細胞外マトリックス(ECM)の剛性は細胞挙動の重要な調節因子ですが、その根底にある感知およびトランスダクションのメカニズムは依然として不明です。これに対応するため、細胞-ECMクロストークの理解を深めるために、剛性を調整可能なポリアクリルアミドおよびシリコーンベースの基板を作成するプロトコルを提供しています。
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この記事について
サマリー
要約
細胞外マトリックス(ECM)は細胞の挙動を調節する重要な役割を果たし、ECMの剛性は細胞のシグナル伝達、形態、運命を制御する重要な機械的手がかりとなっています。しかし、剛性依存性細胞応答の実験的研究は、再現可能でコスト効率が高く、精密に調整可能な機械的特性を持つ培養プラットフォームの利用可能性によって制限されることが多いです。このプロトコルは、調整可能な剛性を持つECM基板の製造に用いられるポリアクリルアミド(PA)およびシリコーンベースの方法を説明しています。この手順では、基質の準備、表面機能化、ECMタンパク質の結合を概説し、生理学的に関連性の高い剛性範囲にわたる細胞接着の一貫性を確保します。PAベースの基質は、タンパク質やRNA抽出を含む下流の生化学的アッセイや高分解能蛍光イメージングにも適合しています。シリコーンベースの基質は全反射蛍光顕微鏡(TIRF)に最適化されており、基底膜での細胞-ECM相互作用の可視化を可能にします。さらに、軟質基質は一貫したイメージング面内に位置する球状培養物を支持するために適応でき、一貫した画像取得を可能にします。これらの手法は、ECMの剛性が細胞プロセスをどのように調節するかを体系的に探求するための堅牢でコスト効率が高く再現性のあるプラットフォームを提供し、生理学的および疾患的文脈における細胞-ECMのクロストークに関する機構的洞察を進展させます。
概要
細胞外マトリックス(ECM)は、組織の機械的特性を定義し、その生物学的機能を支える基本的な構造的かつ生化学的な足場です。例えば、肺や動脈などの弾性組織は、コラーゲンやエラスチンを基にしたECMで強化されており、呼吸中の繰り返される伸縮・反動サイクルに必要な機械的耐久性を提供します。対照的に、中枢神経系にはグリコサミノグリカンを豊富に含むECMが存在し、神経細胞の分化とシグナル伝達に最適化された高度にコンプライアンス環境を作り出します。体内のさまざまな組織にわたり、組織の硬さは数桁に及び、脳や肺のような軟組織では数百パスカルから、腱や骨の巨大パスカルおよびギガパスカルレベルの硬さまで幅広く分布します2,3。これらの機械的な違いは単なる構造的なものではなく、細胞の挙動を調節する上で重要な役割を果たしています。例えば、間葉質幹細胞は剛性依存的な系統指定を行い、軟基質では神経元運命、中間基質では筋原性、硬い基質では骨形成性の運命を取る6。ECM硬性の病理学的変化も異常な細胞反応を引き起こし、疾患の発症と進行に寄与することがあります7,8,9。同様に、細胞周囲のECM特性の変化もオルガネルの機能やさまざまな細胞行動を変化させます(10,11)。ECMがシグナル伝達、小器官機能、疾患の病因を導く上で重要であることは認識されているものの、細胞がECMの手がかりを生化学的信号に変換するメカニズムはまだ完全には解明されていません。
細胞-ECMクロストークの理解の進展は、ECM特性を正確に制御しつつ、標準的な生化学的アッセイや画像ワークフローと完全に互換性を保つ実験プラットフォームの利用が限られていることによって一部妨げられています。さらに、細胞-ECMの相互作用の研究は、材料科学、細胞生物学、バイオエンジニアリングにまたがる学際的な専門知識を必要とするため、技術的にも難しいと感じられることが多いです。この方法は、ほとんどのウェットラボ環境で容易に準備可能な、明確な機械的特性を持つPAおよびシリコーンベースのECM基板を生成する段階的なプロトコルを提供することで、これらの課題に対処することを目的としています。
