低栄養素および変動する栄養条件下での 大腸菌 研究のための連続培養ミリ流体装置

サマリー

私たちはミリ流体連続培養装置(MCCD)のプロトコルを提示します。これは、一定の低栄養素条件(数百ナノモル濃度まで)または時間的な栄養素変動を極短の時間スケールで培養することを可能にします。

要約

自然界の微生物生息地は、混合栄養素の濃度が低く、空間的多様性があり、時間的な変動が特徴であることが多いです。しかし、従来の実験室での培養法ではこれらの条件を再現できません。バッチ培養は低栄養素環境での成長を維持できませんが、ケモスタットは単一の制限栄養素で定常成長を維持しますが、栄養混合物の定義された低濃度を維持したり急激な変動を導入したりする際には実装が困難です。マイクロ流体システムは動的な環境を生成しますが、集団レベルのオミック解析には十分なバイオマスを生み出しません。これらの制約に対処するため、安定的かつ変動する栄養条件に対する微生物の応答を研究するための多用途プラットフォームであるミリフルイド連続培養装置(MCCD)を導入します。MCCDはステリベックスフィルター(0.45μmポリビニリデンフッ化物[PVDF]多孔質ろ過膜)内に細菌集団を収容しており、培地の継続的な流れにより栄養塩の枯渇を防ぎつつ安定した培養条件を維持します。カスタムMatlabソフトウェアで制御される三方向ソレノイドバルブシステムにより、精密で微細な栄養素変動が可能です。このプロトコルは、MCCDを2つのモードで運用するためのステップバイステップガイドを提供します:(1) 一定の低栄養素条件、(2) 変動する栄養素条件。このシステムを用いると、大腸菌は数十から数百ナノモル濃度のアミノ酸と核塩基の混合物で指数関数的に増殖し、細胞濃度は約10.9細胞/mLに達しました。MCCDは、自然の微生物生息地の主要な特徴を再現することで、大腸菌や他の微生物種における制御されたかつ生態学的に関連性の高い条件下での細菌の成長と生理学の研究を可能にします。

概要

自然の生息地における細菌は、組成や濃度がしばしば変動し、1^、2、3、4の幅広い期間スケールにわたって変動する栄養素の地形に直面します。海洋⁵、土壌³、腸6などの環境^{では、微生物}の成長は一つ以上の必須栄養素によって制約されることが多く、物理的、化学的、生物学的プロセスによって栄養素の利用可能性が変化することがあります^。これらの栄養素の混合物とその変動は、微生物の生存と成長のための戦略を駆動し、生物学^的組織の異なるレベルにわたる反応を形作る4.

微生物の栄養ダイナミクスへの適応は、群集、集団、単細胞レベルで起こります。群集レベルでは、変動が種の共存を促進し、^群集の構成と代謝活動を時間的変異と調整^し、新種が^定着する機会を生み出すことができます。集団レベルでは、栄養素条件の変化が遺^伝的変化を選択することで進化を加速させたり、予測不可能な条件下での生存率を向上させるベットヘッジ戦略¹¹を含む表現型の変異を誘発したりします。単細胞レベルでは、細菌は栄養環境に応じて生理機能を調整します^12,13。最近報告された例の一つに、変動^{する条件下で}細菌に成長の利点をもたらす特定の生理学的特徴があります。細菌はしばしば栄養制限に遭遇するため、個々の細胞としてだけでなく集団や群集内での栄養条件が低く変動する様子を研究することは、自然環境での行動を理解する上で不可欠です。

ケモスタットは単一の栄養素による制限下での成長研究に適していますが、低濃度混合物で複数の栄養素の濃度を制御することを目的とする場合、使用は困難です。ケモスタットは、適切に制御された安定した環境を提供することで、細菌の栄養制限への適応を研究する貴重なツールとなっています。しかし、その作用は本質的に、成長が単一の必須栄養素によって制限される条件に限定されます。ケモスタットでは希釈率を調整し、細胞の成長が1つの制限栄養素の供給を均衡させるようにし、個々の栄養素の濃度ではなく成長速度を固定します¹⁵。この枠組みは、希釈率が全体の成長速度のみを制御し、培地中の各成分の濃度を制御しないため、置換栄養素の混合物(例えば複数の炭素源)を含む環境には容易に一般化^{できません。}その結果、個々の栄養素の濃度とその共利用パターンは、外部から処方されるのではなく、微生物の利用から導かれます^16,17。

さらに、ケモスタットでは栄養素の変動を誘発できますが、通常は培養体積が大きいため、数分単位での急激な変動や単一のシフトは達成が難しいです。マイクロ流体装置は、精密で低濃度かつ変動する栄養環境を作り出す強力なツールとして登場^{しています。}ビデオ顕微鏡と組み合わせることで、単一細胞の増殖を測定することが可能になります。マイクロ流体システムは蛍光リポーターを用いて選択タンパク質の発現を定量化できますが、ケモスタットとは異なり、典型的なマイクロ流体装置は、例えば細菌集団のプロテオーム研究のためのオミクス解析に必要なバイオマスを生成するには小さすぎます。このギャップを埋めるために、ミリ流体連続培養装置(MCCD)を開発しました。

