液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

Summary

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。

Abstract

液滴界面二重層(DIB)は、制御された電気刺激下で脂質および脂質ペプチド膜の電気機械的特性を探査するための調整可能なプラットフォームを提供します。DIBは、従来のパッチクランプ技術で得られる桁違いに大きな膜面積で、単一チャネルおよびアンサンブルイオン伝導度測定を可能にし、電気機械的変形やそれがイオン伝導性ペプチドに与える影響の膜レベルの解析を可能にします。バルク炭化水素油相を通じて膜構造を体系的に調整することで(例:ヘキサデケーン[C16]対ドデカン/ヘキサデケーン[C12/C16] [25%/75%、v/v])、このボトムアッププラットフォームは膜組成や油環境の体系的な変動を可能にし、膜の粘弾性や構造再編成、そしてペプチドイオン伝導に影響を与えます。グラミキシジンAドープされた1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン膜の異なる炭化水素油組成を用いた組み立ておよび膜を準安定電気機械状態に駆動する電圧パルスプロトコルの適用に関する詳細な手順が提供されています。適応膜イオン伝導を特徴づけ、モデル膜システムにおける短期可塑性様(STP様)および長期増強および抑制様(LTP様/LTD様)応答を含みます。より広くは、このプロトコルは組成依存的かつ膜レベルの電気機械的寄与を体系的に調査し、脂質膜環境がイオンチャネル機能を調節する仕組みを体系的に調査するための堅牢かつ再現性のあるアプローチを提供します。

Introduction

生体膜はイオン伝導を調節し、電気的および化学的シナプス^1,2,3,4を通じてニューロン間の通信を可能にする重要な超分子構造です^。 この種のコミュニケーションはさらにシナプス可塑性によって制御されており、シナプスの構造変化は、短期可塑性(STP)と長期的な増強または抑制(LTPまたはLTD)という形で記述される^5,6の期間にわたってその強度と持続性を調節します。これらの現象は、神経活動に反応して膜の伝導度が動的に変化するものであり、しばしば神経可^塑性と結びついており、これは学習^や記憶8の基盤となる。従来の可塑性モデルは、タンパク質合成、輸送、リン酸化を通じたイオンチャネルの生化学的調節を強調する^{ことが多い9。}しかし、可塑性モデルにおける神経細胞膜の役割は、ほとんどの場合見過ごされてきました(^10,11)。

パッチクランプ法は半世紀以上にわたり単イオンチャネル電気生理学の研究に用いられてきました。しかし、完全なシナプスや大規模合成モデルよりもはるかに小さい膜領域のみを調査できます。そのため、メソスケールの膜再編成や変形の研究には技術的制約があります。メソスケールは膜生物物理学の多くの側面を理解するための臨界尺度としてますます認識されています(^12,13)。

1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)ドロップレット界面二重層(DIBs)^14,15を単価ペプチドカチオンイオン球グラミキシジンA(gA)とドーピングしてイオン伝導をモデル化する方法が提示されています。これは電気シナプスで起こる現象に似ています。このシステムはいくつかの重要な利点を持っています:(i) DIBは体系的な膜^再編成を可能にする調整可能な脂質および油のプラットフォームを提供します。(ii) DIBは、長さスケール^17,18の範囲にわたる単一チャネルおよびアンサンブルチャネルイベントの研究を可能にします。(iii) DIBは、集合的に電気機械的に誘起された膜再構築を捉えるサブ^ミリ波2サイズの膜パッチの解析を可能にしつつ、単一チャネルイオン伝導事象の解像能力を保持します^19,20。この方法は、従来のパッチクランプでアクセスできる膜領域を超えて、膜電気力学を同時に電気的および光学的に問い合わせる必要がある研究に最も適しており、離散チャネルイベントの解消能力を保持しています。特に、膜の組成、油環境、そして押し付けられた電圧波形が集合的な膜の再構築やペプチド伝導にどのように影響するかを調べる実験目的で有用です。この方法は、ネイティブ細胞構造や、完全な生物膜におけるタンパク質立体構造変化の直接分子読み取りを必要とする実験にはあまり適^{していません。}

生理学的に関連する電気刺激を適用することで、DIBは非平衡定常状態に誘導され、動的電気機械的再構築によってペプチドイオンチャネル伝導が変化します。これらのイオン伝導の出現的な変化は、神経科学^22,23,24で論じられている神経学的STP、LTP、LTD現象と記述的に類似しています。本研究では、これらの挙動は主に粘弾性やモデル^{膜システムにおける}粘弾性や圧縮性などの内在的な膜力学的特性に関連する電気刺激に対する膜レベルの物理的応答として解釈されます。特筆すべきは、本研究が脂質二重層が持続的な導電シフトと刺激後の容量性電荷蓄積を通じて基本的な電気記憶を示すという既存証拠に基づいています。14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^。34は、複雑な細胞機構が存在しない中で脂質二重層が適応的かつシナプス様の機能を支えるメカニズムに関する新たな知見を提供しています。最後に、この方法論は構造と機能の関係や、単純な構造再編成からマクロスケールの行動がどのように生じるかを直接検証することも可能にします(21,25,27)。

Protocol

すべてのガラス器具や準備機器は適切な実験用洗剤で徹底的に洗浄し、サンプル準備前に蒸留水で洗い流してください。常に安全メガネを着用し、ニトリルまたはラテックス手袋を着用して汚染防止しましょう。すべての化学廃棄物は、機関の安全ガイドラインに従って処分してください。揮発性溶剤は機関の安全ガイドラインに従って適切に保管されていることを確実にしてください。実験室のスペースとハードウェア(図1A)、実験用容器(図1B)、電気および光学接続(図1C)が障害物を遮るものがなく、障害物がないことを確認しましょう。

1. 水性緩衝液の調製

1. 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)と塩化カリウム(KCl)の適切な量を計量し、望ましい最終濃度(例:10 mM MOPS、500 mLで0.1 M KCl)を得ます。
2. MOPSとKClを500mLの容量フラスコまたは目盛りシリンダーに~450mLの蒸留水に加え、磁気攪拌棒で完全に溶けるまでかき混ぜます。
3. 校正済みのpHメーターでpHを測定してください。連続攪拌しながら、0.25mLずつ1M水酸化カリウム(KOH)または塩酸(HCl)を加えてpHを7.4に調整します。
4. 蒸留水で合計500mLにしてよく混ぜます。バッファーを清潔でラベル付きのボトルに移し、密封して4°Cで保存します。
   注意:バッファは最大~2ヶ月間使用してください。使用前にpHを確認し、7.4に再調整してください。