剛性を調整可能なPAハイドロゲルは機械生物学の主要物質です。しかし、ECMの接合試薬の高コスト、表面機能化の不一性、大規模な生化学ワークフローとの互換性の低さにより、その有用性はしばしば妨げられます。さらに、異なる剛性を持つ基質間でのサンプル採取およびイメージングのための実用的かつ標準化された手法はまだ十分に確立されていません。これらのボトルネックは、(i) 大幅なコスト削減、(ii) 再現性のある機能化化学、(iii) 再利用可能なハードウェアによるスケーラブルな生産、(iv) 多くの従来の細胞生物学および生化学アッセイとのシームレスな統合を特徴とする、4つの主要な革新を特徴とする当センターのPAゲルプラットフォームを用いて対処可能です。この方法は、異なる機械的特性を持つハイドロゲルを生成するために、異なるアクリルアミドとビサクリルミドの比率を利用します (表1参照)。PAゲルは不活性であり、ECMタンパク質に直接結合しません。したがって、UV主導のフリーラジカル重合反応を用いて、ジ(トリメチルプロパン)テトラアクリレート、アクリル酸 N-ヒドロキシスクシニミドエステル(NHS-アクリレート)、ビサクリルアミドの薄い架橋ネットワークをPAゲル表面に結合させます (図1)。このネットワークはECMタンパク質に二重作用の接着面を形成します。NHSアクリル酸はECMタンパク質に安定した共有結合を提供し、テトラアクリレートは均一なECMタンパク質吸着を促進します。さらに、これらの基質からタンパク質やRNAなどの核酸を、ウェスタンブロッティングや逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)などの下流細胞生物学解析と互換性のある方法で収集する方法を示す方法も提供しています。さらに、結果として得られるコンプライアンスPA基質は球状体の形成を支え、一定の焦点面内で球体を配置することで、3D細胞挙動の体系的解析を可能にします13。
これに対し、PAハイドロゲルの光学的制約により、特に全反射蛍光(TIRF)顕微鏡などの高度なイメージングモダリティでの使用が制限されています14。この制約に対処するため、TIRFイメージングに最適化された機械的に調整可能なシリコーンベースのECM基板を開発しました。これらの材料は、ガラスに非常に近い屈折率を持ちながら、広い範囲にわたって可変剛性を維持しています (図2A)。異なる部分比の薄いシリコーンジェルをカバーガラスにスピンコーティングし、ECM共役の前に施します (図2Bおよび 表2)。しかし、シリコーンの本質的な疎水性と化学的不活性性により、直接的なECM共役は不可能です。したがって、ECM配位子の共有結合を可能にする表面修飾戦略を実装します。酸素プラズマ処理はシリコーン表面にヒドロキシル基を導入します (図2C)。その後、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)がこれらのヒドロキシル基を反応性アミンに変換します。ゼロ長のカルボジイミド架橋剤である1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)は、ゲル表面のアミン基とECMタンパク質上のカルボキシル基間の共有結合アミド結合の形成を促進します。
これらのECMプラットフォームは、ECM剛性依存のシグナル機構を探査するためのコスト効率が高く再現性が高く、スケーラブルなシステムを提供します。その柔軟性により、生化学的アッセイ、高解像度イメージング、ハイスループットワークフローとのシームレスな統合が可能となり、ECMの剛性が細胞行動にどのように影響し、疾患進行を促すかを調査することが可能になります。
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プロトコル
1. PAベースのECMハイドロゲルの生成
- PAゲルアタッチメントのためのガラス表面の機能化
注意:すべての工程は軌道シェーカーの室温で行ってください。工程の間には高品質の水でしっかりすすすぎてください。- ガラス表面を10%の漂白剤で3時間、化学物質耐性のある皿(例:発泡スチロール)で洗浄してください。ガラスを完全に覆う十分な量を使い、泡や乾燥した部分が詰まらないようにしてください。
注意:漂白剤は非常に腐食性が高く反応性の強い化学物質です。メーカーの安全指示に従ってください。 - カバースリップを0.2 M塩酸(HCl)に16時間、シェーカーで優しく攪拌しながら孵化させます。