MCCDは、持続的な栄養素の減少や栄養素の変動を含む制御された栄養条件下で細菌の増殖を可能にし、下流解析に必要な十分なバイオマスを生成できる連続流培養システムを使用します。MCCDは0.45μmのPVDFフィルターを培養容器として使用し、培地はリザーバーから新鮮な培地を送る蠕動ポンプによって継続的に補充されます(図1A)。フィルターの多孔質膜は細菌を保持しつつ、栄養素の流れを規定し、低濃度(数百ナノモルからマイクロモルの範囲)でも栄養素の枯渇を防ぎます。バイオマスは保持され、新鮮培地が装置内を継続的に流れているため、MCCDは細胞を保持しながら培地を更新するレテントスタット¹⁸と類似点があります。しかし、MCCDはその構造や栄養供給方法において古典的なレテントスタットとは異なります。レテントスタットは通常、攪拌バルクリアクターとして動作し、細胞はよく混合された培養体積に懸浮します。このような条件下では、栄養素の利用可能性は混合、拡散、細胞取り込みのバランスに依存し、特に栄養素濃度が低く細胞密度が高い場合に局所的な枯渇や勾配が生じることがあります。対照的に、MCCDでは細胞が小容量のステリベックスカートリッジ内の膜に直接組み立てられ、数セルの厚さの層を形成し、連続的に流動する培地にさらされます。カートリッジ内でアクティブミキシングは行われません。代わりに、培地は上流で均質化され、連続流によって供給されます。栄養素は薄い細胞層を通る対流輸送によって供給され、拡散距離が短く流量が高いため、局所的な栄養塩の勾配が最小限に抑えられます。その結果、個体群が経験する栄養条件は主に流入培地の組成によって決まり、攪拌保持システムでは確保できないより一貫性があり明確な低栄養素条件が可能となります。

図1:低濃度または変動する栄養条件下での細菌培養用のミリ流体連続培養装置(MCCD)。 (A) 一定栄養条件のMCCDの回路図。蠕動ポンプは、細菌細胞を含む0.45μmのPVDFフィルターを通じて、リザーバーから新鮮な培地の流れを駆動します。フィルター内の多孔質膜が細菌を保持しつつ、培地を通過させます。連続的な媒体フローは、非常に低い栄養濃度でもフィルター内の栄養条件を一定に保ちます。(B) 変動する栄養条件のためのMCCDの回路図。蠕動ポンプの上流にあるソフトウェア制御の三方向ソレノイドバルブは、2つの貯水槽(例:高栄養塩濃度C高と低栄養素濃度C低)の間で媒体の流入を交互に行_います。ソフトウェアはバルブのプランジャー位置を制御し、アクティブな流入源を特定します。(C) 一定の栄養条件に対応する流体組立。3本のシリコンチューブが通るキャップで新鮮な培地を封印します。1本のチューブは通気フィルターに接続してエアレーションを行い、残りの2本はフィルターに媒体を供給します。バーブ・トゥ・オスのルアー継手はこれらのチューブを蠕動剤チューブに接続し、各蠕動剤チューブを片方向逆止弁に接続し、フィルターへの入口として機能します。フィルター出口には一方向逆止弁も装備されています。画像は2つのサンプルを示しており、それぞれ1つのフィルターに含まれています。(D) 変動する栄養塩条件のための流体アセンブリ。金属製プラットフォームには、カスタムMATLABソフトウェアを介して2つのソレノイドバルブを制御するマイクロコントローラと電子部品が収容されています。ねじ込み式のバーブ継手は、ソレノイドバルブの入口と出口の両方をチューブに接続します。各バルブには2つの代替培地用の2つの入口があり、ここでは高栄養濃度培地のC_High(赤色ラベルの管)と低栄養濃度の培地C_Low(青色ラベル管)があります。メディアは(C)のようにベントフィルター付きのキャップ付きボトル内に収められています。ソレノイドバルブからの出口は、定常状態アセンブリ(C)と同様に蠕動チューブを介してフィルターに接続されます。画像は2つのサンプルを示しており、それぞれ1つのフィルターに含まれています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

さらに、ステリベックスフィルターの上流にソフトウェア制御の三方向ソレノイドバルブを組み込むことで、異なるリザーバーに含まれる2つの媒体間で媒体流量を切り替えることができます(図1B)。その結果、この装置は、安定した環境(低濃度を含む)の栄養素条件や、数分以上の変動時間スケールを持つ栄養素変動に対する細菌の反応を研究するために使用できます。

