血管抑制の達成やシナプス再編成の促進のために、手動による背中のストローキング (20 cm/s; 約 100 mmH₂O) または機械的なGV刺激 (30–50 g; 約 15.3 cm/s) のいずれかが標準化されていますが、手動のSPは触覚および固有受容感覚のフィードバックに依存する独自のバイオメカニカルな介入であり、したがって既存の機械的デバイスで完全に再現することはできません。この区別は、アレルギー性喘息に対する触覚介入の今後のトランスレーショナルリサーチにおいて、施術者が標準化したプロトコルの重要性を強調するものです。

中国語で発表された数多くの研究により、SPが免疫機能を調節し、炎症を抑制することが示されています42,43,44。しかし、著者らの研究グループ以外では、小児喘息の動物モデルにおいて特定の疾患を調査するためのSPの圧力と速度を標準化した研究は、現在の知る限り存在しません。これまでの研究では、腸内細菌叢の調節、短鎖脂肪酸の産生増加、呼吸筋機能（例：横隔膜の強度）の向上、および気道炎症と肺機能不全の軽減など、若齢ラット喘息モデルにおけるSPの基礎となるメカニズムが調査されてきました11。本研究では、作用機序を包括的に解明することよりも、主に標準的なプロトコルの確立に焦点を当てました。背中への撫で付け（back stroking）とSPの両方で適用される力を標準化するために、高精度触覚圧力測定・記録システムを使用し、操作の速度と頻度は先行研究に基づいて標準化しました。ラットを選定したのは、その体格が安定したハンドリングとSPの手動適用を容易にし、かつ臨床的な手技に近似しているためです。背中への撫で付けは、小児科の臨床現場と同様に、片手の指を用いて行いました。ラットは体が小さいため、SPは両手ではなく片手の3本の指で行いましたが、臨床手技の重要な生物力学的特性は維持しました。この修正により、ラットモデルにおける督脈（GV）および膀胱経（BL）の刺激を忠実に再現しています。触覚圧力測定システムによって測定パラメータが異なる可能性があるため、背中への撫で付けおよびSP中のラットの行動反応に基づいて手動操作を標準化することは、デバイス固有の力測定のみに依存するよりも高い再現性をもたらす可能性があります。また、先行研究では、CUMS誘発若齢ラットにおいて背中への撫で付けが抗うつ効果を示すことが的に示されていますが9、SPはより有意に高い治療効果をもたらしました。したがって、本研究で観察された有益な効果には、SPの主たる効果に加えて、背中への撫で付け操作による寄与が部分的に反映されている可能性があります。

いくつかの限界を認める必要がある。第一に、サンプルサイズが比較的小さかったため、知見の堅牢性と一般化可能性が制限される可能性がある。第二に、本研究は主に標準化されたSPプロトコルの確立と検証に焦点を当てていたため、基礎となる生物学的メカニズムを包括的に記述するのではなく、限定的なメカニズム的アウトカムのみを調査した。したがって、BALF炎症細胞数、OVA特異的IgEレベル、Th2サイトカインプロファイリング（例：IL-5、IL-13）、および細胞内シグナル伝達経路解析を含むメカニズムの検証は行わなかった。この結果は、SPが喘息ラットの呼吸機能を改善したことを示唆しているが、この知見には直接気道抵抗（Raw）測定を併用したさらなる検証が依然として必要である。第三に、すべての操作は単一の訓練を受けた操作者によって行われ、異なる訓練済み操作者間での再現性は評価されなかった。最後に、バックスロキングのみの介入群が含まれていなかったため、バックスロキングの独立した効果とSPの効果を区別することができなかった。今後の研究では、サンプルサイズを拡大し、操作者間の再現性を評価し、追加の対照群を組み込み、SPの治療効果の根底にある分子メカニズムをさらに調査すべきである。

