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方法論記事

トキソプラズマ・ゴンディイの株型別のための多遺伝子座シーケンシング

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DOI:

10.3791/70645

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2026年5月26日

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

この記事について

サマリー

ここでは、選択された遺伝子マーカーの携帯型ナノポアシーケンスを用いてトキソプラズマ・ゴンディイ株を迅速に同定・遺伝子型解析し、将来的に監視環境への応用が期待される実験室管理分離株でのスケーラブルで標的株同定を可能にするプロトコルを提示します。

要約

トキソプラズマ・ゴンディイ は世界的に分布するアピプレックス類寄生虫で、遺伝的多様性が非常に高いため、正確な分子解析による系統識別が必要です。このプロトコルの目的は、培養された T. gondii 分離株のターゲットマルチロカス遺伝子型解析のための再現可能なワークフローを確立することです。この手技は、代表的なタイプI(RH)およびタイプII(ME49)株の in vitro 増殖、ゲノムDNA抽出、 SAG2 および SAG3 遺伝子の遺伝子座特異的増幅、そして単一塩基多型(SNP)および挿入/欠失(INDEL)事象を検出するためのシーケンス解析を含みます。シーケンスデータは高信頼度のコンセンサス配列を生成し、株特異的多型の同定のための比較アライメントを行うために処理されます。このワークフローを原型株に適用すると、高いマッピング効率、ターゲット遺伝子座全体での一貫した読み取り深さ、期待されるアンプリコンサイズの正確な回復が示され、遺伝子座レベルの遺伝的変異の信頼できる検出が確認されました。包括的な遺伝子型割り当てには追加の標準化マーカーの含め方が必要ですが、このプロトコルは実験室で管理された T. gondii 分離株の標的遺伝的特徴解析のための拡張性と再現性の枠組みを提供し、一貫した多遺伝子座配列解析をサポートします。

概要

トキソプラズマ・ゴンディイは世界中に分布するアピプレックス類寄生虫であり、主要な食物および水媒性人獣共患病の脅威です。ほぼすべての恒温動物に感染し、ネコ科動物が決定的な宿主となります1。人間や動物の感染は、組織嚢胞や胞子状卵嚢胞の摂取によって一般的に起こり、寄生虫がタキゾイトと徐速の段階を交互に行う能力により、神経組織や筋肉組織に長期的に持続し、肉媒介および環境伝播の両方に寄与します2,3。

ヨーロッパと北アメリカでは3つのクローン系統(タイプI、II、III)が優勢ですが、特に野生生物の豊富な貯蔵庫がある地域では、非定型株や組換え株を含む広範な遺伝的多様性が世界的に記録されています4。したがって、正確な株識別は伝播動態の解明、流行の調査、地域の疫学の理解に不可欠です。PCR-RFLP、サンガーベースの多遺伝子座配列タイピング(MLST)、マイクロサテライト解析などの従来の遺伝子型解析は、T . gondii の個体群構造の理解に大きく貢献しましたが、解像度、スループット、遺伝子型内変異の検出能力には限界があります。これらのアプローチは複数の別々の反応を必要とし、多型遺伝子座1内の挿入、欠失、複雑なハプロタイプを検出できないことがあります。ショートリード次世代シーケンシング(NGS)は希少な変異体の検出を向上させましたが、複雑な構造変化の特定には依然として制約があります。

特にOxford Nanopore Technologiesなどのロングリードシーケンスプラットフォームは、構造変異や高度に多型的な遺伝子座5の解読に適した連続的高精度リードを生成する能力を現在提供しています。その携帯性、リアルタイム解析能力、アンプリコンベースのワークフローとの互換性により、現地アプリケーションやアウトブレイク調査において有望なツールとなっています6.これらの利点にもかかわらず、標準化された多遺伝子座ロングリードワークフローは、T . gondii の日常的な遺伝子型解析に向けたものとして限られています。