このプロトコルは、栄養素が低く変動する条件下で細菌を研究するためのMCCDの組み立てと動作を概説しています。例として、このプロトコルは、MCCDの2つの運用モードである一定の低栄養条件と変動する栄養条件で大 腸菌 NCM3722を用いた成長実験の段階的なガイドを提供します。MCCDのセットアップは他の栄養条件や微生物種にも容易に適応でき、自然界で典型的な栄養環境下での細菌生理学を研究するための多用途なプラットフォームとなっています。

プロトコル

1. 一定の栄養条件下での細菌の増殖

注:本プロトコルは非常に希釈されたリッチ定義培地(「低RDM」)条件下で大 腸菌 NCM3722の成長曲線を測定する手順を記述しています。この成長曲線は12時間にわたって行われ、2時間ごとに1つのサンプルが採取されます(合計6つの時間点)。このプロトコルの重要な原則は、各時刻が単一のステリベックスフィルター(以下0.45 μm PVDFフィルターと呼ばれる)に対応していることです。サンプルを採取するには、フィルター内の培養物を逆さまに遠心分離して回収し、セル数を定量し、フィルターを廃棄します。0.45μmのPVDFフィルターは1つのサンプルのみを生成します。実験準備には、3つの主要な実験パラメータの定義が必要です:蠕動ポンプの流量、実験時間、そして望ましい試料数(すなわち0.45μmのPVDFフィルターの数)。初期流量を2 mL/minに設定してください。必要に応じてこのパラメータを調整してください(例:非常に希薄な栄養塩の供給を維持するために流量を上げるなど)。

1. 培地と材料の調製
   注意:各フィルターは単一の時間点サンプルに対応しているため、各0.45μmのPVDFフィルターの実験的稼働時間は収集時間によって異なります(例:最初の時刻は2時間、2番目の時刻は4時間、以下は同様です)。
   1. 次の式を用いて必要な培養培地の体積を推定します
      ,
      ここでnはサンプル数(0.45μmのPVDFフィルター)、Qは流量(mL/min)、_tiは各サンプルの実験実行時間(分)です。
   2. 流量変動を考慮してさらに20%の体積を加えるために1.2を掛けます。この例では、計算します。
      
   3. 計算された体積を切り上げます(例:この例では6,200 mLを準備します)。
   4. 滅菌用の材料を準備してください( 表1参照)。
      注意:実験の前日に材料を準備し滅菌し、準備を整え遅延を最小限に抑えてください。これらの材料はオートクレーブし、一方通行のルアーバルブは除きます。バルブを70%エタノールで消毒してください。
      1. 6本のシリコーン製蠕動剤チューブの両端を「Male Luer to Barb」プラスチック製継手に接続し、継手のBarb側をチューブに差し込みます。オスのルアーの端はアルミホイルで覆い、汚染を防ぎます。
         注:実験では6本の0.45μmPVDFフィルターを使用するため、6本の蠕動チューブが準備されています。すべてのチューブは後に同じ蠕動ポンプヘッドに取り付けられ、すべてのフィルターが同じ流量を受け取るようにされます。
      2. チューブを密閉された滅菌可能な容器に入れます。
      3. 換気フィルターは密閉された滅菌可能な容器の中に設置してください。
      4. チューブ付きのボトルキャップは、キャップを通るシリコンチューブを通し、密閉された滅菌可能な容器に入れます。
         注:本プロトコルで使用されるチューブ付きボトルキャップには、キャップを横断する3本のチューブが装備されています。1本は0.45 μmのPVDFフィルターに媒質を供給するための同じ直径の2本、もう1本は直径が広い3本です。これらのチューブはキャップにしっかりと固定されており、取り外すことはできません。
      5. 12個の一方向ルーアーチェックバルブを70%エタノール溶液に浸し、一晩消毒します。
         注意:(間)滅菌された材料は実験の最大24時間まで室温で浸かって密封保存できます。使用前にエタノールのバルブを外し、無菌の超純水で洗い流して残留エタノールを除去してください。あるいは、オートクレーブ可能な材料を使って逆止弁を3Dプリントし、エタノール処理の代わりにオートクレーブによる滅菌が可能です。
   5. 蠕動剤チューブ、ベントフィルター、ボトルキャップ、目盛りシリンダー、ボトルを標準的な実験器具設定でオートクレーブ処理します。
   6. 表2に記載された試薬を混合して、6,200mLの低リッチ定義培地(RDM;材料表参照)を準備します。
      注意:実験当日に、前培養開始後約5時間の待機期間中に培地を準備してください(ステップ1.2.1参照)。これにより中程度の鮮度が保たれ、汚染リスクを最小限に抑えます。
2. 細菌前培養の調製
   注意:実験開始には指数相の前培養を用いてください。この段階では、細菌は一定の速度で増殖し、細胞構成要素をバランスよく合成し、定められた細胞量で分裂します。指数位相細胞を用いて変動を最小限に抑え、初期生理状態を標準化します。
   1. 実験前日に、以下の一晩(ON)培養を準備します:滅菌された15mL培養チューブに、大 腸菌 NCM3722のグリセロールストックを凍結した大腸菌のストックとともに、全RDM3 mLを接種します。培養液を37°Cで1~16時間、振動インキュベーターで200rpmで振って培養します。
      注:(間置き)ON培養がインキュベーターに入った後は、この日はそれ以上の手順は踏みません。翌日、ステップ1.2.2に進みプロトコルを再開します。
   2. 実験当日、プレ培養液を次のように準備します:6 mLのフルRDMに6 μLのオン培養を加えます。15 mL培養チューブを2本に均等に分け、それぞれAとBとラベル付けします。両方のチューブを37°Cで200 rpmで振ってインキュベーションします。
      注:プレカルチャーは通常、指数相(OD₆₀₀ ≈ 0.5)に達するまでに約5時間かかります。この期間を使って新鮮な培地を準備してください(ステップ1.1.6参照)。OD₆₀₀ がおよそ0.5に達するまでステップ1.2.3に進まないでください。
   3. 600nmでB管を使って光学密度(OD)を監視します。_OD600 が約0.5に達し、大 腸菌 NCM3722の全RDMで指数関数的に成長したことを示したら実験を進めます(セクション1.4参照)。
      注意:再現性を高め、開始条件を標準化するために、指数位相セルから実験を開始してください。
3. 一定の栄養条件でMCCD実験の準備
   注意:前培養が始まった直後に、無菌のバイオセーフティキャビネット内でステップ1.3.1から1.3.5までを行ってください。
   1. 各ボトルに中容量を割り当ててください。
      注意:ボトルは中容量の貯蔵庫として使ってください。2本の中液供給チューブを装着したボトルキャップを使用し、それぞれのチューブで1本の0.45μmPVDFフィルターに中液を供給します。実験期間中に各タイムポイントサンプル(すなわち各0.45μmのPVDFフィルター)に必要な量に基づいて、ステップ1.1.6で準備された全培地の容量をボトルに割り当てます。
      1. ステップ1.1.1で示された式を用いて、各0.45μmのPVDFフィルターに必要な培地の体積を決定します。例えば、以下の用語を用いると:
         
