ここでは、選択された遺伝子マーカーの携帯型ナノポアシーケンスを用いてトキソプラズマ・ゴンディイ株を迅速に同定・遺伝子型解析し、将来的に監視環境への応用が期待される実験室管理分離株でのスケーラブルで標的株同定を可能にするプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
トキソプラズマ・ゴンディイ は世界的に分布するアピプレックス類寄生虫で、遺伝的多様性が非常に高いため、正確な分子解析による系統識別が必要です。このプロトコルの目的は、培養された T. gondii 分離株のターゲットマルチロカス遺伝子型解析のための再現可能なワークフローを確立することです。この手技は、代表的なタイプI(RH)およびタイプII(ME49)株の in vitro 増殖、ゲノムDNA抽出、 SAG2 および SAG3 遺伝子の遺伝子座特異的増幅、そして単一塩基多型(SNP)および挿入/欠失(INDEL)事象を検出するためのシーケンス解析を含みます。シーケンスデータは高信頼度のコンセンサス配列を生成し、株特異的多型の同定のための比較アライメントを行うために処理されます。このワークフローを原型株に適用すると、高いマッピング効率、ターゲット遺伝子座全体での一貫した読み取り深さ、期待されるアンプリコンサイズの正確な回復が示され、遺伝子座レベルの遺伝的変異の信頼できる検出が確認されました。包括的な遺伝子型割り当てには追加の標準化マーカーの含め方が必要ですが、このプロトコルは実験室で管理された T. gondii 分離株の標的遺伝的特徴解析のための拡張性と再現性の枠組みを提供し、一貫した多遺伝子座配列解析をサポートします。
概要
トキソプラズマ・ゴンディイは世界中に分布するアピプレックス類寄生虫であり、主要な食物および水媒性人獣共患病の脅威です。ほぼすべての恒温動物に感染し、ネコ科動物が決定的な宿主となります1。人間や動物の感染は、組織嚢胞や胞子状卵嚢胞の摂取によって一般的に起こり、寄生虫がタキゾイトと徐速の段階を交互に行う能力により、神経組織や筋肉組織に長期的に持続し、肉媒介および環境伝播の両方に寄与します2,3。
ヨーロッパと北アメリカでは3つのクローン系統(タイプI、II、III)が優勢ですが、特に野生生物の豊富な貯蔵庫がある地域では、非定型株や組換え株を含む広範な遺伝的多様性が世界的に記録されています4。したがって、正確な株識別は伝播動態の解明、流行の調査、地域の疫学の理解に不可欠です。PCR-RFLP、サンガーベースの多遺伝子座配列タイピング(MLST)、マイクロサテライト解析などの従来の遺伝子型解析は、T . gondii の個体群構造の理解に大きく貢献しましたが、解像度、スループット、遺伝子型内変異の検出能力には限界があります。これらのアプローチは複数の別々の反応を必要とし、....
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プロトコル
この研究では、確立された実験室寄生虫株と商業的に入手されたヒト線維芽細胞株を用いました。人間や動物の被験者は直接関与していませんでした。
注:特に指定がない限り、本プロトコルで使用されるバッファーおよび試薬は、 材料表に記載された市販キット内に供給されます。
1. バイオマーカー選択
- ToxoDB(https://toxodb.org/toxo/app)ゲノムデータベースから SAG2 および SAG3 のゲノム配列をFASTA形式でダウンロードできます。
- EMBOSS Water(https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water)を使ってペアワイズシーケンスアライメントを行います。
- アンプリコン領域≤1,600塩基対(bp)を選択し、シーケンス時間を最小限に抑え効率的なPCR増幅を確保します。
- 各領域にひずみ分化のための有益なSNPやINDEL多型が含まれていることを確認してください。
2. トキソプラズマ・ゴンディイ・
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結果
トキソプラズマ・ゴンディイのゲノムDNAは、SAG2とSAG3という2つの遺伝マーカーを標的としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって成功裏に増幅されました(図2)。精製後、PCR産物はアガロースゲル電気泳動で期待されるサイズの異なるバンドを形成し、639 bp(SAG2)および1158 bp(SAG3)に対応しました。これらのバンドの明瞭さと一貫性により、標的遺伝子断片の増幅と完全な増幅が成功し、その後の配列解析が可能であることが確認されました。
高スループットナノポアシーケンシングにより、 トキソプラズマ・ゴンディイ のRH株およびME49株の両方の遺伝子座全体で高品質なデータセットが生成されました(表1)。 SAG2 遺伝子座では、ME49株のシーケンスにより1,499本のリード、合計849.......
