ツメガエルの初期胚から単一細胞を単離し、サイズで分類する

サマリー

私たちは、 ツメガエル の初期胚から単一細胞を分離し、細胞サイズで分類する方法を記述します。

要約

早期胚発生では細胞サイズが指数関数的に減少しますが、胚は発生初期段階で一定の大きさを保ちます。機能的重要性や細胞サイズが胚の発生に影響を与えるメカニズムは、依然としてほとんど研究されていません。 ツメガエル の初期胚は、これらの大きなギャップを埋める独自のシステムを提供しています。他のモデル生物と比べて、 ツメガエル の初期胚は非常に大きく、動物極の小さな細胞から植物極の大きな細胞まで、胚全体に中芽胚遷移期の段階で細胞サイズの勾配を含んでいます。ここでは、異なるメッシュ孔径を持つ細胞ストレーナーを用いて、ツ メガエル 初期胚から単一細胞を解離し、サイズで分類するプロトコルを説明します。画像診断およびサイズ測定により、選別された細胞は期待されるサイズ範囲内にあり、生細胞の解析やシーケンス、または画像解析に固定されるために使用されます。このシステムは、初期発生におけるサイズ依存的な調節メカニズムを明らかにする新たな光を当てるでしょう。

概要

細胞サイズの変化は初期胚発生の一般的な特徴であり、受精卵が複数回の切断を経て細胞数が増えていきます。細胞サイズが^{細胞機能を制御}する主要なパラメータとしての役割については多く知^{られているものの、}細胞サイズが初期発生にどのように影響するかはあまり知られていません。最近の研究では、さまざまなモデル胚システムで、細胞サイズが接合ゲノム活性化(ZGA⁾⁴および細胞運命仕様⁵を調節し、発生決定における細胞サイズの重要な役割を支持していることが示唆^{されています。}

ツノメガエルの初期胚は、細胞サイズによって調節される発生意思決定を研究する重要なモデルです。ツメガエルの初期胚は直径約1.2mmと大きく、物理的にサイズを操作しやすく、細胞サイズ変化の直接的な影響を評価するのに役立ちます。例えば、ヘアループ^4,8を用いて1細胞胚を収縮させることで、異なるサイズのミニ胚を生成でき、線量依存的なZGA⁴を示します。さらに、ツメガエルの初期胚は動物-植物軸に沿って細胞サイズの勾配を持ち、最小の細胞は動物の極、最大の細胞は植物の極にあり、体積の⁴倍以上の差を示しています。重要なのは、全マウント胚の単一細胞で新生転写産物を直接可視化・定量化することで、ZGA⁴を調節する細胞サイズの閾値を特定したことです。さらに、ツメガエルの初期胚から単一細胞を分離し、サイズで分類することで、細胞サイズ閾値ZGA⁴の重要性が確認されました。

ここでは、 ツメガエル 属の初期胚から単一細胞を分離し、サイズで選別する詳細な手順を説明します。 ツメガエル の初期胚はCa²⁺、Mg²⁺フリー培地(CMFM^)で培養することで個々の細胞に分離でき、これらの単一細胞は異なるメッシュ孔径の細胞ストレーナーを用いてさらに選別可能です。選別された細胞は精製され、生細胞分析、シーケンス、イメージングアッセイなど様々な用途で使用できます。

プロトコル

ここで述べる動物の活動は、サウスカロライナ大学の動物管理・利用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 溶液調製

注意:プロトコルを開始する前に、以下の解決策を準備してください。

1. 20 m× MMRを準備します:100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl₂、40 mM CaCl₂を混合します。NaOHでpHを7.8に調整してください。オートクレーブして常温で保存します。
2. Ca²⁺、Mg²⁺フリー培地(CMFM)を準備します:混合:50.3 mM NaCl、0.7 mM KCl、9.2 mM Na₂HPO₄、0.9 mM KH₂PO₄、2.4 mM NaHCO₃、1.0 mM EDTAを混合。必要に応じてpHを7.4に調整してください。オートクレーブして常温で保存します。
3. 60mmペトリ皿に1.5%アガロースジェルを準備します:50mLのCMFMに0.75gのアガロースを加えます。電子レンジでアガロースを溶かすために加熱します。60mmのペトリ皿にアガロースジェルを5〜10mL加えて薄い層をコーティングします。
4. 15%密度勾配培地(wt/vol)/CMFMを準備します:100mLのCMFMに15gの密度勾配培地をゆっくり加えます。溶けやすくするために、プレート上で加熱・かき混ぜて密度勾配媒体が完全に溶けるまで続けます。使用まで溶液を4°Cの温度で保ちます。
5. 4% PFA/1×MEMを調製します:16%パラホルマルデヒドストックのバイアル10mLと10×MEM4mL(1000 mM MOPS pH 7.4、20 mM EGTA、10 mM MgSO₄)を混合します。超純水を40mLに加えます。
   注: ツノメガエル の胚を入手するには、標準的なプロトコルに従って体 外 受精(IVF)を行う必要があります(例:Siveら、2007年参照)¹⁰。胚は0.1×MMRで使用準備が整っているはずです。