         各時点に必要な総媒体容量は、時系列で288、576、864、1152、1440、1728 mLです。
      2. 計算された培地の体積をボトルに分散させ、2つの時間点に必要な体積を1本のボトルにまとめます。例えば:1リットルボトル1本に~900 mL(時点1・2)、2.5Lボトル1本(時点3・4)、4時点~3・6時点1 4 Lボトルで~3200 mLの培地。
   2. 各ボトルをチューブ付きのキャップで密封します(図1C参照)。漏れを防ぐためにキャップをしっかり締めてください。
   3. チューブ付きボトルキャップから伸びる最も幅広いシリコーンチューブに0.2μmのベントフィルターを接続します(図1C)。これにより実験中の無菌空気交換が可能になります。
   4. 各蠕動剤チューブの一端(すでにフィッティングが取り付けられている場合、材料準備に関するセクション1.1.4参照)をチューブ付きボトルキャップから伸びる小径シリコーンチューブに取り付けます(図1C)。無菌性を維持するために安全な接続を確保しましょう。実験が始まるまで、自由なオスルアーロックのアルミホイルカバーはそのままにしておき、汚染防止のため実験が始まるまでそのままにしてください。
   5. 組み立て済みのチューブと蠕動ポンプを合わせたボトルを37°Cに設定したインキュベーターに入れます。 チューブを蠕動ポンプヘッドのチャネルに固定してください。
      注意:すべての蠕動剤チューブは単一の蠕動ポンプの同じポンプヘッドに取り付けられており、すべての0.45μmのPVDFフィルターは同じポンプから媒体を受け取ります。単一のポンプを使用することで、フィルター間で流量が一致し、ポンプ間の違いによる変動を防ぎます。
4. 栄養条件が一定のMCCDでの実験プロトコル
   1. 前培養液(OD = 0.5)を1:10に希釈し、600μLのプレカルチャーを新鮮な低RDM5.4mLに加えます。
   2. 1 mLのピペットを使い、希釈した前培養液を6つの0.45 μmのPVDFフィルターそれぞれにそれぞれ1 mL注入します。
   3. 一方通行逆止弁はオートクレーブした超純水で洗い流し、0.45μmのPVDFフィルターの両端に1つずつ取り付けます。
   4. 蠕動剤チューブの継手からアルミホイルカバーを外してください。
   5. 6つの0.45μmPVDFフィルターそれぞれを、蠕動チューブのオスルアーフィッティングに接続します(図1C)。
   6. 蠕動ポンプの流量を2 mL/minに設定し、流れを始めます。この瞬間を時間0と定義します。
   7. 0.45μmのPVDFフィルターの下に廃棄物容器を設置し、排出水を集めます。
      注: 図2A はインキュベーターボックス内での実験の完全な組み立て図を示しています。
5. サンプル採取
   1. 2時間後に、1Lボトルに接続された2つの0.45μmPVDFフィルターのうち1つを抜きます。
   2. 一方通行逆止弁を外し、0.45μmのPVDFフィルターを50mLの遠心分離機管に挿入し、入口を下に向けて設置します。
   3. 0.45μmのPVDFフィルターを含む遠心管を2,000× g で2分間遠心分離します。
   4. パイプカッターを使って、出口に近い端のプラスチック被覆部分に優しく圧力をかけて0.45μmのPVDFフィルターを開きます。
      注意:使用前にパイプカッターを消毒してください(例:70%エタノールで拭き取って)。0.45μmのPVDFフィルターを開ける際の汚染を防ぐためです。
   5. 多孔質膜を含む内側の円筒を解放し、膜を保持するフィルターの部分を廃棄します。
   6. 遠心分離機管内で採取した培地で、0.45μmのPVDFフィルター内壁(流れ方向に垂直な部分)を洗い流します。
      注意:この工程により、遠心分離中に壁に閉じ込められた細胞が確実に回収されます。
   7. 5mLの血清学ピペットで採取した総体積を測定します。
   8. その後の時刻(4時間、6時間、8時間、10時間、12時間)で対応する0.45μmのPVDFフィルターを抜き、ステップ1.5.2–1.5.6を繰り返します。以下の特定の順番に従ってください:
      1. 4時間後に、1Lボトルに接続された2つ目の0.45μmPVDFフィルターを抜きます。
      2. 6時間と8時間の時に、2.5Lボトルに接続された0.45μmのPVDFフィルターを抜きます。
      3. 10時間と12時間で、4Lボトルに接続された0.45μmのPVDFフィルターを抜きます。
         注意:この順序に従って、サンプリング時間ポイントをステップ1.3.1で配布された媒質体と一致させます。
6. 下流解析
   1. 各サンプルから100μLのアリコットを3つ取り、グルターアルデヒドで最終濃度1.5%に固定します。
      注意: グルターアルデヒドは有毒で強い刺激物であり、潜在的な感作剤です。化学ファンムフード内で適切な個人用防護具(白衣、ニトリル手袋、安全メガネ)を着用して取り組むこと。皮膚への接触や吸入は避けてください。グルターアルデヒド含有廃棄物は、機関の有害化学廃棄物規制に従って処分してください。
   2. 蛍光DNA染料で標識した後、フローサイトメトリーで固定サンプルを使って1マイクロリットルあたりの細胞数を数えます。
      注意:蛍光DNA染料は変異原性がある可能性があります。機関のバイオセーフティ規則に従い、手袋を着用し、染料を含む廃棄物を処分してください。
      注:DNA染色やフローサイトメトリーの代替として、サンプルの少量をリッチメディウム寒天プレート(例:LB寒天)にプレートし、コロニー形成単位(CFU)を数えることで細胞密度を推定できます。
   3. ステップ1.5.7で測定したセル数/マイクロリットルに、0.45μmのPVDFフィルター内に含まれるセル数を計算します。
   4. 残りの体積を1.5mLマイクロ遠心分離機チューブで10,000 × g で4分間遠心分離します。
   5. 上清液を取り除きます。
   6. 細胞のペレットは将来の解析(例:トランスクリプトミクス)のために-80°Cで保存してください。