注意:塩酸は非常に腐食性が高く、皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。 - 0.1 M NaOHを加えて1時間孵育します。
注意:NaOH溶液は腐食性があり、皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。 - カバースリップを0.5%APTESの高品質な水に30分間孵化させます。
注意:APTESは有毒です。適切なPPEを着て、排気フードでAPTESと連携してください。 - 残留APTESを取り除くために、大量の水でカバースリップをすすぎます。
注意:洗浄が不完全の場合、次の段階でAPTESとグルターアルデヒドの反応を引き起こし、白色沈殿物が生成され、ガラス表面の活性化を損なう可能性があります。 - カバースリップを0.5%グルターアルデヒドにPBSで1時間培養します。
注意:グルターアルデヒドは有毒です。適切なPPEを着てフルターアルデヒドを換気フードで扱いましょう。 - カバースリップは吸収性のある素材(例:ペーパータオル)で一晩乾かします。カバースリップは清潔で密閉された容器に保管して使用してください。
- ガラス表面を10%の漂白剤で3時間、化学物質耐性のある皿(例:発泡スチロール)で洗浄してください。ガラスを完全に覆う十分な量を使い、泡や乾燥した部分が詰まらないようにしてください。
- PAハイドロゲル溶液およびゲル鋳造の調製
注:指定された弾性弾性率を持つハイドロゲルを得るために必要な製剤は 表1に示されています。異なる実験用途に推奨されるゲル体積とガラス寸法は 表3に示されています。- PAハイドロゲル成分を1.7 mLのマイクロ遠心分離機チューブに混合し、過硫酸アンモニウム(APS)とテトラメチルエチネジアミン(TEMED)を除きます。
注意:高剛性のゲルは急速に重合し、鋳造が完了する前に硬化する可能性があるため、大量の準備は避けてください。 - PAゲル混合物、APS、TEMEDチューブを真空チャンバーで25 mmHgで30分間脱ガスします。
- 疎水性トップカバースリップは、綿棒を使って防水コーティングを塗って洗浄します。カバースリップに汚れがないか確認し、ジェルの重合を安定させてください。
- 脱気液にAPSとTEMEDを加え、活性化されたカバースリップに優しくピペットで移します。
- 疎水性のカバースリップを溶液の上に置き、均一で薄いハイドロゲル層を作ります。ゲルを室温で35分間重合させます。カバースリップの間に気泡が閉じ込められず、溶液が端からこぼれないように注意してください。
注意:適切な厚さを確保するために、ジェル鋳造の推奨量に従ってください。過度に薄いゲルは細胞が下にあるガラスを感知できるようにします。ジェルサンドイッチを分解する前に、マイクロ遠心分離機内の残留混合物を確認し、重合を確認します。 - ハイドロゲルサンドイッチをPBSに浸して層を分離します。ハイドロゲルが活性化されたボトムカバースリップにしっかりと付着し、疎水性のトップカバースリップが簡単に外れることを確認してください。
- PAハイドロゲル成分を1.7 mLのマイクロ遠心分離機チューブに混合し、過硫酸アンモニウム(APS)とテトラメチルエチネジアミン(TEMED)を除きます。
- ECM配位子を用いたハイドロゲルの官能化
注意:このセクションのすべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で実施されなければなりません。- ハイドロゲルを70%エタノールに浸して滅菌し、その後無菌PBSで組織培養用プラスチック器具に移します。
注意:ハイドロゲルをエタノールに長時間浸漬しておくと、ゲルが脱水し、ECM結合が損なわれます。 - 水、エタノール、HEPES、ビサクリルアミドからなるマスターミックスの官能化溶液を準備します(表4参照)。
注意:ビサクリルアミドは吸入または摂取時に有毒です。 - UV光起始剤とテトラアクリレートの希釈溶液を準備します。両試薬はエタノールに溶解しています(表4)。
注意:過剰な量は過剰な重合や黒い表面の沈着を引き起こす可能性があるため、毎回連続希釈を行いましょう( 図3A参照)。 - 分析用バランスを使って必要なNHSアクリレートの量を計量してください。使用直前にNHSアクリレートを50%エタノール/50%水に再懸濁してください。