このギャップを埋めるために、2つの多型遺伝子座を対象としたスケーラブルなロングリードアンプリコンシーケンスワークフローを確立しました(図1)。コンセンサスによるポリッシングおよびバリアントコールパイプラインと組み合わせることで、SNPやINDELの正確な検出が可能となり、ストレインレベルの識別を支援します。このプロトコルはPCR増幅および長リードシーケンスが可能である検査室に適しており、培養分離株を用いて検証されています。一次臨床サンプルや環境サンプルへの適応は可能ですが、そのような用途にはさらなる最適化と検証が必要です。全体として、このワークフローは標的を絞った分子特性評価のための構造化された枠組みを提供し、疫学的調査を支援する可能性があります。

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プロトコル

この研究では、確立された実験室寄生虫株と商業的に入手されたヒト線維芽細胞株を用いました。人間や動物の被験者は直接関与していませんでした。

注:特に指定がない限り、本プロトコルで使用されるバッファーおよび試薬は、 材料表に記載された市販キット内に供給されます。

1. バイオマーカー選択

  1. ToxoDB(https://toxodb.org/toxo/app)ゲノムデータベースから SAG2 および SAG3 のゲノム配列をFASTA形式でダウンロードできます。
  2. EMBOSS Water(https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water)を使ってペアワイズシーケンスアライメントを行います。
  3. アンプリコン領域≤1,600塩基対(bp)を選択し、シーケンス時間を最小限に抑え効率的なPCR増幅を確保します。
  4. 各領域にひずみ分化のための有益なSNPやINDEL多型が含まれていることを確認してください。

2. トキソプラズマ・ゴンディイ・ タキゾイトの培養と収穫

  1. 宿主細胞培養の維持
    1. 認定された商業施設からヒト包皮線維芽細胞(HFF)を取得し、Dulbecco's Modified Eagle Mediumに10%胎児用牛血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補足した完全な成長培地で培養します。
    2. 培養は37°Cで、5%のCO₂を含み加湿インキュベーターで培養します。
  2. 寄生虫系統の維持と拡大。
    1. タキゾイトを用いて80〜90%の合流率で線維芽細胞単分子層に感染し、1細胞あたり1〜3種の寄生虫が感染します。約1×106 線維芽細胞を含むT25フラスコには、1〜3 ×106 タキゾイトを加えます。
    2. 毎日、逆立光学顕微鏡で20×または40×倍率で培養を観察します。広範な単一層破壊を観察することで宿主細胞の溶解を特定します。
      注意:培養に関連する遺物を避けるため、20番以降は線維芽細胞培養を使用しないでください。
    3. タキゾイトの採取。
      1. 宿主細胞溶解が≥90%見える場合に培養を採取してください。
      2. 遠心分離機で1,300 × g、4°Cで10分間。
      3. ペレットを10 mLの無菌リン酸塩緩衝生理食塩水に優しくピペッティングして再懸浮させ、再び1,300 × gで4°Cで10分間遠心分離します。 もう一度繰り返します。

3. ゲノムDNAの抽出とアンプリコン生成

  1. シリカカラムベースのゲノムDNA精製キットを用いてゲノムDNAを抽出する7.50μLの洗脱バッファーでDNAを溶出します。
  2. マイクロボリューム分光光度計を使ってDNA濃度を測定します。
  3. DNAは短期保存は4°C、長期保存は−20°Cで保存します。
  4. 高精度DNAポリメラーゼマスターミックス、遺伝子座特異プライマー(補足表1)、ヌクレアーゼフリー水を用いてPCR反応を準備します。
  5. 以下のサイクル条件下で校正済みサーマルサイクラーを用いてPCR増幅を行います:(a) 98°Cで初期変性を30秒間、(b) 98°Cで35サイクル10秒;遺伝子座特異的アニーリング: SAG2は60°C、 SAG3は68°C、30秒;20秒間72°C、(c)最終延長:2分間72°C。
  6. 1.5%アガロースゲルで電気泳動でPCR産物を検証します。
  7. 製造元の指示に従い、カラムベースPCRおよびゲル抽出精製システムを用いてPCR製品を精製します。15〜20μLの洗脱バッファーでDNAを溶出します。
    注意:DNAテンプレートの品質、濃度の低下、または最適でない反応条件により、PCRの効率と収率が低下する可能性があります。アンプリコン収率が低い場合は、アガロースゲル電気泳動でDNAテンプレートの完全性を検証し、分光光度計で濃度と純度を検証します。PCRアニーリング温度やプライマー濃度も使用するプライマーペアに合わせて最適化し、必要に応じてPCRサイクル数を増やす必要があります。