2. グラミキシジンストック溶液の調製

1. 化学換気フードで、清潔な20mLのガラスバイアルにグラミチジンA(gA)5mgを加えます。ガラスまたは気密シリンジで10mLのメタノールを加え、ペプチドが完全に溶解するまで渦巻きます。バイアルに「gAストック」とラベルを付け、-80°Cで保存してください。
   注:アンサンブル実験では脂質:ペプチドのモル比が~1:^10-4です。単一チャネル実験では、1:10〜100倍の下位ペプチド(1:^10-5–^10-6)を用いて、短い記録時間(<1分)で個々のイベントを分離します。希釈したストックを準備することで、低モル比(<~1:^10-4)でのピペッティング精度が向上します。
2. さらに20mLのガラスバイアルをアルゴンガスでパージし、粉塵を取るためにそれぞれ5秒ほどパージしてください。
3. 清潔な気密シリンジを使い、パーグされたバイアルごとに9.9mLのメタノールを注入します。
4. 無菌の気密シリンジを用いて1つのバイアルに100μLのgAストック溶液をピペットで抽出し、総体積を10.0 mLにします。このバイアルに「A」とラベルを貼ってください。メタノール中の濃度=2.66 μM gA。
5. 2番目のガラスバイアルに100μLの溶液「A」をピペットで注ぎ、総体積10.0 mLを得ます。このバイアルを溶液「B」とラベル付けしてください。メタノール中の濃度=26.6 nM gA。
6. 瓶はキャップで密封し、パラフィルムで包みます。
7. すべてのgA溶液は-80°Cで保存し、使用まで保管してください。

3. 脂質ペプチド小胞の調製

1. アルゴンガス入りの20mLのガラスバイアルを5秒ほどパージします。
2. バイアルに1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)脂質を4mg追加します。
3. フームフード内にガラスピペットを使って1mLのメタノールを加えます。脂質がすべて溶けるまで、優しく渦巻くか渦巻きます。
4. 500μLの気密型シリンジを用いて、178μLの溶液「A」を加えます(アンサンブルレベルのSTP実験用;DPhPC:gAモル比=1:^10-4)または890μLの溶液「B」(単一チャネル実験用;DPhPC:gAモル比=1:5×^10-6)をDPhPCメタノール溶液に投入します。優しく渦巻きで混ぜます。
5. ヘムフード内の穏やかなアルゴン流の下でメタノールを蒸発させ、バイアルの底に薄く均一な脂質膜が形成されるまで加熱します。
6. 開いたバイアルを40°Cの真空オーブンに入れ、10〜12時間または一晩フル真空で残留溶媒を除去します。
7. 真空オーブンからバイアルを取り出し、STP実験用にセクション1で準備した0.1 M KClバッファーを2 mL加えると、懸浮液中の脂質濃度とグラミキシジン濃度はそれぞれ2.36 mMおよび236 nMとなります。単一チャネル実験の場合は、セクション1で準備した1 M KClバッファー2 mLを加えます。ボルテックスにより脂質膜を再水和させ、2 mg/mLの脂質懸濁液が得られ、最終的な懸濁中の脂質濃度はそれぞれ2.36 mMと11.8 nMとなります。
8. 小瓶を-80°Cで少なくとも6分間冷凍し、その後40°Cのホットプレートまたは水浴で6分間解凍します。一瞬の渦を混ぜてみる。この凍結融解サイクルを6回繰り返し、多層状小胞の形成を促進します。
9. 製造元の指示に従い、0.1μmの孔径トラックエッチング膜を備えた脂質小胞エクストルーダーを組み立てます。500μLのバッファをエクストルーダーに3回通して膜を水和させ、漏れがないか確認してからバッファーを廃棄します。
10. 解凍した脂質ペプチド懸濁液1 mLをエクストルーダーに注入し、0.1 μm膜を31回通過して直径約100 nmの単層状小胞を得てサイズの均一性を確保します。
11. 押し出された小胞(大型単層小胞、LUV)を1 mLのPCRチューブに移し、標識を付けて4°Cで保存します。準備から2週間以内に使用してください。
12. 残った非押出脂質タンパク質懸浮液を元のバイアルに封じ、パラフィルムで包み、後で使用するために-80°Cで保存します。
13. 以前に凍結された非押出サンプルを使用する場合は、ホットプレートを使って40°Cで再溶解するか、試料を室温まで温めてから押出します。

4. アガロースゲルの調製

1. きれいな50mLのガラスビーカーをホットプレートの上に置きます。脂質膜の水和に使用するバッファー50mL(例:10 mM MOPS、0.1 M KCl、pH 7.4)にアガロース錠剤1錠を加え、1%アガロースゲル溶液を形成します。
2. きれいなテフロンの攪拌棒を加え、タブレットが消えるまで強くかき混ぜます。
3. ビーカーをアルミホイルで覆い、金属ヘラで小さな通気口を開けます。ホットプレートの温度を220〜230°Cに設定します。溶液は透明になり、巻き起こる沸騰状態に達し、アガロースの完全な溶解を示します。
4. 火を止めて、慎重にホイルを外してください。きれいな金属製のヘラで表面膜を拭い取ってください。熱いアガロース溶液はすぐに電極コーティングに使うか、後で使うためにビーカーで冷やして固まらせてください。
5. 電極アガロースコーティング後、固まったアガロースをホイルで覆い、パラフィルムで封印し、ラベルを貼って4°Cで保存します。必要に応じて、完全に溶けるまでかき混ぜて沸騰させて加熱します。

5. 電極の準備

1. 直径0.125mmの銀線を、ヘッドステージ用電極用に~70mm、接地用に~130mmの長さにカットします。
2. 開火(例:手持ちのライターやバーンゼンバーナー)を使い、各銀線の端を炎の最も熱い中央円錐に水平に持ち込み、先端が溶けて直径約0.2mmの球状の球体になるまで保持します(図2A)。
3. ワイヤーをきれいな表面に置き、顕微鏡で球体が球形で似た大きさかどうか確認します。ボールが長方形または不規則の場合は、先端を切り落として溶かしを繰り返します(ステップ5.2)。
4. 両方の銀線の端を新鮮な家庭用漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム、NaClO)の入ったガラス容器に入れます。ボールを完全に水に浸し、少なくとも1時間培養して表面を塩素化し、Ag/AgClを形成してください。鈍い茶灰色の外観は塩素処理の成功を示しています(図2B)。
5. ボールの端が鈍い灰色になったら、漂白剤からワイヤーを取り出し、蒸留水でしっかりすすいでから、きれいで糸くずのない表面に置いて乾かします。
6. ヘッドステージピペットホルダー1つとアース電極ホルダー1つを用意してください。ガラスカッターを使って100mmのホウケイ酸ガラス毛細管(外径1.0mm、内径0.58mm)を半分に切ります。
7. 半毛細管をヘッドステージピペットホルダーに挿入し、ホルダーを締めて固定します。接地電極ホルダーに100mmの毛細管を取り付けて固定します。
8. 130mm銀線のボール以外の端を接地電極キャピラリーに挿入し、ボールエンドが~20mm突き出るまで続けます。ワイヤーの反対側をホルダーにテープで貼り、接地用に~5mmの露出を残します。
9. 次のステップを70mmのヘッドステージ電極用ワイヤーで繰り返し、ワイヤーとヘッドステージコネクター(金色の部品)がしっかり接触するようにします。ヘッドステージコネクタ端の余分な配線をトリミングしてください。
10. 塩素化銀球をボールシャフト接合部のすぐ上、アガロースに浸して薄く均一なコーティングを形成します。少なくとも10回は出入りしてください。
11. 電極を取り外し、アガロースを室温でゲル化させます。必要に応じて繰り返し浸し、数十マイクロメートル厚の均一なアガロース殻を作ります。ワイヤーの上層や塗料をあまり高すぎたり低すぎたりしないでください(図2C)。
12. ヘッドステージとグラウンド電極をマイクロマニピュレーターに取り付ける。露出したアース線(~5mm)をアリゲータークリップでアンプの接地に接続します。
13. ピンセットを使って、ボール端と毛細管の中間あたりで各電極を優しく曲げ、ボール端が顕微鏡段に垂直になるようにします。顕微鏡の視覚的および映像キャプチャの視覚的歪みを最小限に抑えるために、90°を超える曲げを避けてください。
14. ホルダー内の電極の向きを調整し、アガロースコーティングされたボールエンドが顕微鏡のイメージング面に垂直になるようにします(図3A)。