注意:過剰なNHS-アクリレートは目に見える黒い表面堆積物を形成し、ECMコーティングの不均一さを引き起こす可能性があります(図3B)。 - マスターミックスに、ステップ1.3.2で準備されたマスターミックスにUV光起化剤、テトラアクリレート、NHSアクリレート溶液を加えます。PBSを吸引し、マスターミックスをゲルに加え、完全に覆われるようにします。
- ハイドロゲルを(組織培養皿の蓋なし)400秒間紫外線にさらします(波長365nm未満の紫外線源)。
注意:UVライトを扱う際は適切な目の保護具を着用してください。 - ジェルを取り出して氷の上に置きます。官能化溶液を吸引し、その後、予冷の滅菌25 mM HEPES(pH 6.0)で3回洗浄し、その後0.9%NaClの予冷消毒で3回洗浄します。
- ハイドロゲルは、選択されたECM配位子とともに、予冷された無菌100 mM HEPES(pH 8.0)と100 mM NaClで、軌道シェーカーで4°Cで一晩培養します。
注意:ECM配位子の濃度はユーザーの裁量で選択可能です。しかし、同じバッチ内で剛性の異なるすべての基質で同じリガンド濃度を維持することが重要です。 - 16時間後にECMリガンド溶液を慎重に吸引します。ハイドロゲルをPBSで3回洗い、セラムフリーのベースメディア(PBS)を加えて水分補給を保ちます。細胞シード前に、組織培養インキュベーターで一晩培養して無菌性を確認します。
注:汚染が存在する場合、ベース培養培地で37°Cの一晩の培養後、培地は濁って見えることがあります。 - ゲルはすぐに細胞シードに使用するか、4°Cのベース培地で3週間以内に保存してください。
- ハイドロゲルを70%エタノールに浸して滅菌し、その後無菌PBSで組織培養用プラスチック器具に移します。
2. 機械的に調整可能なシリコーンベースのECM基板の生成
- シリコンジェルコーティング用のガラスカバースリップの準備
- ガラスカバースリップを3MのNaOHで20分間洗い流します。
- 高品質の水で5回しっかり洗い、最後に水を吸引してください。自然乾燥させ、残った水滴やゴミを除去するために窒素エアジェットで除去してください。
- シリコーンジェルの調製
- 表2に指定された重量比に従い、2成分シリコーンエラストマーの成分Aと成分Bを分析バランスを用いて計量します。切断したピペットの先端を使って粘性のある溶液を吸引します。
- 成分Aと成分Bをピペットチップで十分に混ぜて完全に混ぜます。
- 混合気を真空チャンバーで25 mmHgで10分間脱ガスします。
- ガラスカバースリップへのジェル鋳造
- スピンコーターの上に置いたゴムマットの上にカバースリップを敷き、しっかりと中央に固定します。
注意:ゴムマットは適切な真空シールを保証します。十分なシールがなければ、カバースリップがずれて破損することがあります。不適切なセンタリングは均一でないコーティングを引き起こすことがあります。 - カバースリップを固定するために掃除機をかけてください。
- カバースリップの中心に100μLのゲル混合物を加えます。スピンコートは500rpmで10秒、続いて8,000rpmで60秒かかります。
- コーティングされたカバースリップを80°Cで2時間焼きます。室温まで冷ます。
注意:使用前に最大1ヶ月室温で保存してください。
- スピンコーターの上に置いたゴムマットの上にカバースリップを敷き、しっかりと中央に固定します。
- ECMリガンドを用いたシリコーンゲルの機能化
- シリコンジェルコーティングされたカバースリップを酸素プラズマに11Wで5分間曝露します。
注意:酸素プラズマへの長時間または高出力曝露は、ゲルの亀裂を引き起こす可能性があります。使用する機器によっては、最適な電力と時間の組み合わせをテストする必要がある場合があります。 - エタノール95%、APTES0.5%、dH2O4.5%を含むシラン化溶液を準備します。
注意:以降のすべての工程はバイオセーフティキャビネット内で無菌状態で行ってください。
注意:APTESは有毒です。適切なPPEを着て、排気フードでAPTESと連携してください。 - ゲルコーティングされたカバースリップをシラン化溶液とともに10分間培養します。
- PBSで5回しっかり洗ってください。