4. ロングリードシーケンスのためのライブラリ準備

  1. エンドリペアとdAテール
    1. すべての試薬を解凍し、渦で十分に混ぜます。初回使用時のみ、DNA対照サンプルを10.5μLの洗脱バッファーで希釈し、氷で保管してください。
      注意:使用前に必ずボルテックス磁気ビーズをしっかり取り除いてください。
      注意:エンドプレップ酵素ミックスをボルテックスしないでください。ピペットで優しく混ぜます。
    2. 各DNAサンプルを200 fmol(1 kb断片の場合は約130 ng)を0.2 mLのPCRチューブにピペットし、ヌクレアーゼフリー水で11.5 μLに体積を調整します。
    3. 1本に1本に希釈したDNA制御サンプル1μLを加え、ピペッティングで10〜20回混ぜます。
    4. 1.75μL反応バッファーと0.75μL酵素ミックス(5%余剰を含む)を含む最終準備マスターミックスをサンプルごとに準備します。
    5. 各サンプルにマスターミックス2.5μLを加え、優しく混ぜて短時間スピンダウンします。
    6. サーマルサイクラーで20°Cで5分間培養し、その後65°Cで5分間培養します。
  2. エンドプレゼンドDNAの精製
    1. 15μL反応を1.5mLの低DNA結合マイクロ遠心分離管に移します。
    2. 15μLの再懸濁磁気ビーズを加え、優しく混ぜて短時間回転させます。
    3. サンプルを室温でローテーターミキサーで5分間培養します。
    4. 洗うために80%エタノールを準備してください。
    5. チューブを磁気トラックに置き、ビーズが粒状になるまで待ってから、上澄液を慎重に除去します。
    6. ビーズを200μLの80%エタノールで2回洗います。
      注意:ビーズが完全にペレット状になるまで待ってから、慎重にエタノールを取り除いてください。
    7. 30秒ほどの自然乾燥ビーズ;ひび割れを防ぐために過度乾燥を避けること。
    8. ビーズを10μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、室温で2分間培養します。
    9. チューブを磁気ラックに置き、10μLの溶出液を低DNA結合のマイクロ遠心分離機チューブに移します。
    10. 分光光度計で1μLのDNA濃度を測定します。
  3. ネイティブバーコーディング
    1. Thaw Blunt/TA Ligase Master Mix、EDTA、ショートフラグメントバッファ(SFB)、およびネイティブバーコード(NB01–NB24)。
    2. サンプル1から24まで個別のバーコードを割り当てます。
    3. 7.5μLのエンドプレップDNA、2.5μLのネイティブバーコード、10μLのBlunt/TAリガーゼマスターミックスでバーコーディング反応を組み立てます
    4. ピペットで10〜20回よく混ぜます。
    5. 室温で20分間インキュベートし、4μLのEDTAで反応を終え、ピペッティングで十分に混ぜてから短時間スピンダウンします。
    6. サンプルを1.5 mLの低DNA結合マイクロ遠心分離機チューブにバーコード化しました。総プールされたサンプル体積の0.4×に磁気ビーズを加えます(例:230μLビーズを575μLのプールDNAに加える)。ピペッティングで十分に混ぜ、室温のローテーターミキサーで10分間培養します。
    7. ビーズは700μLのショートフラグメントバッファー(SFB)で洗浄します。ビーズをはじいて再懸浮させ、回転を下げてからサンプルを磁気ラックに戻し、ビーズをペレットさせます。ピペットでバッファーを取り出し、その後捨てます。
    8. 前の手順を繰り返します。
    9. 回転を下ろして、チューブを磁気ラックに戻します。残留バッファーはピペットで取り除きます。
    10. チューブを磁気ラックから取り出し、ペレットを35μLのヌクレアーゼフリー水に優しく弾いて再懸浮させます。
    11. 37°Cで10分間間に混合しながら培養し、その後、溶出液を低DNA結合のマイクロ遠心分離機チューブに移します。
  4. アダプターの接続とライブラリのクリーンアップ
    1. 30μLのプールされたバーコード付きDNA、5μLのネイティブアダプター、10μLのリゲーションバッファー(5×)、5μLのT4リガーゼでリゲーション反応を組み立てます。
    2. 反応を優しくピペットで混ぜ、短時間スピンダウンして混味させます。反応を室温で20分間培養します。
    3. 反応に20μLの再懸濁磁性ビーズを加え、ピペッティングで混合します。室温のローテーターミキサーで10分間孵卵します。
    4. サンプルとペレットを磁気ラックで回転させます。チューブを磁石につけたまま、ピペットで上清液から外してください。
    5. ビーズは125μLのショートフラグメントバッファ(SFB)を加えて洗浄します。ビーズをはじいて再浮上させ、回転を下げてからチューブを磁気ラックに戻し、ビーズがペレット状にまとまるのを待ちます。ピペットで上澄液を除去し、捨てます。
    6. 前の手順を繰り返します。
    7. 下に回してチューブを磁石に戻します。残留した上澄液をピペットで取り除きます。チューブを磁気ラックから取り外し、ペレットを15μLの溶出バッファー(EB)に再懸浮させます。
    8. 回転させて37°Cで10分間孵化します。 2分ごとに10秒間優しく弾いてDNAの洗出を促す。
    9. ビーズを磁石にペレットで塗り、溶出液が透明で無色になるまで、少なくとも1分間浸します。
    10. DNAライブラリーを含む15μLのエリュートを除去し、1.5mLの低DNA結合マイクロ遠心分離機チューブに除去・保持します。
    11. 最終的なライブラリを分光光度計で定量化します。