2. 初期胚を単一細胞に解離させる

1. CMFMを1.5%アガロースゲルでコーティングした新しい60mmペトリ皿に~15mLのCMFMを加えます。プラスチックのトランスファーピペットを使って、実験の必要に応じて10〜100個の胚を皿に移植します。皿を立体顕微鏡で観察してください。
2. 両手にピンセットを使い、片方のピンセットで胚の表面にビテリン膜を挟み、もう片方で剥がして慎重に取り除きます。この過程で胚を傷つけないようにしてください。
3. デビテリング胚はCMFMで室温で~1時間キュベートします。細胞の解離を促進するために、5分ごとに皿を優しく振ってください。放胚球の山が見つからなくなるまで定期的にチェックしてください(図1)。

3. 離離した細胞のサイズによるソート

1. ブラストトーム解離の間、細胞染色体(40μm、70μm、100μm)をCMFMを充填した個別のペトリ皿に浸します(図2)。料理を左から右へ順に並べます。また、各グループ間でCMFM入りの皿を2枚用意し、各選別時に細胞染色剤の短時間洗浄を行います。
2. 分離された単一のブラストメアを含む皿を優しく回し、皿の中央でそれらを豊かにします。ブラストメアを慎重にCMFMの40μm染色体に移します。
3. ストレーナーを数回優しく振って、40μm<ブラストメントがストレーナーを通って沈殿するのを待ってください。その後、40μmのストレーナーを素早くCMFM入りの皿に移し、短時間洗浄します。40μmのストレーナー内の>40μmのストレーナー内の発泡球を慎重に70μmストレーナーに移します。
4. この手順を繰り返し、胚盤が100μmストレーナーで仕分けされるまで続けます。
5. 各皿を選別した発泡球体を優しく回し、皿の中央で味を豊かにします。蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブ内の15%密度勾配培地の0.5mLの上に、ブラストメア(~4 mL)を慎重に移します(図3)。混ぜるのは避けましょう。
6. チューブを10分間置いてください。無傷の胚球体は重力によって底に沈み、卵黄球体から破裂した胚球体から分離し、選別と移送の過程で分離します(図3)。
7. 下流実験の目的に応じて、生細胞解析を進めるか、RNA解析のためにブラストメアを液体窒素で凍結するか、免疫染色のために定着するか(図3)。

結果

ステージ9のゼノップス・ラエビス胚(n = 50)はCMFM培地でインキュベートされ、このプロトコルに従って単一胚球体へ解離されました(図1の例参照)。解離した単一胚球体は、上記のように40μm、70μm、100μmの細胞ストレーナーを用いて順次選別されました。未選別対照混合物と単一ブラストメアは4%パラホルマルデヒドに固定され、明視野顕微鏡で画像化されました(図4A)。図4B,Cに示すように、幅広いサイズを含む対照未選除胚球体と比較して、選別された胚盤体はそれぞれの期待されるサイズ範囲に該当する狭いサイズ範囲を示しました:< 40 μm、33 ± 5.3 μm;40-70μm、55 ± 11 μm;>70μm、91±17μm(図4)は、サイズに基づく選別が成功していることを示唆して...

ディスカッション

細胞^の大きさは細胞機能にとって根本的に重要であり、初期発生への影響についてはモデル胚システムにおけるより詳細な検証が必要です。ここでは、ツメガエルの初期胚から単一細胞を分離し、細胞ストレーナーを用いて細胞のサイズで分類する方法を詳細に説明しました。これらは細胞サイズ研究に応用可能である可能性があります。この手法により、早期胚発生におけるサイズ制御された接合遺伝子活性化の直接的な証拠を提供^{できるようになりました。}

プロトコルの成功にはいくつかの重要なステップがあります。 ツメガエル の初期胚には細胞サイズの勾配軸があり、動物の極から植物の極までの小さな細胞から大きな細胞まで^{4、異なる}大きさの細胞の割合は大きく異なります。つまり、胚内の大きな細胞は小さな細胞よりもはるかに少ないのです。さらに、解離や選別の過程で大きな細胞は分裂を続け、小さな細...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16% パラホルマルデヒド(PFA)	EMS	15710-S	固定液を作るために
60mm使い捨てペトリ皿	VWR	25384-092	胚の孵化に関して
ACCU-SCOPE 3075 ズームステレオ顕微鏡	VWR	470351-130	胚の可視化のために
アガロース	シグマ・オルドリッチ	A-9414	ペトリ皿のコーティング用
セルストレーナー、100およびマイクロ;m	VWR	76327-102	サイズによるセルのソート
セルストレーナー、40 & micro;m	VWR	76327-098	サイズによるセルのソート
セルストレーナー、70およびマイクロ;m	VWR	76327-100	サイズによるセルのソート
使い捨てトランスファーピペット	VWR	414004-035	胚移植のために
デュモント・ピンセット、スタイル5	電子顕微鏡科学	72701-D	ビテリン膜の除去
ガラスペトリ皿、60回以上;15mm	VWR	75845-542	胚の孵化に関して