- 100 μg/mLのEDCと所望のECMを含むECM溶液を、PBSで所定濃度で準備します。
注意:EDCは溶液中で不安定で、湿気に敏感です。使用前に新鮮な状態で調理し、湿気や直射日光から守られた涼しく乾燥した場所に密閉して保管してください。
注意:EDCは飲み込むと有害で、吸入すると有毒です。適切なPPEを着用し、排気フードで作業してください。 - カバースリップをECM溶液と共に37°Cで1時間、または4°Cで一晩孵化します。
- カバースリップをPBSで5回洗ってください。ベース培地ですすいでから細胞を加えます。
注意:最適な細胞密度は特定の細胞株や実験目標(例:形態のサブコンフルエントや細胞間接着の単層)によって異なります。例えば、線維芽細胞が48時間以内に50%の合流を達成するために、0.1 x 106 cells/cm² の密度が一般的に用いられます。
- シリコンジェルコーティングされたカバースリップを酸素プラズマに11Wで5分間曝露します。
3. 免疫染色および画像診断のためのECM基質の準備
- PA基質における免疫染色および画像診断
注:18ミリPAハイドロゲルは一般的に定量分析に十分な画像面積を提供します。イメージング用途では、ハイドロゲルを鋳造し、15 mLチューブから調製した「オレンジチャンバー」で免疫染色を行います。構造的な強度を保つ限り、オレンジのチャンバーは複数回のジェル鋳造や染色に再利用してください。- ポリカーボネートフィルムとシリコーンゴムフィルムから作られたパンチリングで、スペーサーやガスケットの準備に18mmの外径と14mmの内穴パンチを使用します。
- 15 mLの遠心分離機チューブキャップの中央に開口部を開け、ハサミでジェル鋳造と染色のためのチャンバーを作ります。
- 14mLの地点で遠心分離機のチューブを見ました。不均一な縁をメスで削り、キャップの縁をヤスリで削って標準的な12ウェルプレートに合うようにします。
- ハイドロゲルカバースリップサンドイッチ(セクション1で説明)を組み立て、スペーサーリングを活性化されたカバースリップに取り付けます。
- ゲルが完全に重合したらサンドイッチを分解します。
- 18mmハイドロゲルを滅菌し、無菌PBSを用いた12ウェル組織培養プレートに移します。
- セクション1で説明したECMリガンド機能化を実行します。
- 細胞を種付けし、4%ホルムアルデヒドで固定します。
注意:アルコール系の固定剤はジェルを脱水させ、構造的な強度を損なうため避けてください。
注意:ホルムアルデヒドは有毒であり、必ずフームフード内で使用してください。 - (任意)サンプルを遠心分離機のチューブキャップチャンバーに再組み立てします。チャンバーを密閉するにはシリコン製ガスケットを使いましょう。
注意:染色前に数時間PBSで漏れテストを行うこと。この方法は一見手間がかかるかもしれませんが、均一な染色を促進し、抗体の消費を減らします。 - ユーザーの希望するプロトコルに従って免疫蛍光染色を進めてください。
- 染色後、サンプルを50%グリセロールを補ったPBSに保存します。サンプルはできるだけ早く画像化してください。
注意:硬化する標準的なマウンティング媒体は避けてください。時間とともにハイドロゲルを割り、サンプルを損傷する恐れがあります。蛍光の強度は時間とともに減少します。最適な信号品質のために1週間以内に画像を撮ること。 - 組織培養皿のガラス底面に少量のPBS(またはマウンティングメディウム)を置きます。染色されたハイドロゲルを慎重に滴の上に逆さまにして、細胞がガラスの表紙に向かうようにしてイメージングを進めます。
- シリコーン系ECM基板上での免疫染色およびイメージング
- 4%ホルムアルデヒドでサンプルを定着し、標準的な免疫蛍光プロトコルでガラス底の皿に直接染色します。アルコール系の固定剤はECMの基材に亀裂を生むため避けてください。
- 従来の蛍光顕微鏡を用いて直接サンプルをイメージできます。
4. ECM基質上にプレートされた細胞からタンパク質およびRNAを採取すること
- 鉗子を使って培養皿からジェルを慎重に取り出し、滅菌PBSに浸して残留培養培地や血清を洗い流します。
注意:カバースリップは非常に壊れやすく、簡単に壊れやすいので、慎重に扱ってください。 - ハイドロゲルの端を低綿くりのウェットティッシュで優しく叩き、余分なPBSを取り除きます。