6. 液滴界面二重層(DIB)の形成

1. 倒立顕微鏡のステージに、きれいで底が澄んだペトリ皿を置きます。皿にアルカン油(例:100%ヘキサデカン、または25%/75% v/v/vのドデカン/ヘキサデケーン)を~5mmの深さまで満たします(図1B)。
2. マイクロマニピュレーターの制御を使い、アガロースコーティングされた両方のボールエンドを油の表面から~2.5mmの深さまで油に沈めます。マイクロマニピュレーターの急速な動作は避け、電極ボールヘッドがペトリ皿に衝突するのを防ぎましょう。
3. 顕微鏡の焦点を調整し、両方のボールエンドとそのアガロースコーティングが鮮明にピントを合わせるまで調整します。電極は視野の端近くに配置し、両方を同時に観察できるようにします。
4. 校正済みの2μLピペットを用いて、押出された脂質ペプチド小胞懸液を吸引します。ピペットの先端で別々のピペットチップを使って、アガロースコーティングされた各ボールエンドに直接250 nLの懸濁液をゆっくりと注ぎます。ピペットの先端でアガロースシェルに触れないようにします。
   注意:手の振動を最小限に抑え安定性を高めるために、両肘を防振動テーブルの縁に固定してください。ピペッティングしていない方の手でピペットの手首を安定させ、ゆっくりと油にピペットを浸し、徐々に電極に近づいていきます。飛沫負荷中の短い息止めは、意図しない動きをさらに減らすことがあります。
5. 液滴が広がり、アガロースの殻を覆い、重力で電極からたるみを落とします。もしクリアであれば、ペトリ皿の壁を通って側面からたわみが見える(図3B)。
   注:液滴たわみにかかる時間は、小胞の大きさ分布、温度、アガロースの地形によって異なります。DPhPC DIBは、¹⁵滴沈着後少なくとも5分待ってください。
6. 防振動テーブルを軽く押して、飛沫の発生状況を評価してください。たわみ液滴が電極の動きに対してわずかな遅延で移動していることを確認し、完全に被覆された脂質単層液滴の形成を示しています。
   注:遅延運動は、水滴の周囲に脂質単分子層が形成されることで表面張力が大幅に低下し、油中で電極を動かす際の物理的応答が遅れることで発生します。
7. この挙動が見られない場合は、さらに2〜3分待って同じことを繰り返します。

7. 電気設備および二重層監視(視覚および電気)

1. 顕微鏡、防振動テーブル、ファラデーケージ、およびアンプ、デジタイザー、機能発生装置、コンピュータを含むすべての電気部品が共通のアースに接続されていることを確認してください(図1)。
2. 機器の接続はメーカーのセットアップガイドに従って配置してください。 図1Cを基本的な電気的および光学的構成の回路図参照として使用してください。DIB実験の接地³⁵、ハードウェア/ソフトウェア設定、ピペットオフセット調整に関する詳細な説明を参照してください。
   注意:材料表に記載されたすべてのソフトウェアおよびハードウェアについては、機器ごとのセットアップ手順に従って ください。
3. ヘッドステージとグラウンド電極をパッチクランプアンプに接続します。
4. 外部関数ジェネレーター(または取得ソフトウェアの出力チャネル)を設定し、10 Hz、10 mVの三角形電圧波形を生成します。接続されたオシロスコープと取得ソフトウェア内で振幅と周波数を確認してください。
5. 液滴が~10分ほど沈んだら、マイクロマニピュレーターを使って2つの液滴を優しく接触させます。電極の位置を調整し、液滴の接触面積が最初は^直径の~ 1/4以下に抑えられるようにします。
6. 10 Hz、10 mVの三角形波形をオンにし、アンプと取得ソフトウェアで容量電流応答を監視します。
7. 自発的な二重層形成を待ちます。電気的にはピーク・ツー・ピークの容量電流応答の拡大で示され、光学的には二重層接触による内部反射(楕円形の外観)が増加します(図4)。純粋な脂質二重層は三角形電圧刺激に対して長方形電流のプラトーを示し、一方で1:10^〜4 の脂質のgAドープ二重層は、アンサンブルイオン伝導を反射する傾斜プラトーを示すことを確認してください。
8. 電極をわずかに動かして、10 Hz、10 mVの三角形波形に対するピーク・ツー・ピークの容量電流応答を、C16またはC12/C16オイル中の約250 nL DIBに対して~100〜200 pAの間にし、約250〜500 pF³³の容量範囲に対応します。
   注意:高周波パルスや非ゼロ直流保持電圧は、電気湿潤や過剰な二重層膨張を引き起こし、液滴の合集や二重層破裂を引き起こす可能性があります。100〜200 pAの範囲は、二重層の安定性と信号対雑音比のバランスを提供し、刺激時に十分な面積拡大を可能にします。
9. DIBが凝縮したら、電極をオイルから取り出します。脂質サンプルとアガロースに使うのと同じ水性バッファーで電極ヘッドを徹底的にすすいでください。
10. ペトリ皿から水性の滴を滅菌注射器で除去してください。必要なら新しいオイルを補充し、電極を再び浸してください。第6節で説明した通り、LUV溶液を電極に再装填し、同じプロセスを繰り返します。
11. 安定した静電容量または導電応答が確認されたら、三角形波形をオフにし、DIBを少なくとも15分間平衡させてから刺激プロトコルを適用します。