開示事項

著者は、開示すべき事項がないことを宣言します。本原稿の作成過程において、人工知能ツールは一切使用されていません。著者は、最終的な原稿の完全性と正確性について全責任を負います。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（プロジェクトリーダー：Xiong Ying、No.81973970、南京中薬大学による）の支援を受けて行われました。著者らは、会場、器具および設備を提供してくださった小児研究所、江蘇省小児健康・中医学重点研究室、および教育省鍼灸医学研究重点研究室に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% Al(OH)3 ゲルShanxi ZHHC Biomedical Technology Co., LTD, ChinaBS010N/A
Ach (アセチルコリン)Sigma, USAA2251N/A
細胞接着用顕微鏡スライドCitotest, Jiangsu, ChinaREF.188105
P/N.80312-3161		N/A
バイオハザード廃棄物袋Nanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.HJ421-2008N/A
生体組織乾燥機Kedee, Zhejiang, ChinaKD-HIIN/A
生体組織包埋機Kedee, Zhejiang, ChinaKD-BMN/A
生体組織薄切機Kedee, Zhejiang, ChinaKD-PIN/A
Buxco Research SystemsDSI Buxco,Wilmington, NC,USAPFTN/A
調整可能ミキサー (MX-S)DLAB, Beijing, China8031102000N/A
マイクロプレート用遠心分離機Scilogex, USASCI-CF2800M E050S11B000798N/A
クリーンベンチ Sanfa, Shanghai, ChinaSF-CJ-1AN/A
汎用遠心分離機DLAB, Beijing, ChinaD100BE: 9031001011N/A
使い捨て滅菌手袋Shanghai Kebang Medical Latex Equipment Co., Ltd.22010739https://www.sh-kebang.com/products_detail/6.html
電子天秤Jinghai, ShanghaiYP3001NN/A
電子天秤Jinghai,  Shanghai, ChinaYP3001NN/A
指先 TPS システムPressure Profile System, Inc, USA適用ソフトウェアバージョン: Chameleon 2018https://pressureprofile.com/body-pressure-mapping/finger-tps
 蛍光光学顕微鏡Olympus, Tokyo, JapanDP70N/A
高圧蒸気滅菌器Tomy, JapanSX-500N/A
高速冷却遠心分離機Eppendorf5418RN/A
マッソン三色染色キットSolarbio, Shanghai, ChinaG1340N/A
マイクロピペットおよび滅菌チップeppendorfJ48931Lhttps://www.eppendorf.com/hk-en/Products/Liquid-Handling/All-Pipettes-Dispensers-Automated-Liquid-Handlers/Eppendorf-Reference2-p-PF-222171
ミクロトームLeica, GermanRM2145N/A
MP (メチルプレドニゾロン酢酸エステルナトリウム)Shyndec, Shanghai, ChinaH20070007N/A
NanoDrop Lite 分光光度計Thermo Fisher Scientific, USAnd-ndl-pr-2yrw-cccN/A
 ネブライザーコントローラーEmka, FranceVENT4:14554N/A
不透明密閉封筒Nanjing Kongdu printing Co., Ltd201701N/A
OVA (グレード II)Sigma, USAA5253N/A
OVA (グレード V)Sigma, USAA5503N/A
PCR キットYeasen, Shanghai, China11201ES08N/A
耐穿刺性鋭利物容器Nanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.KMT-15YN/A
逆転写キットBio.vazyme, Nanjing, ChinaR323N/A
小型遠心分離機Hettich, GermanMIKRO 220R D-78532N/A
滅菌乾燥綿球ZHENDE, Zhejiang, China202203121Bhttps://www.zhende.com/index.php?g=product&m=index&a=info&id=13
TrizolBio.vazyme, Nanjing, ChinaR771N/A
超低温保存冷凍庫Thermo Fisher Scientific, USA950GP-ULTSN/A
超音波ネブライザーJiangsu Yuwell Medical Instruments Co., Ltd., China402AIN/A
ViiATM7 リアルタイム PCR システムLife TechnologiesTM , Singapore278882021N/A
全身体積変動計Scrieq, Canada1185162,1184031,1185898FV-FXM1-01, 呼気カートリッジ FX1 : FV-FXM1 ET, 吸気カートリッジ FX1 : FV-FXM1-IA

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