5. フローセル製備とナノ孔シーケンシング

  1. フローセルの調製
    1. フローセルを点検し、≥80個の活発な孔を確認してください。
    2. プライミング混合物は、マイクロ遠心分離機管内で117μLのフラッシュ溶液と3μLのテザー溶液を混合して合計120μLにします。気泡の発生を避けるためにピペッティングで優しく混ぜます。120μLのプライミング混合物全体をフローセルのプライミングポートにゆっくりと注入し、充填中に気泡が入らないようにします。
  2. ライブラリの読み込みとシーケンス
    1. シーケンスミックスは、シーケンスバッファー(SB)15μL、ライブラリービーズ(LIB)10μL、DNAライブラリー5μLを組み合わせて準備します。泡が出ないようにピペットで上下に3〜5回やすり、優しく混ぜます。得られる30μLのシーケンス混合は、装填準備完了か、必要に応じて45μLに調整可能です。
    2. 溶液をドロップ方向に分散して、シーケンスミックスの30〜45μLをゆっくりとフローセルのサンプルポートにロードします。
      注意:気泡の導入を避け、ピペットの先端が膜に触れないようにしてください。ディスペンス後はローディングポートをしっかり閉じてください。
    3. リアルタイムベースコールを有効にしてシーケンスを開始し、孔の活動を監視します。
    4. アンプリコンあたり≥500×カバレッジが得られるまでシーケンスを続けてください(推奨≥1000×)これにより、正確な塩基呼び出し、信頼性の高いコンセンサスシーケンス生成、低周波バリアントの検出に十分なリードディープを確保します。
      注意:シーケンスカバレッジが低い場合は、必要な濃度で高品質なアンプリコン入力、十分なアクティブフローセル孔、推奨カバレッジを達成するためにシーケンスを延長してください。