8. 電気刺激プロトコル

1. パルス実験(アンサンブルSTP様およびLTP/LTD様応答)
   1. 関数ジェネレーターや取得ソフトウェアを設定し、望ましい振幅、持続時間、パルス間区間(例:PPF[ペアパルス促進]およびPPD[ペアパルス抑制]パターン)の電圧パルスを供給します。
   2. ビデオキャプチャソフトを開いてください。適切なカメラと対物レンズの設定を選択してください。フレームレートを最低20フレーム/秒に設定し、録画中に安定しているか確認してください。
   3. データ取得ソフトウェアでは、現在の信号に対してサンプリング周波数を少なくとも5 kHzに設定します。
   4. 新しいプロトコルを作成するには「新しいプロトコル>取得」をクリックし、「既存のプロトコルを修正するには> Acquire Edit Protocol」をクリックしてください。 習得モードタブで「エピソード刺激」を選択してください。ラン/トライアルを1に、スイープ/ランを1に設定してください。
   5. スイープの持続時間を実験の総持続時間より4秒長く設定してください。120秒のSTPプロトコル(60秒PPF + 60秒PPD)では、スイープ持続時間を124秒に設定し、刺激前後の基準値に2秒分の時間を確保します。
   6. 入力タブで、録音チャンネルを現在の入力に割り当てます。出力タブで、刺激チャネルを電極を制御する電圧出力に割り当てます。
   7. 波形タブを開きます。A列では、タイプをステップに、ファーストレベルを0 mV、ファーストデュレーションを2000 msに設定して、プレ刺激ベースラインを定義します。
   8. 列B(PPF)でタイプをステップに設定します。望ましい電圧振幅(例:+100 mV)、パルス持続時間(例:100 ms)、トレインレートを設定し、目標デューティサイクルに対応するパルス間間隔(例:90.9%)を設定します。
   9. C列(PPD)では、同じ振幅とパルス持続時間でタイプをステップに設定しつつ、トレインレートまたはインターパルス間隔を増加させて望む低いデューティサイクル(例:28.6%)を実現します。
   10. D列では、A列と同じ刺激後ベースライン(0 mV、2000 ms)を設定します。
       注意:波 形 タブ内のすべてのエポックの合計持続時間が モード/レート タブのスイープ持続時間を超えた場合は、エラーが解決するまでスイープ持続時間を少し延長してください。
   11. プロトコルを記述名(例:「STP_120s」)で保存してください。
   12. ビデオ録画を開始し、赤い丸の「録画」ボタンをクリックしてすぐに電気的取得・刺激を開始します。あるいは、デジタルトリガーを設定して、刺激開始時にビデオ録画と電気的取得を同時にトリガーするようにする方法もあります。
   13. 刺激の最初の60秒(PPF)では、測定された電流応答は一般的に最初のパルスから増加し、t = 60秒で目に見えるプラトーに達することがありますが、刺激の最後の60秒(PPD)では測定された電流応答は一般的に低下します(図5)。プロトコル終了時に電気的取得とビデオ録画を同時に停止します。
2. シングルチャネル実験
   1. パッチクランプアンプの前面パネルで、外部コマンド入力スイッチをOFFに設定してください。 保持電圧を+200 mVに設定してください。アンプ内蔵のローパスフィルターを1kHzに設定します。取得ソフトウェアでサンプリングレートを10〜50kHzに設定し、連続的な「ギャップフリー」記録モードを選択します。
      注:高いサンプリングレートは取得データの信号対雑音比を低下させる可能性があります。急速なゲーティング遷移や短時間のフリッカリング状態を解決する際には、より高いサンプリングレートを使用することが重要です。グラミキシジンAの平均開放寿命は通常0.1秒から10秒の範囲ですが、ちらつき状態はサブマイクロ秒およびμ秒の時間スケールで発生することがあります。したがって、^{このような事象}を捉えるために~50 kHzのサンプリングレートが必要になる場合があります。その後のJSMURFを用いた単一チャネル理想化解析により、可変信号対雑音比の録音間で堅牢なイベント検出が可能となりました³⁷。
   2. 外部コマンドを適用しない場合、基準電流信号の記録を開始します。アンプ上で、 電圧コマンド を OFF から「+」 に切り替えると、DIBに+200 mVの直流電圧がかかります。
   3. ベースラインドリフトを制限しながら、単一チャンネルのイベントをキャプチャするために~15秒の記録を行ってください。脂質:gAモル濃度が1:5×^10-6の場合_、チャネル伝導度ゲートイベントの生成と消失により、記録された電流は段階的に現れます。
   4. 録画を止める前に、 電圧コマンド を「+」 から「OFF」に戻してください 。 データの取得を停止し、記述的なファイル名(例:「DIB_C16_postPPF_200mV.abf」)で録画を保存します。
      注意:定められた持続時間の単一チャンネル記録は、PPF/PPDのセクション8に記載されているように、プログラムされた エピソディック刺激(EPSTIMULATION)によっても実施可能です。「ポストPPF」単一チャネル実験では、60秒PPFの直後に+200 mV DC電圧の エピソディック刺激 がピギーバックされます。

9. 膜面積とフラックス外挿

1. 各アンサンブル実験(STP、LTP/LTD)の終了時に、マイクロマニピュレーターで1つの電極をゆっくりと横方向に動かし、DIBを外します。
2. マイクロマニピュレーターの電極ホルダーを緩め、ホルダー内の電極を~45°回転させて、125μmの銀線がイメージング面に収まるようにします。
3. 電極の高さを調整し、顕微鏡でワイヤーがはっきりとピントを合わせられるまで調整します。カメラソフトを使って、ピント合わせた銀色のワイヤーの静止画やスクリーンショットを撮影してください。スケール画像は後でピクセルサイズをミリ単位でキャリブレーションするために保存してください。
4. 記録された電流トレースを参考文献28に記載された手順に従って処理し、連続的でアーティファクトのない電流と時間のデータを得ます(図6A)。
5. フレームインデックスを測定されたフレームレートで割り、取得タイムスタンプと照合することでフレーム-タイムマッピングを決定します。
6. スケールキャリブレーション画像および実験フレームを画像解析ソフトウェアにインポートします。
7. スケールキャリブレーション画像から既知のワイヤー直径(125μm)を使い、ソフトウェアのキャリブレーション機能(Analyze > Set Scale)を使って空間スケールを設定します。
8. 各実験のフラックス計算では、全刺激期間にわたるN個の時間点(例:120秒の実験で30点)を選びます。最初の時刻点が最初の刺激パルスに対応していることを確認しましょう。
9. 各時刻で、二重層の辺の交差点に線を引いてDIB直径を測定し、その長さを校正単位で記録します。
10. 測定された各直径を膜面積(A)に変換し、円形形状を仮定するか、特定の脂質-油配置に適した楕円幾何学的スケールファクターを用います。得られた領域を用いて、異なる実験条件下での膜面積の時間経過による変化を評価します(図6B)。
11. 各時刻に対して、対応する現在の値を面積で割ってフラックス(I/A)を求めます。すべてのN個のフラックスデータポイントを最初のフラックス値で割ると、正規化フラックス解析が必要な場合、最初のパルス(I/A) / (I₀/A₀)に正規化されたフラックスが得られます(図6C)。
12. フラックス、または正規化フラックスと時間、またはパルス数と時間をプロットします。すべてのアンサンブル実験(STP、LTP/LTD)に対する繰り返しフラックス解析(図6D)。
13. PPD中または2分以上に、最初のパルスに対してフラックスの持続的な上昇や正規化されたフラックスは伝導の強化と解釈し、ベースラインへの回復や最初のパルス値以下の低下は伝導の低下を示します。得られたタイムスケールを使って、反応を短期的な可塑性様行動(<2分)か長期的な増強/うつ様行動(>~5分)に分類します。