図2:MCCDの実験的組み立て。 (A) 一定栄養条件のためのMCCDセットアップの写真。セットアップは一定温度を維持するためにインキュベーターボックス内に収められ、廃棄物容器が流れる媒体を収集します。(B) 変動する栄養塩条件に対応するMCCDセットアップの写真。赤テープでラベルを貼ったボトルには高栄養濃度の培地(C_High)が入り、青いテープでラベル付けされたボトルには低栄養濃度の培地(C_Low)が入っています。中央の金属製プラットフォームは、図1Dに示されている栄養素変動を制御する部品を支えています。この 図の拡大版はこちらをクリックしてください。

2. 栄養素の変動条件下での細菌の増殖

1. ソレノイドバルブのコントローラーの組み立て
   注意:三路ソレノイドバルブは、MATLABで開発されたカスタムグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を実行するコンピュータに接続されたマイクロコントローラベースのスイッチング回路で制御します。
   1. ソレノイドバルブ制御回路(図3A)を組み立てます。
      1. マイコンのデジタル出力ピンをNPNトランジスタのベースに1 kΩ抵抗を介して接続します。
      2. トランジスタのコレクタをソレノイドバルブの負極に接続します。
      3. トランジスタのエミッタをアースに接続します。
      4. ソレノイドバルブの正極を、バルブ電圧に対応した外部直流電源に接続します。
      5. ソレノイド端子にダイオードを置きます。ダイオードのストライプ側を正の電源ラインに接続します。
         注意:ダイオードはソレノイドがオフになったときに発生する電圧スパイクを抑制します。
   2. ソレノイドバルブにプラスチック製の「ねじ込みホースバーブ」継手を取り付け、バーブ側が外側に伸びるようにしてください。
   3. USB接続のあるコンピュータにMATLAB R2022b以降をインストールしてください。
   4. マイクロコントローラハードウェアとのシリアル通信に必要なMATLABサポートパッケージをインストールしてください。
   5. USBケーブルでコンピュータに接続してシリアル通信を確立します。
   6. MCCDで変動する栄養素条件を生成するためのMATLABベースのGUI(リンク https://github.com/juanitaLara/MCCD で利用可能)を開きます。
   7. ソレノイドバルブとMATLAB GUIプラットフォームの接続を確認してください:
      1. MatlabでGUIプラットフォームを開き、「 Connect 」ボタンをクリックしてください(図3B)。コマンドウィンドウに 「Controller connected all that 」というメッセージが表示されるまで待ちます。
      2. 自動操作パネルの下で時間ステップの値を入力します(例:高・低相は5秒)。
      3. ソレノイドバルブを観察し、2つの媒体を切り替える際に発生する カチッという 音を聞いてください。
      4. 時計を使って、ソレノイドバルブが指定された間隔(例:5秒ごと)に正確に切り替わっているか確認してください。
         注意:通信確認とバルブスイッチングの正しい確認のために、各実験前にこの検証を行いましょう。(間)ソレノイドバルブの動作を確認した後、システムは数時間インキュベーター内で組み立てたままにしてから実験を開始します。
2. 媒体と材料の準備
   注意:このプロトコルは、低RDMと高RDMを交互に1時間(高RDMで30分、低RDMで30分)に栄養条件を交互に行うものです。実験は3時間の変動期間中に行われ、2つのサンプルが収集されます:(1) 3時間1分(高 RDM フェーズ、低から高 → ハイへの切り替え直後)、(2) 3時間31分(低 RDM フェーズ、高から低への切り替え直後)。
   1. 実験段階ごとに必要な培養培地の体積を推定してください。
      1. まず、最初の3時間(3回の完全な変動期間)に必要な体積を計算します:
         低RDM体積=1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 μm PVDFフィルター] = 432[mL]
         高RDM体積=1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 μm PVDFフィルター] = 432[mL]
      2. 最終30分のフェーズに必要な体積を計算してください:
         高RDM体積=1.2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[0.45 μm PVDFフィルター] = 72[mL]
      3. 体積を便利な値(例:低RDM500mL、高RDM600mL)に切り上げます。