6. データ処理と変異解析

  1. 基地呼び出しとデマルチプレクシング
    1. プラットフォーム関連ベース呼び出しソフトウェアを用いて、デフォルトの高精度設定でサンプルごとのFASTQファイルを生成し、高精度ベース呼び出しを行います。デマルチプレックスはバーコードで読み取り、品質管理フィルターを通過した読み取りのみを保持します。
  2. 読み取りマッピングとBAM処理
    1. 国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)ゲノムデータベースからト キソプラズマ・ゴンディイ のリファレンスゲノムアセンブリGCF_000006565.2(TGA4)をダウンロードしてください。 SAG2 解析用に第8染色体(NC_031476.1)、 SAG3 解析用に染色体XII(NC_031480.1)を抽出します。SAMtoolsを使って参照配列をインデックス化し、長読みアラインメントインデックスビルダーでアラインメントインデックスを作成します。
    2. マップリードは、ナノポアシーケンスデータに最適化されたロングリードアライメントアルゴリズム(例:ロングリードマッピング用プリセット、-ax map-ont)を用いてインデックス付き参照ゲノムにリードします。
    3. アライメント出力をBAM形式に変換し、SAMtoolsを使ってBAMファイルをソート・インデックスできます。Picardツールを使って各BAMファイルにリードグループ情報を追加します。深さ統計を使ってローカスごとの平均カバレッジを計算し、フラッグスタット指標を使ってマッピング統計を生成する。
  3. コンセンサスシーケンス生成
    1. ニューラルネットワークベースのコンセンサス研磨アルゴリズムを用いて、デフォルトパラメータを適用してアンプリコンごとのコンセンサスシーケンスを生成します。コンセンサス配列をFASTA形式でエクスポートして下流解析を行う。
    2. 公開されているゲノムデータベースを用いて参照ベースのアラインメントおよび比較配列解析を行います。ゲノム可視化ソフトウェアを用いてリードアラインメントや多型位置を可視化します。
  4. 変種呼び出し
    1. 合意ベースのバリアントコールアルゴリズムを用いて変異検出を行います。バリアント選択ツールを用いた単一塩基多型(SNP)および挿入/欠失イベント(INDELs)を別々に行います(補足ファイル1)。
    2. 品質フィルタリングの閾値を適用してください。SNPについては、QD < 2.0、FS > 60.0、MQ < 40.0などのフィルターバリアントがあります。INDELの場合は、QD < 2.0やFS > 200.0などのフィルターバリエーションがあります。
    3. 標準的なVCF処理ツールを使ってフィルタリング済みのVCFファイルを圧縮・インデックス化します。VCFサマリーユーティリティを使ってバリアント統計を生成します。
  5. 遺伝子型の割り当て
    1. SAG2およびSAG3領域から遺伝子座特異的変異体を抽出し、多型プロファイルと比較株配列を比較してT. gondiiの遺伝子型を割り当てます。

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結果

トキソプラズマ・ゴンディイのゲノムDNAは、SAG2とSAG3という2つの遺伝マーカーを標的としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって成功裏に増幅されました(図2)。精製後、PCR産物はアガロースゲル電気泳動で期待されるサイズの異なるバンドを形成し、639 bp(SAG2)および1158 bp(SAG3)に対応しました。これらのバンドの明瞭さと一貫性により、標的遺伝子断片の増幅と完全な増幅が成功し、その後の配列解析が可能であることが確認されました。

高スループットナノポアシーケンシングにより、 トキソプラズマ・ゴンディイ のRH株およびME49株の両方の遺伝子座全体で高品質なデータセットが生成されました(表1)。 SAG2 遺伝子座では、ME49株のシーケンスにより1,499本のリード、合計849...