10. 単一チャネル解析

1. 生の単一チャンネル録音を好みの解析環境やclampSegインターフェースにインポートし、ソフトウェア機能の完全な説明や説明については³⁷ を参照してください。
2. 実験的な取得フィルタ(例:1 kHz Bessel)に一致するデジタルローパスフィルターを適用します。
3. パラメータ構成。
   1. アルファ(α)=0.05を定め、検出される各ステップがランダムノイズ変動である確率が<5%になる統計的信頼水準を定義します。
   2. ノイズ分布を推定し、イベント検出の統計的堅牢性を高めるために、1秒セグメントあたり 5,000〜10,000回のモンテカルロ 反復を指定します。
      注意:分析時間を短縮するために、可能であれば1秒の「チャンク」単位の並列計算処理を用いてください。
   3. フィルタリングされた電流トレースに対して JSMURF アルゴリズムを実行します。
4. モデル検証。
   1. 理想化された(方形波)コンダクタンストレースをフィルタリングした電流トレースに重ね、ステップ遷移が実験信号の急激な変化と一致することを視覚的に確認します。
   2. 既知のローパスフィルター特性を用いて理想化されたトレースの畳み込み再構成を作成し、生トレース³⁷に重ねます。再構成信号が記録された電流のタイミングと振幅エンベロープに非常に近いことを確認します。
5. 伝導率と寿命の定量化。
   1. 理想化されたトレースにおける最も低い安定プラトーを閉じた基準線状態と定義します。最初のゼロでないプラトー振幅を一次開通状態の伝導(単一チャネルレベル)と特定します。
   2. この振幅のより高い整数倍はマルチチャネル開状態(2+、3+など)として分類します。安定しているが完全な開放準位より低い中間プラトーをサブコンダクタンス状態として特定します。
   3. 理想化されたトレースから各イベントの振幅と持続時間を抽出し、それらをビン分けしてコンダクタンス振幅ヒストグラムおよび生涯ヒストグラムを生成します。
6. 振幅ヒストグラムと生涯分布
   1. 理想化されたコンダクタンス振幅ヒストグラムと、フィルタリング済みデータから直接生成された振幅ヒストグラムを比較します。理想化されたヒストグラムが離散的な伝導度状態³⁷に対応するより鋭く、より分離されたピークを示すことを確認する。
   2. 各実験条件について、生存関数N(t)/N(0)を計算します。ここでN(0)は開かれたイベント(完全およびサブコンダクタンス)の総数、N(t)はtより長いイベントの数です。この分析から閉じた状態区間は除外します。
   3. 非線形最小二乗法ルーチンを用いて、N(t)/N(0)と時間の対決をプロットし、指数関数減衰関数を適合させます。
   4. 振幅ヒストグラムにおけるコンダクタンス分布の右シフトピークをコンダクタンスの増加、N(t)/N(0)での長い減衰定数、時間プロットは開状態安定性の向上、左シフト分布はチャネル寿命の短縮と解釈します。
      注意:気流、振動、近くの動く物体などの環境的乱れを最小限に抑えてください。光学台に寄りかかるのは避け、実験のセットアップから会話を避けましょう。携帯電話、タブレット、ノートパソコン、その他の個人用電子機器はファラデーケージから少なくとも1.5m離して電磁干渉を減らしてください。光学的に透明なオイルリザーバーを使用し、顕微鏡での照明とコントラストを最適化して、液滴や二重層のエッジを鮮明にします。境界コントラストが向上し、DIB直径の手動測定が簡単になる場合は、グレースケールの動画を取得したりエクスポートしたりしてください。温度影響を調査しない実験では、実験室環境、顕微鏡スタンド、油を21〜22°Cに保つことを必ず確認してください。

Results

DIB実験装置
記録システムはファラデーケージ内の防振動テーブルに収められており、電気および映像データは2台の別々のコンピュータで取得されます(図1A)、分割画面機能を備えた1台のコンピュータを使用することも可能です。DIB試料環境は、定められたアルカン油の体積に浸された2つのアガロース被覆電極で構成されています(図1B)。図1C 本稿で記述されている実験装置の重要な電気的および光接続の回路図を示します。

図1:実験装置。(A) アンプ、デジタイザー、ノイズフィルター、機能発生器、電気および映像取得用のデュアルコンピュータインターフェースを含む主要コンポーネントを示す防振動テーブルおよびファラデーケージエンクロージャー。(B) DIBサンプル環境と電極の正面上方図。(C) 本稿で記述されている実験装置に関連する電気的および光接続の回路図。すべての個々の部品は実験棟内で共通の接地を共有しています。すべての実験は室温(21〜22°C)で行われました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Ag/AgCl電極の調製および品質管理
銀線の先端を溶かすことで球状の球状になります(図2A);質の悪い溶融物は細長いまたは不規則に見えます。漂白剤中の塩素化は鈍い褐灰色のAg/AgCl表面を生成します(図2B)。ボールに数十マイクロメートル程度の薄く均一なアガロース被覆は安定した液滴支持と低インピーダンス電気化学結合に不可欠であり、不均一なコーティングは液滴の接着不良を引き起こします(図2C)。

図2:電極の準備。 (A) 良質および品質の低い電極溶融物の顕微鏡画像。(B) 非塩素化電極ヘッドと塩素化電極ヘッドの比較。(C) 良質および低品質のアガロースコーティングの例。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:電極のセットアップ。 (A) 取り付けされた電極角度の上図。(B) LUVロード直後のたわみない液滴と単層形成後のたわみ滴を比較した側面図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

電極の位置と液滴たわみ挙動
上から下から見ると、光学的歪みを最小限に抑えるために電極の適切な角度配置が示されています(図3A)。側面図は、LUV溶液充填直後(たるみ直後)と脂質被覆液滴(5分後)たるみを比較しています(図3B)。DIB形成に用いられるたるみ液滴は、脂質単一層による表面張力の著しい低下により移動に対する物理的反応が遅れ、脂質単一層で完全に覆われた懸浮水性液滴の形成が視覚的に確認されます。サッジが確立された後、三角波刺激を用いて二重層形成と安定性の電気的確認を提供します。³⁵。

図4:液滴界面二重層形成。 (A) 液滴接触後の二層形成と拡大を示すタイムラプスシーケンス。(B) 二層径および面積推定に用いられる内部膜反射。DIBイメージングは、セットアップの下から逆立顕微鏡を使って行われます。スケールバー=50μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

DIBの形成と面積測定
連続画像は、たるんだ2つの液滴が接触した際の自発的な二重層の「ジップ」や面積拡大を捉えます(図4A)。液滴接触部での明るい内側の楕円形反射は、二層径および延長して膜面積の時間経過推定に用いられます(図4B)。

図5:STPプロトコル—刺激と反応。 ペアパルス促進(PPF、0–60秒、赤)およびペアパルス抑制(PPD、60–120秒、青)における代表的な現在の反応を示しており、対応する刺激プロトコル(下)も示されています(上)。PPFおよびPPDパルスの持続時間はそれぞれ100msで、OFF時間はそれぞれ10msと250msで、90.9%と28.6%のデューティサイクルを実現しています。促進はイオン電流の純増加に対応し、うつ病は純減少に対応します。現在の回答はON期間のみ記録されます。可視化のために、パルス間のデータを補間して電流の全体的な傾向を強調します。パルス回路図の時間長やPPF位相およびPPD位相内のパルス数は縮尺で描かれず、可視化のために図示されています。代表的な現在の応答データはPodar PTら、²⁵頁からCC BY-NC-ND 4.0に基づき再現されています。著作権 © 2025 著者PNAS刊。本稿に合わせて修正された刺激回路図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