   2. オートクレーブ滅菌用の材料を準備する際は、手順1.1.4から1.1.5に従ってください( 表3参照)。
      注意:実験前日に材料を準備・滅菌し、準備を整え、実験当日の遅延を最小限に抑えてください(ステップ2.2.3および2.2.4)。この構成は、一定栄養実験と比べて、メディアボトルをソレノイドバルブに直接接続するための追加のチューブが必要です(図1B,D)。これらのチューブはソレノイドバルブ継手があらかじめ組み立てられているため、「バーブからオスルアー」への継手が1つだけで済みます。オートクレーブする前に、これらのチューブの端をアルミホイルで覆います。
   3. 準備済みの蠕動剤チューブ、ベントフィルター、キャップ、目盛りシリンダー、ボトルをオートクレーブで滅菌してください。
   4. 4つの一方通行ルーアー逆止弁を70%エタノール溶液に浸し、一晩消毒します。
      注意:(間)滅菌済みの逆止弁は、エタノールに一晩浸かせて保管し、室温で密閉して最大24時間保管できます。使用前に、バルブを滅菌のミリQ水で洗い流してください。
   5. ソレノイドバルブは70%エタノールで3〜5回洗浄し、その後超純水で3〜5回洗浄・滅菌します。
   6. 実験当日、前培養準備後の約5時間の待機期間(ステップ2.3参照)に、 表4に記載された試薬を混合して低RDM500mLと高RDM600mLを準備します。
      注意:実験当日に培地を準備することで新鮮さを確保し、汚染リスクを最小限に抑えます。
3. 細菌前培養の調製
   1. ステップ1.2の手順に従ってください。
4. 変動栄養素条件下のMCCD実験準備
   注意:前培養が始まった直後に、無菌のバイオセーフティキャビネット内でステップ2.4.1–2.4.4を実行してください。
   1. それぞれの培地を1リットルのボトルに入れます。
   2. ボトルは、3つのポートとシリコンチューブがあらかじめ取り付けられたキャップで密封します。漏れを防ぐためにキャップをしっかり締めてください。
   3. 各ボトルキャップのポートから伸びる幅広のシリコーンチューブに0.2μmのベントフィルターを接続します。
   4. 「インレットチューブ」( 図1Dに示されている)をチューブ付きのボトルキャップから伸びるシリコンチューブに接続し、その後ソレノイドバルブに接続します:
      1. シリコーンチューブの一端(1つのフィッティングのみ)を低RDMボトルキャップから伸びるチューブに接続します。
      2. アルミホイルカバーは、ボトルがインキュベーターに運ばれるまで、無料のオスルアーロックフィッティングのままにして汚染を防ぎましょう。
      3. 高放射量ボトルについてはステップ2.4.4.1を繰り返します。
   5. ボトルを組み立てた「入口チューブ」、蠕動ポンプ、ソレノイドバルブを設置し、コントローラーを37°Cに設定したインキュベーター内に置きます。
   6. ステップ2.4.4で取り付けられた「インレットチューブ」をソレノイドバルブのインレットに以下の方法で接続します:
      1. 低速RDMボトルの2本のチューブを各ソレノイドバルブの2つの入口のいずれかに接続します( 図1Dに青いテープでラベル付けされたチューブ)。
      2. 高RDMボトルの2本のチューブを、各ソレノイドバルブの2つの入口のいずれかに接続します( 図1Dに赤テープでラベル付けされたチューブ)。
   7. 各ソレノイドバルブの出口に、ペリスタルティックポンプ対応のシリコーンチューブ(1つの継手のみ)を接続します(図1D)。実験が無菌性を維持し始めるまで、アルミホイルのカバーはフリーのオスルアーロックフィッティングのままにしてください。
5. 変動栄養素条件を持つMCCD実験のプロトコル
   1. ソレノイドバルブとMatlabソフトウェアの接続はステップ2.1.7を実行して確認してください。
   2. 変動のタイムステップ値をMatlab GUIプラットフォームに入力します。ハイRDMで1800秒(30分)、ローRDMで1800秒(30分)のタイムステップを入力します。
   3. 「Start from menu」から「Low」を選択して、Low RDM条件(図3)で開始します。
   4. ステップ1.4で説明した2つの0.45μmのPVDFフィルターをシーディングします。
   5. 実験を始めてください。
      注: 図2B はこの実験の完全な流体アセンブリを示しています。
6. サンプル採取
   1. ステップ1.5のようにサンプルを採取します。最初の0.45μmのPVDFフィルターは3時間1分で、2つ目は3時間31分で収穫します。
      注意:どちらかのフィルターのプラグを抜いてください。両方のフィルターは同じメディアから供給されています。
7. 下流解析
   1. ステップ1.6で説明された手順に従い、フローサイトメトリーによる細胞数のカウントと、下流解析(例:トランスクリプトミクス)のためにサンプルを処理・保存します。