- 組織培養皿の蓋に適切な量のRNA抽出バッファーを加えます。
注:フェノール・グアニジン系試薬はPAゲルからのRNA抽出と両立します。実験的要件に応じてタンパク質溶解バッファーを使用することがあります。リシスバッファーインキュベーション後、顕微鏡でサンプルを可視化し、細胞の完全な破壊を確保します。 - カバースリップ(ゲル面が下)を溶解液の上に置きます。すべての細胞が均一に溶けるように、ハイドロゲルを何度か慎重に持ち上げたり下げたりしてください。
- 溶け合いを放出するために、ジェルの表面を優しくこすり落とします。
注意:市販のプラスチック製セルスクレーパーは使用しないでください。硬いプラスチックは軟いハイドロゲルを傷めたり、溶液をジェルの塊で汚染する恐れがあります。スペーサー作成に使われる軟質プラスチック(ステップ3.1.1参照)はこの目的に適しており、カスタムスクレーパーの製造にも再利用可能です。 - RNAまたはタンパク質の解体液は、従来の生化学的方法でさらに処理するまで-80°Cで保存するか、すぐに使用してください。
5. 単一平面球面文化の生成
- 75 Pa PAハイドロゲルを18mmカバースリップに準備し、基底膜抽出物(BME)または他の適切なECMリガンドで表面を機能化して細胞結合を促進します。
- ECMコーティングされたハイドロゲルまたはシリコーンゲルに、所望の密度でシードセルを植え付けます。
- 2時間後に、未結合細胞を優しく取り除き、予冷基底培地で希釈したBMEオーバーレイを加えます。
注意:BMEは温まると重合します。ピペッティング前にプレコールドのチップを用意しましょう。取り込まれるBMEの割合は、完成した3D足場の望ましい機械的完全性と安定性によって決まります。 - 培養を37°Cの組織培養インキュベーターで1.5時間培養し、BMEの重合を促します。
- 3Dゲルを完全に覆うために、優しく細胞培養培地を加えます。
- 培養を標準的な条件下で維持すること。細胞は時間とともに成長し、3D球体へと自己組み立てされ、望ましい実験的終点に達するまで続きます。
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結果
表1の製剤で生成されたPAゲル剛性は、レオメーターを用いて実験的に検証されました。3桁にわたり、0.4 kPa、6 kPa、60 kPaの公称剛性値を持つゲルが選ばれました。測定された剛性値は、400 Paゲルで363 ± 76 Pa、6 kPaゲルで6.41± 0.50 kPa、60 kPa ゲルで36 ± 8 kPaでした(図4A)。PAゲルへの均一なECM付着を評価するために、蛍光標識されたフィブロネクチンをゲル表面に共役させました。1ゲルあたり5つのランダムな視野を画像化し、平均蛍光強度を定量化しました。蛍光標識された0.4 kPaおよび6 kPaのフィブロネクチン被覆ゲルは、標識されていないフィブロネクチン被覆のゲルに比べて蛍光強度が増加しました。各ゲルの5つの異なる領域で蛍光強度が一貫しており、均一な表面共役を示しています(図4B)。
基質硬性に対する細胞応答を評価するために、A549の肺腺癌細胞を、硬...
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ディスカッション
示されたECM製造プロトコルは、再現可能でスケーラブルかつコスト効率の良いワークフローを提供し、ほとんどのラボで容易に実装可能です。従来のガラスやプラスチックの培養陶器は便利で迅速なデータ収集を可能にしますが、合成基質は生理学的に重要な組織の剛性を再現できません。ポリジメチルシロキサン(PDMS)やゼラチンメサクリロイル(GelMA)などの代替的な機械的可変基質は製造が容易ですが、一般的にサブキロパスカル範囲の剛性値を達成できず、脳や肺などの軟部組織のモデリングには適していません。これに対し、PAハイドロゲルやシリコーンゲルは、組織力学の幅広い範囲をカバーする剛性値を持ち、多くの細胞ベースのアッセイと互換性を持ちながら、単純なリガンド共役をサポートします。さらに、この方法は現在の高価ながら便利なスルフォ-SANPAH法よりも安価です。
これらのECM模倣足場はECM剛性の精密制御を可能にしますが、い...