短期的な可塑性様挙動(STP様)を誘発するための電気刺激プロトコル
ここで示す刺激パターンは、神経科学用語に類推してペアパルス促進(PPF)およびうつ(PPD)を表しており、KonerとNajem^28,29に類似しています。ペアパルス促進(PPF;0–60秒)およびペアパルス減圧(PPD;60–120秒)は、それぞれ100msのパルスで、オフ時間は10ms、250msで、PPFは90.9%、PPDは28.6%のデューティサイクルに対応します。上部パネルはON期間中の代表的な現在の反応を示し、下部パネルは刺激パターンを示しています。

STPおよびその後の長期刺激中の電流、面積、イオンフラックス
C16およびC12/C16油中のgAドープDPhPC二重層の正規化電流(I/I₀)は、PPFおよびPPD中に示されています(図6A)。30時点で測定された正規化膜面積(A/A₀)は、異なる電流にもかかわらず、両オイル条件で同様の面積変化を示しました(図6B)。正規化された流れと面積のデータは、それぞれ油の状態ごとに28の独立したDIBにまたがる平均±のS.D.雲とバーとして表現されています。正規化された磁束、J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)は、伝導の面積に依存しない変化を分離し、単純な面積膨張を超えた膜伝導の変化と整合します(図6C)。しかし、これらの変化は単一チャネルの導電率とアクティブ伝導チャネルの数の両方による寄与を反映している可能性があります。最大30分間の長時間PPD刺激は、C16膜に長期的な抑制様(LTD)挙動を引き起こしますが、C12/C16膜におけるLTP様挙動と一致する上昇フラックスを維持します(図6D)。これらのデータは、膜組成が短時間および長期スケールの塑性変化の両方を変調するイオンフラックスであることを示しています。

図6:C16(オレンジ)およびC12/C16(青)オイルにおけるgAドープDPhPC膜の、SPF(0–60秒、白背景)およびPPD(60–120秒、灰色背景)におけるDPBの電流、面積、計算イオンフラックス。各条件はn=28個の独立して形成されたDIBから成る。(B) 30時点で測定された正規化膜面積(A/A₀)で、電流応答の違いにもかかわらず面積の軌跡が類似する;データは同じn=28の独立したDIBを油条件ごとに平均±したS.D.として示しています。(C) 正規化フラックス、J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)))は、対応する電流と面積の測定値から計算され、面積効果を超えた伝導の変化を強調します。(D) 長時間のPPD刺激下での長期挙動:最初の120秒のSTP(グレー陰影)の後、DIBはON = 100 ms、OFF = 250 ms(常点の赤/緑)または30秒(オレンジ/灰色)のパルスで30分間のPPDを受けました。フラックスはC16膜でベースラインまでまたはそれ以下で崩壊し、LTD様挙動を示しますが、C12/C16膜では上昇し続け、持続的なLTP様挙動を示します。シェーディング領域はI/I₀およびA/A₀からの伝播誤差を表します。拡張PPDデータセットは、120秒プロトコルのn=6個の独立したDIBから取得され、拡張PPD条件ごとに3個のDIBを得ました。すべてのデータポイントは可視化目的でのみ接続されています。パネルA、B、DはCC BY-NC-ND 4.0の下で再現されています。著作権 © 2025 著者PNAS刊。パネルCは、Podar PTら²⁵に報告されたデータから本稿用に新たに生成された。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

PPF刺激後にC16オイル中に形成されたgAドープDIBからの代表的な15s単一チャネル電流トレース
トレースには、50 kHzで1 kHzのローパスフィルター、250 Hzの8極ベッセルフィルタ付きトレース、理想化されたJSMURFフィットでキャプチャされた生信号が含まれます。最低安定レベルが閉じ状態を定義し、それ以上のレベルはシングルチャネル、マルチチャネル、サブコンダクタンスイベントに対応します。これらの痕跡は、コンダクタンス振幅および寿命解析の基礎となります。示された例のコンダクタンス状態滞留時間は、特定のコンダクタンスレベルの持続時間を表しており、その振幅と持続時間は複数の同時進行するフルおよび/またはサブコンダクタンスイベントの複合的な寄与を反映しています。

コンダクタンス振幅と寿命分布
C16およびC12/C16膜のコンダクタンス振幅ヒストグラム(図7A–B)は、 PPF前後の状態をDPhPC:gAモル比1:5×^10-6で比較しています。データ下部のガウス近似は、PPF後の平均コンダクタンスピークのシフトを示し、サブコンダクタンス状態およびマルチチャネル状態に対応する別々のピークを解消します。コンダクタンス分布の統計比較は、ウェルチのt検定およびマン・ホイットニーU検定(α = 0.05)を用いてプールされたイベントレベルデータに対して行われ、各条件は3つの独立したDIB記録で構成され、Nは特定のコンダクタンス状態に対してそれらの記録間で検出されたイベントの総数を示した。寿命確率分布(N(t)/N(0)、前後(図7C–D)は 、C12/C16膜がより長尾のコンダクタンス分布とC16に対する寿命の変化を発達させることを示し、チャネル安定性の変化を示しています。ヒストグラムデータは、各条件ごとに取得されたフィルタリング済み15秒の痕跡(赤線)を代表しています。コンダクタンス状態の生涯分布は、各条件ごとに3つの独立したDIB記録から生成されました。点線曲線は個々の複製を示し、実線曲線はN(t) / N(0) 対 t に対する全域指数関数的フィットを示します。

図7:コンダクタンス振幅ヒストグラムおよびコンダクタンス状態滞留時間分布。 (A)C16および(B)C12/C16膜におけるgA活性のコンダクタンス振幅ヒストグラムは、PPF(グレー)前およびPPF後(オレンジ/ブルー)の状態を5×10 gA:脂質のモル比で比較しています。ヒストグラム下のガウス近似は、単一および多チャネル状態の平均伝導率ピークと標準偏差のシフトを示します。PPF後の平均コンダクタンスのシフトは破線(黒=PPF前、青/オレンジ=PPF後)と矢印で示されます。各条件は3つの独立したDIB記録を表します。コンダクタンス分布の統計比較は、プールされたイベントレベルデータに対してウェルチのt検定およびマン・ホイットニーU検定(α = 0.05)を用いて行われました。ここで、Nは3つの記録で検出されたイベントの合計数を示します。サブコンダクタンスイベントも分析に含まれ、各膜条件の代表的なサブコンダクタンス分布は最初のオープンステートピークの左側に示されました。PPF刺激前後(オレンジ/青)およびC12/C16(D)膜におけるC16(C)およびC12/C16(D)膜におけるコンダクタンス状態イベントの生涯確率分布は、5×^10-6 M gA:脂質の位置にあり、図7A–Bに示されたコンダクタンス解析に対応します.ここで、N(t)は時間tより長い持続時間を持つフルおよびサブコンダクタンス事象の累積数を表します。点線は個々のレプリケートからのライフタイム分布(n=3つの独立したDIBが条件ごとに)を示し、実線のインセットは非線形曲線フィッティングソフトウェアを用いたグローバル指数関数的フィットを示しています。パネルA–DはPodar PTら25ページから複製され、本稿のためにCC BY-NC-ND 4.0のもと編纂されています。著作権 © 2025 著者PNAS. 出版この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:PPF刺激後のC16におけるDIBの単一チャネル探査行動—現在の反応トレース。 (A) 生データ(青)を示す15秒電流のトレースの例、250 Hz 8極ベッセルローパスフィルタ(赤)、およびコンダクタンス状態識別に用いられる理想化されたトレース(緑)。最低安定レベルが基準となる「閉じた」状態を定義します。(B) 振幅ヒストグラムの明確な中間ピーク(図7A、オレンジ参照)で、2^次および3^次の全コンダクタンスレベル間で検出された代表的なサブコンダクタンスレベル。コンダクタンス滞留時間は、特定された各コンダクタンスレベル(閉じ状態を除く)の持続時間から抽出され、N(t)/N(0)の寿命分布を生成します。Podar PTら、CC BY-NC-ND 4.0の²⁵ページから転載。著作権 © 2025 著者PNAS刊。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