図3:栄養素変動を課すソレノイドバルブのコントローラー。 (A) ソレノイドバルブを制御する電子回路の配線図。回路は、マイクロコントローラ基板、スイッチング素子として使われるトランジスタ、トランジスタベースに接続された抵抗、そしてバルブスイッチング時に発生する電圧スパイクから回路を保護するためにソレノイドバルブに設置されたフライバックダイオードで構成されています。マイコンはトランジスタを制御し、トランジスタはソレノイドバルブへの電源供給を切り替えます。参考文献²⁰の許可を得て改編。(B)マイクロコントローラ基板をGUIを実行するコンピュータとソレノイドバルブに必要な電圧の電源に接続した後、「接続」ボタンを押すことで通信が確立されます。バルブは手動操作パネルを使って操作でき、ユーザーは飛ばす媒体(例:「高」または「低」)を選択します。または、自動操作パネルでは、各フェーズ(高・低)の初期媒体と時間ステップ(秒単位)を指定し、スタートボタンをクリックして操作を開始することができます。リアルタイムモニターは、時間経過とともにステップ関数(0 = 低、1 = 高)を示し、直近数秒間にどの媒体がソレノイドバルブを通ってフィルターに流れていたかを示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

本研究では、MCCDを用いて、3つのRDM濃度下で一定の低栄養条件下で大 腸菌 NCM3722の成長速度を定量化しました。これらの濃度は、Neidhardt¹⁹によって記述されたリッチ定義培地(RDM)式から導き出され、アミノ酸補給物とヌクレオベース補給剤はそれぞれ元の製剤の0.5%、0.25%、0.01%に希釈されました。

成長速度を定量化するために各培地で再現成長実験が行われました。0.5%のRDMおよび0.25%の条件に対して、2時間、3時間、4時間、5時間に4つのSterivexフィルターを用いて3回の重複実験を実施しました。0.01% RDM条件下では細胞の成長が遅くなったため、実験期間は12時間に延長され、6つの0.45μmPVDFフィルターを2時間ごとにサンプリングしました。0.1%のRDM条件下で2つの再現実験を実施しました。

各時点の細胞数は、0.45μmのPVDFフィルターか...