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ディスカッション
本研究は、オックスフォード・ナノポア長リードシーケンシングとターゲットマルチロクスアプローチを組み合わせた有用性を示し、 トキソプラズマ・ゴンディイの迅速かつ信頼性の高いゲノタイピングを実現しています。よく特徴づけられた表面抗原遺伝子座 SAG2 と SAG3に焦点を当てることで、RH(タイプI)とME49(タイプII)株の比較解析を通じてオックスフォード・ナノポアを用いた多遺伝子座シーケンスの概念実証を確立し、プラットフォームが株特異的遺伝的変異を解消する能力を示しました。
両遺伝子座のPCR増幅により、期待されるサイズの明確で明確に定義されたバンドが生成され、下流ゲノム解析に適した高品質なテンプレートDNAの成功した生成が確認されました。その後のナノ孔シーケンシングにより、高いリード深度、強力なマッピング効率、および期待されるアンプリコン長に非常に近いコンセンサス配列が生成されました6.これらの結果は、アンプリ.......
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開示事項
著者には利益相反を主張するものはありません。
謝辞
この研究は、エジプト高等教育科学研究省(ロンドンのエジプト文化教育局、およびUKRI MRC(MR/X502947/1)によって資金提供されました。図1は以下の方法で作成されました BioRender.com
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロースポウダー | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | ゲル電気泳動用 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | 細胞培養培地 |
| epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1) | Oxford Nanopore Technologies, UK | N/A | ナノポアアンプリコンシーケンスデータの処理と分析のためのNextflowワークフロー;バージョン1.2.1はMinIONデータの再現可能な分析に使用されました。 |
| epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3) | Oxford Nanopore Technologies, UK | N/A | ナノポーアシーケンスリードの参照配列へのアラインメントおよびIGVを使用した統合ビジュアライゼーションのためのNextflowワークフロー;バージョン1.2.3はMinIONデータの再現可能な分析に使用されました。 |
| エチルアルコール、ピュア | Merck Life Science | 51976-500ML-F | ビーズクリーンアップ用 |
| 胎児ウシ血清 (FBS) | Sigma-Aldrich | MFCD00132239 | 細胞培養補足 |
| フローセルウォッシュキット | Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | フローセルの洗浄 |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb) | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | サイズ確認 |
| HFF-1 ヒト包皮線維芽細胞株 | American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1041 | 新生児の包皮から分離されたヒト真皮線維芽細胞;寄生虫の培養に使用 |
| MinIONフローセル (R10.4.1) | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN114 | シーケンシング用フローセル |
| MinION Mk1Bシーケンシングデバイス | Oxford Nanopore Technologies, UK | MIN-101B | ナノポアシーケンサー; MinKNOWソフトウェア (v25.09.16)を使用してデバイス制御とリアルタイムベースコーディングを行いました。 |
| MinKNOWソフトウェア | Oxford Nanopore Technologies, UK | N/A | MinION Mk1Bデバイス制御、リアルタイムシーケンシング、およびベースコーディングに使用するソフトウェア;バージョン25.09.16。 |
| ネイティブバーコーディングキット24 V14 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-NBD114.24 | 多重化サンプル用バーコーディング |
| NEB Blunt/TAリガーゼマスターミックス | New England Biolabs | M0367 | DNAリガーゼ |
| NEBNext Quick リガーゼモジュール | New England Biolabs | E6056 | アダプタリガーゼ |
| NEBNext Quick リガーゼ反応バッファー (5×) | New England Biolabs | B6058 | DNAリガーゼで使用 |
| NEBNext Ultra II エンド修復/dA-テイルモジュール | New England Biolabs | E7546 | ライブラリ調製 |
| 核酸分解酵素フリー水 | Thermo Fisher Scientific | R0581 | 分子生物学グレード |
| NucleoSpinゲルおよびPCRクリーンアップキット | Macherey-Nagel | 740609.5 | PCR製品の精製 |
| ペニシリン–ストレプトマイシン (1%) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15140-122 | 抗生物質混合物 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | 洗浄バッファー |
| Q5 High-Fidelity 2× マスターミックス | New England Biolabs | M0492S | 高精度ポリメラーゼ |
| QIAamp DNA Blood Miniキット | Qiagen | 69504 | DNA抽出 |
| Quick T4 DNAリガーゼ | New England Biolabs | M2200 | アダプタリガーゼ酵素 |
| SYBR Safe DNAゲル染色 | Thermo Fisher Scientific | S33102 | DNA染色染料 |
| TriTrack DNAローディングダイ (6×) | Thermo Fisher Scientific | R1161 | ゲルへのサンプルのローディング |
| トライプシン–EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25200056 | HFFの移植用 |
| 1× TAEまたは1× TBEバッファー | — | — | 実行バッファー |
| 2× PCRプレミックス | — | — | PCRのレディーミック |
参考文献
- Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
- Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E.
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再版と許可