PPFの後、C12/C16膜はコンダクタンス振幅分布が顕著に右方向にシフトし、単一チャネルの伝導度が強化され、コンダクタンス状態の寿命分布が左にシフトすることを示す。これはチャネル開通時間の短縮と一致している。これらの変化は、PPF中のC12/C16二重層の電気機械的薄化と一致しており、参考文献25で報告された直接的な機械的および厚さ測定によって支持されており、これによりgAを通るイオン輸送のエネルギー障壁が低下し、開口あたりのイオンスループットが増加し、チャネルの安定性が低下します。対照的に、C16膜はどちらの分布にもほとんど変化がなく、構造的適応性の限界を示しています。これらの結果を総合すると、DIBプラットフォームは膜の電気機械的適応のアンサンブルおよび単一チャネル相関の両方を捉えており、膜組成依存的な動力学から生じるSTP様およびLTP/LTD様のイオン伝導変化も含まれます(図8)。

Discussion

実務的には、この方法は3つの主要な実験的能力を提供します。脂質組成と油相による二層組成の制御可能な変動、膜再構築の同時的な光学および電気的モニタリング、そして単一チャネル電気生理学とメソスケール膜力学をつなぐ膜領域へのアクセスです^。14,15,20,21,25 .これらの特徴により、この手法は、完全な細胞複雑性ではなく膜電気力学が実験的視点^{として関心のある}簡略膜系の構造・機能研究に特に有用^です。

本プロトコルは、アルカン油中のグラミキシジンAドープDIBの組み立ておよび解析を行い、生理学的に関連した電気刺激14,15,25,35,38の下で脂質膜の再構築能力を探ることを目的としています。パッチクランプ技術²¹と比較して、DIBプラットフォームは離散的なイオンチャネルイベントを捕捉するのに十分な解像度を維持しつつ、桁違いに大きな膜パッチを照会します 14,15,19,20,21,28,38.この機能は、メソスケールの電気機械的再構築(例えば電気ウェッティングや電気圧縮)を解明し、それを微視的なチャネル挙動と結びつけ、生理学的に刺激された刺激下でSTP、LTP、LTD様膜のコンダクタンス表現型を形成する際に特に価値があります(^13,25,27,38)。.現在のDIBシステムは、生物学的シナプス^{1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11}の分子複雑さを再現することを意図していません.したがって、STP、LTP、LTD、PPF、PPDなどの用語は、定義された刺激プロトコル下での膜イオン伝導の短期および長期的な増減を示す記述的かつ類推的な意味で使われます。したがって、本研究の主な発見は、DIBにおける膜電気力学、コンダクタンス適応、組成依存的非平衡再構築の観点から最も直接的に解釈されており、神経回路や生化学的シナプス調節との機構的同等性を意味することなく、シナプス可塑性に関する有用な概念的類推や物理的視点を提供する^{可能性があります。}

再現可能な結果を得るためには、いくつかの技術的ステップが重要です。銀球状の先端の均一な融解、徹底的な塩素処理、薄く均一なアガロース被覆を含むAg/AgCl電極の慎重な準備により、安定した液滴付着と低インピーダンスの電気化学結合が保証されます^20,35。液滴のたわみの視覚的確認と正しい電極の向きは、ビデオ撮影中の光学的歪みを最小限に抑え、膜面積測定の精度を向上させます。既知の銀線径を用いた取得後スケール校正により、堅牢なピクセルからmmへの変換が可能となり、膜面積とイオンフラックスの信頼性の高い計算に不可欠です。本研究では、膜のコンダクタンス(フラックス)を単位面積あたりの電流(I/A)として定義し、電気湿潤時にDIB面積が変化するため、正確なフラックス定量には時間マッチングした電流と二重層面積の測定値^{13、25、27、35}が必要となります。

このアプローチは、同じプラットフォーム^{14、15、20、25、35、38}のアンサンブルレベルおよび単一チャネルの読み出しもサポートしています。アンサンブルレベルでは、同期されたビデオおよび電気記録が面積(電気湿潤)と電流の動的変化を定量化し、そこからイオン磁束(電流/面積)が導出されます。電気刺激下では、膜は非平衡定常状態(NESS)に誘導され、組成依存的な膜再構築によって短時間スケールで可塑性様応答が生まれ、長期間にわたって増強様または抑制様の挙動へと進化することがあります⁽min)25,26,28,29,30,31,32。^33、38。単一チャネルレベルでは、電流トレースを段階的なコンダクタンスレベル(閉じ状態、単一チャネル状態、マルチチャネル状態、サブコンダクタンス状態)に理想化します。従来の方形波理想化ツールは通常、限られた数の離散レベルのみを解決します。より複雑またはノイズの多いデータには、JSMURFのようなモデルフリーの理想化手法^{が推奨されます}。JSMURFで解析された短いDC保持電位は、異種ノイズ下でも統計的に厳密な事象検出を提供し、コンダクタンス振幅ヒストグラム(整数およびサブコンダクタンスレベル)およびN(t)/N(0)の寿命分布を得られます。理想化およびフィルタ化された振幅ヒストグラムを重ねることで、コンダクタンス状態割り当ての視覚的および定量的な相互検証が可能となり、一方で既知のローパスフィルターを通過した理想化されたトレースの畳み込み再構成はパラメータ選択と事象忠^実度を確認します。

膜組成は周囲の油相を通じて調整されており(例:C16対C12/C16)、電気刺激下で二層粘弾性および再構造能力を調節すると期待されており、これは以前の研究22,25,39で報告された直接測定と一致しています。よりコンプライアンスの高い膜ほど、より大きなEC駆動の薄化とpAとの疎水性マッチングがPPF 22,23,25で改善され、単一チャネルの伝導率と促進性が増加し、LTP様挙動として安定化すると考えられます。逆に、硬い膜は構造的応答性が制限され、PPFおよびPPD時のコンダクタンス変化が小さく、長時間のパルス下ではLTDへの傾向を示します。これらの組成依存的な結果は、材料特性が膜を機能的に関連性の高い異なる長期体制に有利に導くことを浮き彫りに^{しています。}