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ディスカッション

本研究は、オックスフォード・ナノポア長リードシーケンシングとターゲットマルチロクスアプローチを組み合わせた有用性を示し、 トキソプラズマ・ゴンディイの迅速かつ信頼性の高いゲノタイピングを実現しています。よく特徴づけられた表面抗原遺伝子座 SAG2 と SAG3に焦点を当てることで、RH(タイプI)とME49(タイプII)株の比較解析を通じてオックスフォード・ナノポアを用いた多遺伝子座シーケンスの概念実証を確立し、プラットフォームが株特異的遺伝的変異を解消する能力を示しました。

両遺伝子座のPCR増幅により、期待されるサイズの明確で明確に定義されたバンドが生成され、下流ゲノム解析に適した高品質なテンプレートDNAの成功した生成が確認されました。その後のナノ孔シーケンシングにより、高いリード深度、強力なマッピング効率、および期待されるアンプリコン長に非常に近いコンセンサス配列が生成されました6.これらの結果は、アンプリ...

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この研究は、エジプト高等教育科学研究省(ロンドンのエジプト文化教育局、およびUKRI MRC(MR/X502947/1)によって資金提供されました。図1は以下の方法で作成されました BioRender.com

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースポウダーThermo Fisher Scientific16500100ゲル電気泳動用
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065細胞培養培地
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/Aナノポアアンプリコンシーケンスデータの処理と分析のためのNextflowワークフロー;バージョン1.2.1はMinIONデータの再現可能な分析に使用されました。
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/Aナノポーアシーケンスリードの参照配列へのアラインメントおよびIGVを使用した統合ビジュアライゼーションのためのNextflowワークフロー;バージョン1.2.3はMinIONデータの再現可能な分析に使用されました。
エチルアルコール、ピュアMerck Life Science51976-500ML-Fビーズクリーンアップ用
胎児ウシ血清 (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239細胞培養補足
フローセルウォッシュキットOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004フローセルの洗浄
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331サイズ確認
HFF-1 ヒト包皮線維芽細胞株American Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041新生児の包皮から分離されたヒト真皮線維芽細胞;寄生虫の培養に使用
MinIONフローセル (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114シーケンシング用フローセル
MinION Mk1BシーケンシングデバイスOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101Bナノポアシーケンサー; MinKNOWソフトウェア (v25.09.16)を使用してデバイス制御とリアルタイムベースコーディングを行いました。
MinKNOWソフトウェアOxford Nanopore Technologies, UKN/AMinION Mk1Bデバイス制御、リアルタイムシーケンシング、およびベースコーディングに使用するソフトウェア;バージョン25.09.16。
ネイティブバーコーディングキット24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24多重化サンプル用バーコーディング
NEB Blunt/TAリガーゼマスターミックスNew England BiolabsM0367DNAリガーゼ
NEBNext Quick リガーゼモジュールNew England BiolabsE6056アダプタリガーゼ
NEBNext Quick リガーゼ反応バッファー (5×)New England BiolabsB6058DNAリガーゼで使用
NEBNext Ultra II エンド修復/dA-テイルモジュールNew England BiolabsE7546ライブラリ調製
核酸分解酵素フリー水Thermo Fisher ScientificR0581分子生物学グレード
NucleoSpinゲルおよびPCRクリーンアップキットMacherey-Nagel740609.5PCR製品の精製
ペニシリン–ストレプトマイシン (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122抗生物質混合物
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023洗浄バッファー
Q5 High-Fidelity 2× マスターミックスNew England BiolabsM0492S高精度ポリメラーゼ
QIAamp DNA Blood MiniキットQiagen69504DNA抽出
Quick T4 DNAリガーゼNew England BiolabsM2200アダプタリガーゼ酵素
SYBR Safe DNAゲル染色Thermo Fisher ScientificS33102DNA染色染料
TriTrack DNAローディングダイ (6×)Thermo Fisher ScientificR1161ゲルへのサンプルのローディング
トライプシン–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056HFFの移植用
1× TAEまたは1× TBEバッファー——実行バッファー
2× PCRプレミックス——PCRのレディーミック

参考文献

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