ディスカッション

自然環境の栄養素の複雑さを捉える細菌培養法は、単純化された実験室条件を超えて微生物生理学の研究を進展させるために不可欠です。自然生態系は広範な濃度範囲にわたる栄養塩の混合物を含み、最大成長率^{1,3,4,21,22,23}を支えないことが多いです。さらに、栄養素の利用可能性は時間とともに変動し、時には細菌の生成²⁴倍に匹敵するかそれ以下の時間スケールで変動することもあります。その結果、細菌は栄養素組成や時間的ダイナミクスの両面で多様な環境に頻繁に遭遇します。MCCDは、従来の培養法やほとんどのマイクロ流体システムでは再現が困難な条件下で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1K Ohm 抵抗器	BC Robotics	ELC-021	定格電力：1/6 W
1N4001 ダイオード	BC Robotics	ELC-001	DC 逆耐圧：50 V; 平均整流電流：1 A
3-stop プラチナ硬化シリコン ペリスタルティックチューブ	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	内径 0.8 mm; 外径 2.4 mm; 使用するペリスタルティックポンプと互換性あり
3方向ソレノイドバルブ	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
アルミ箔			オートクレーブに適している
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
オートクレーブ	Systec	D-200	または異なる会社
3ポート付きキャップクロージャー - 1 および 2 L ボトル用	Nalgene	2162-0531	または異なる会社 (選択したボトルに適合することを確認してください)
3ポート付きキャップクロージャー - 4 L ボトル用	Nalgene	2162-0830	または異なる会社 (選択したボトルに適合することを確認してください)
セル密度計 CO8000	WPA biowave		OD メーター
遠心分離機	Eppendorf	5804R	50 mL Falcon チューブに適合する遠心分離機
遠心分離機	Eppendorf	5424R	1.5 および 2 mL eppendorf チューブに適合する遠心分離機
コニカル遠心分離チューブ - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Falcon チューブ
培養チューブ (14 mL, 無菌)	Greiner bio-one		培養チューブ
エタノール	Sigma Aldrich	493511	70% に希釈
フローサイトメーター	Beckman	C09756	CYTOFlex
グルタールアルデヒド 25%	Sigma Aldrich	G5882	または異なる会社
目盛り付きシリンダー - 500 mL	Nalgene	3662-0500	または異なる会社
インキュベーターボックス			カスタムビルドインキュベーターボックス - 構造の詳細については対応する著者にお問い合わせください
LabV1 インテリジェント低流量ペリスタルティックポンプ	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Darwin Microfluidics で入手可能
オスルアー - バーブ継手	Aldrich	Z277142	0.8 mm ID チューブに対応するオスルアー - バーブアダプター (図 1C を参照)
オスルアー - ねじ継手	Aldrich	Z277142	ソレノイドバルブを "入口チューブ" に接続するのに使用 (図 1D を参照)
Matlab	Mathworks	R2022b 以降	ソレノイドバルブ用のカスタムメイドソフトウェアを実行するソフトウェア
MOPS EZ Rich 定義済み培地キット	Teknova	M2105	Enterobacteria 用 MOPS 培地
一方向ルアーチェックバルブ	Masterflex	30505-92	培地リザーバーへの逆流を防ぐ
パイプカッター - 0-37 mm	KS Tools	2222051	または異なる会社
ピペットセット	Fisher Scientific	05-403-151	または異なる会社
プラチナ硬化シリコンチューブ - 1/16 in	Nalgene	8060-0020	内径 1/16 in (1.6 mm); 変動栄養実験に使用
プラチナ硬化シリコンチューブ - 1/8 in	Nalgene	8060-0030	内径 1/8 in (3.2 mm); 変動栄養実験に使用
ポリプロピレンコポリマーボトル - 1 L	Nalgene	2126-1000	または異なる会社
ポリプロピレンコポリマーボトル - 2 L	Nalgene	2126-2000	または異なる会社
ポリプロピレンコポリマーボトル - 4 L	Nalgene	2126-4000	または異なる会社
セルロース管 - 5 mL	Corning	CLS4487	または異なる会社
ハンダレスブレッドボード	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV フィルター - 0.45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I 核酸ゲル染色	Invitrogen	S7563	フローサイトメーターでのセルカウント用の核酸染色
TIP120 ダーリントントランジスタ	BC Robotics	TRN-005
チューブ - 1.5 mL	Eppendorf	3810X	細胞培養の遠心分離およびペレットの保存用のチューブ
ベントフィルター	Millex	SLFG05000	0.2 µm 疎水性ベントフィルター
廃棄物容器			容量は実験で使用する総培地量を下回ってはならない