DIBプラットフォームにも重要な制限^{があります。}ここで提示される機構的解釈は、油組成の違いが二層材料の性質や電気機械的再構造化への感受性を変化させ、それがグラミキシジンA伝導22,23,25を変調するというものです。この解釈は、これらの膜条件および刺激下で膜の粘弾性、界面張力、動的膜厚の変化を直接測定した先行研究によって支持^{されています。}しかし本研究では、これらの材料特性は各実験で同時に測定されておらず、ここではC16およびC12/C16環境における膜の電気刺激に対する構造的および力学的応答の違いを支持するために用いられており、データの機械的解釈を独立して確立するのではありません。さらに、アンサンブル電流とフラックスは、単一チャネルの伝導度の変化や導電チャネル数の変化の両方を反映する可能性があり、これらは膜面積、ペプチド拡散、非平衡条件下での二量体化によって変化することがあります^。17,18,22,23。周囲の油相は刺激中に二重層コアから動的に浸透または後退することもあり、単一チャネル記録における基準値ドリフト^や時間経過による膜組成の徐々の変化に寄与^します。これらの要因は、静的膜特性を定義するための長時間の定電圧記録の使用を制限し、DIBが閉じた平衡膜ではなく開いた動的システムとして振る舞うことを強調しています⁽13,21,25)。したがって、現在のプロトコルは意図された実験時間スケール^25,38における刺激依存的かつ可塑性に似た伝導変化を捉えていますが、今後は直接的な機械的測定と同時の電気的・光学的記録を組み合わせ、蛍光ベースの単一分子イメージングと組み合わせて、膜の再構築、チャネル伝導率、チャネルの分布のそれぞれの寄与をより完全に解明するために必要となるでしょう^21、25。

一般的な故障モードには、不安定な液滴付着、液滴の不完全なたわみ、二重層形成中の早期合併、面積解析時の二重層エッジの光学的定義の不十分さなどがあります。不安定な液滴付着は、不規則な銀球形状や不均一なアガロースコーティングによって引き起こされることが多く、球体の対称性を確認し、滑らかなアガロースシェルを維持することで軽減できます。電極負荷にはナノリットルサイズの水滴をサブミリ波電極ヘッドに手動で堆積する必要があり、異なる屈折率(空気と油)の媒体間で高い手と目の協調と深度知覚が求められます。その結果、ピペットの先端が意図せずアガロースの殻に接触したり、ディスペンス中に電極ヘッドを外したりすることがあります。手首の補強、油中のピペットのゆっくりな進行、息止めなどの安定性向上技術と繰り返しの練習により、装填の熟練度が向上します。さらに、不完全なたわみや遅延単一層形成は、小胞の異質性、温度変化、アガロース地形によって生じることがあり、^15、20、35の液滴沈着後の待機時間を延長することで改善されることがあります。二重層形成時の合集は、過剰な接触面積や過度に強力な電気刺激(> ±200 mV)と関連し、初期の液滴接触面積を小さくし、単層安定化の余裕を確保し、^25,35,38のパルスを発する前に低振幅の三角波静電容量応答を確認することで軽減できます。

これらの制約にもかかわらず、DIBプラットフォームは非常に調整可能で拡張性が高く、再現性が高く、14,15,20,21,25,35,38,40を完成させ、脂質力学の伝導への寄与を単離することでタンパク質中心の電気生理学を補完します 22,23,25.アンサンブル測定と単一チャネル測定を一つのシステムに統合することで、このプロトコルは電気的仕事と膜の粘弾性がどのように組み合わさってシナプス様の導電性振る舞い(STP様、LTP様、LTD様応答)を生み出すかを制御可能なボトムアップモデル25,29,30,31,32,33,38で解析する実用的な方法を提供します.したがって、この方法論は膜における組成依存学習ルールの体系的探求の基盤を提供し、膜タンパク質が時間的・空間的スケールで機械的・電気的力と宿主二重層をどのように結合させるかを定量化する^{ことを目的としています。}.これらの能力を総合すると、DIBは複雑な神経生物学的行動を扱いやすく検証可能な生物物理学的メカニズムへと分解する強力な枠組みとして位置づけられています(10,11,25,38)。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ジフィタノイ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)	アヴァンティ極性脂質	850356P/850356C	凍乾粉末(P)またはクロロホルム(C) として購入;
アガロース	シグマ・オルドリッチ	A9539
アガロース(0.5gアガロース錠)	ベンチマーク	A2501	粉末フォームかタブレットのどちらかを使うことができます。
Agilent Technologies 33522A 波形発生装置	キーサイト	–	BNCケーブル出力にはどんな波形ジェネレーターでも使えます
アルゴン(Ar)ガス	エアガス	AR UHP300;72-402221259-1	アルゴン圧縮;超高純度
分析的バランス	メトラー・トレド	モデル:MS304S/03	0.0001 gの精度を持つラボグレードの分析用天秤
アクソパッチ200Bアンプ	分子デバイス	–
BK Precision 4017B 10 MHz DDs スイープ/ファンクションジェネレーター	Digi-Key	BK4017B-ND
ホウケイ酸ガラス毛細管	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 ソフトウェアスイート	分子デバイス	–
DigiData 1550Bシステム	分子デバイス	–	これにはミニエクストルーダー、2本のシリンジ、100個のPCメンブレン、100個のフィルターサポート、1つのホルダー/ヒートブロックが含まれています
ドデカン、99%	シグマ・オルドリッチ	112-40-3
押出機セット(ホルダー/加熱ブロック付き)およびnbsp;	アヴァンティ極性脂質	610000
フィジーソフトウェア	イメージJ	–
冷凍庫(-80度、C)	フィッシャー・サイエンティフィック	アイソテンプ;モデル:8964;S/N: 828278-21
ガラス製品	VWRインターナショナル	–
グラミシジンA型	ミリポール・シグマ	368020
ヘクサデケイン、99%	シグマ・オルドリッチ	544-76-3
ハムバグノイズリミネーター(60Hz)	A-Mシステム	726300
逆立顕微鏡システム(ニコン Ti2-A)	ニコン	–	倒立顕微鏡や直立顕微鏡は使用可能です
イソプロピルアルコール	VWRインターナショナル	BDH1133-4LP
マイクロ電極ホルダー	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	MEH1
マイクロマニピュレーター	サター楽器	MP-285	手動操作装置の使用も可能です
顕微鏡カメラ	オリンポス	DP74
Microsoft Excel	マイクロソフト	–
MOPS	シグマ・オルドリッチ	M1254
NIS-Elements顕微鏡カメラソフトウェア	ニコン	–	ライブビューやビデオ機能を備えたカメラキャプチャソフトウェアが使用されることがあります。ライブビューおよび同時画面録画はビデオキャプチャの代わりに使われることもあります。
パラフィルムM万能実験用フィルム	パラフィルム	PM999
ペトリ皿	-	-	皿は底面が透明で、理想的には側面の壁も透明でなければなりません
塩化カリウム(KCl)	シグマ・オルドリッチ	P3911
パウダーフリーソフトニトリル検査用手袋	VWRインターナショナル	CA89-38-272
冷媒(4 & deg;C)	フィッシャー・サイエンティフィック	品番:97-938-1;モデル番号:3556FS
銀線	グッドフェロー	147-346-94
かき混ぜるホットプレート	サーモ・サイエンティフィック	SP131325