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、CIHR研究優秀・多様性・独立初期キャリア転換賞(202305ED8-509143-244657、F.B.K.へ)および国立衛生研究所がん研究所R35(CA242447-01A1)からの資金援助を受けました。K.J.はデイモン・ランヨンがん研究財団のロイス・A・チネリフェロー(DRG-2547-25)です。
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材料
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| (3-アミノプロピル)トリエトキシシラン (APTES) | 919-30-2 | - | Thermo Fisher Scientific |
| 1.7 mL マイクロ遠心管 | - | LMCT1.7B | FroggaBio |
| 組織培養用12ウェルプレート | - | 83.3921 | Sarstedt |
| オレンジチャンバー用15 mL遠心管 | - | CLS430790 | Corning |
| 2-ヒドロキシ-4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン (Irgacure) | 106797-53-9 | - | Thermo Fisher Scientific |
| 2% ビスアクリルアミド溶液 | 110-26-9 | - | Bio-Rad |
| 3-(3-ジメチルアミノプロピル)-1-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) | 25952-53-8 | - | Chem Impex International |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 | 28718-90-3 | - | Sigma |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) | - | D1306 | Invitrogen |
| 40% アクリルアミド溶液 | 01/06/1979 | - | Bio-Rad |
| 50% グルタールアルデヒド | 111-30-8 | - | Thermo Fisher Scientific |
| 6 cm組織培養用皿 | - | 83.3901 | Sarstedt |
| A549細胞 | - | CCL-185 | ATCC |
| アクリル酸 N-ヒドロキシサクシニミドエステル | 38862-24-7 | - | Thermo Fisher Scientific |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ抗体 | - | A11008 | Invitrogen |
| Alexa Fluor 594 NHSエステル (tris(triethylammonium salt)) | - | A37572 | Invitrogen |
| 過硫酸アンモニウム | 7727-54-0 | - | Bio-Rad |
| クリア耐衝撃ポリカーボネートフィルム (0.005インチ; スペーサー) | - | 85585K72 | McMaster-Carr |
| CY 52-276 シリコンゲル、成分AとB | 2624028 | - | Dow |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | - | 11995-065 | Thermo Fisher Scientific |
| 無水エタノール | 64-17-5 | - | Greenfield Canada |
| Fast SYBR Green Master Mix | - | 4385612 | Thermo Fisher Scientific |
| ウシ胎児血清 | - | A52567-01 | Thermo Fisher Scientific |
| フィブロンネクチン | - | 356008 | Corning |
| ホルムアルデヒド (16%) | - | 28908 | Thermo Fisher Scientific |
| HEPES | 7365-45-9 | - | BioShop |
| 高温用シリコンゴムシート (0.020インチ; ガスケット) | - | 86435K452 | McMaster-Carr |
| 塩酸 | 7647-01-0 | - | BioShop |
| 大型中空穴パンチツールセット | - | 66000 | Mayhew Pro |
| マトリジェル | - | 356234 | Corning |
| 培養液用ボロシリケートガラス瓶、250 mL | - | CLS1395250 | Corning |
| 培養液用ボロシリケートガラス瓶、500 mL | - | CLS1395500 | Corning |
| MicroAmp Fast Optical 96ウェル反応プレート | - | 4346906 | Thermo Fisher Scientific |
| 顕微鏡スライド用カバーガラス、直径18 mm | - | 72222-01 | Electron Microscopy Sciences |
| 顕微鏡スライド用カバーガラス、直径50 mm | - | 1.84E+16 | eBay |
| PBS (1×) | - | 14190144 | Thermo Fisher Scientific |
| PBS (10×) | - | 70011044 | Thermo Fisher Scientific |
| ファロイジン | 17466-45-4 | - | Biotium |
| ホスホ-FAK (Tyr397) 抗体 | - | 85567 | Cell Signaling Technology |
| ホスホ-MLC (Ser19) 抗体 | - | 3671 | Cell Signaling Technology |
| プラズマクリーナー | - | PDC-32G | Harrick Plasma |
| qPCRプライマー (フォワードとリバース) | - | N/A | Integrated DNA Technologies |
| qScript cDNA合成キット | - | 95047 | QuantaBio |
| Rain-X | - | - | Rain-X |
| ねじ式キャップ付きチューブ、円錐底、15 mL | - | 62.554.101 | Sarstedt |
| ねじ式キャップ付きチューブ、円錐底、50 mL | - | 62.547.205 | Sarstedt |
| 血清学的ピペット、10 mL | - | 170356N | Thermo Fisher Scientific |
| 血清学的ピペット、25 mL | - | 170357N | Thermo Fisher Scientific |
| 血清学的ピペット、5 mL | - | 170355N | Thermo Fisher Scientific |
| 血清学的ピペット、50 mL | - | 170358N | Thermo Fisher Scientific |
| 水酸化ナトリウム | 1310-73-2 | - | BioShop |
| SYPRO Ruby タンパク質ゲル染色 | - | S12000 | Invitrogen |
| TEMED | 110-18-9 | - | Bio-Rad |
| TRIzol試薬 | - | 15596026 | Thermo Fisher Scientific |
| UVチャンバー | - | 165-5031 | Bio-Rad |
参考文献
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