ラット尾部間融合モデルの開発:パイロット実現可能性調査

サマリー

本研究は、後方ケージとプレート固定を用いたパイロットラット尾部間融合モデルの技術的実現可能性を示しました。12週の組織形態測定解析により、連続的な骨橋とケージ内の骨成熟パターンが明確に確認されました。この技術的モデルは、将来の大規模研究の予備的基盤となります。

要約

ラット尾椎は骨再生や脊椎融合研究で、骨移植材料やインプラントの試験に適した場所として広く利用されています。従来のラット尾部融合モデルでは、椎間板摘出や骨移植、または外固定装置による椎間固定が実現されてきました。それにもかかわらず、臨床で使われるものに類似した体間固定ケージを用いた小動物モデルはまだ開発されていません。ラット尾椎に臨床的手技を模倣した後方ケージ挿入を行い、プレート固定を補助することで、神経学的な合併症なしに評価の高い骨融合環境を確立できると仮説が立てられました。この予備パイロットスタディ(n = 1)は、技術的実現可能性を評価するために設計されました。切除された椎間板に、隣接する尾椎間の椎間板空間にミニチュア化されたチタン製のケージを正確に挿入する外科的アプローチが開発され、人間の手術手法に非常に近似しました。チタンは臨床での広範な使用と生体適合性から選ばれました。初期の結果は、この手法の技術的実現可能性を示しました。埋め込み式ケージは椎間板の高さと脊椎の整列を維持しました。ケージを通じた骨の進行的な増殖が観察され、術後12週間までに椎間間隙を横断する連続的な骨橋が確認されました。連続した小梁構造の存在と、間にある線維組織の不在が放射線学的および組織学的に確認されました。総じて、このケージベースのラット尾融合モデルは、新規バイオマテリアルの評価や椎間骨融合のメカニズムの研究に有望なプラットフォームを提供します。しかし、単一被験者設計のため対照群や統計解析が不足しているため、これらの発見の一般化可能性が制限され、さらなる検証が必要となります。

概要

体間固定術は、不安定性、脊椎すべり症、変性疾患など、さまざまな脊椎疾患に対する確立された外科的治療法です。特に、約70年の間に標準手順として進化してきました。この手術では、椎間板を除去し、隣接する椎骨^間の固形融合を促進するためにケージまたは骨移植片を挿入^します。さらに、ケージ付きの後部器具を追加することで、偽足顎症の発生率が減少し、臨床適応が拡大^します5.それでも、偽足傷やケージ沈下といった合併症は依然として重大な臨床課題であり、新材料や融合促進因子を評価するために信頼できる前臨床モデルの開発が必要です^。6,7。

ラットはその経済的実現可能性、迅速な繁殖、迅速な治癒、取り扱いの容易さから、脊椎固定術の研究で広く利用されています^8,9。それにもかかわらず、既存のラット体間融合モデルには重大な制限があります。具体的には、ラットにおける前方腰椎椎間固定術(ALIF)アプローチは、主要な腹部血管および臓器操作を必要とし、高い外科的侵襲性と重大な合併症リスクを伴います(^10,11)。後方腰椎間固定術(PLIF)アプローチは、極めて小さな脊髄管と神経要素のために神経障害のリスクが避けられず、神経後退がほぼ不可能となります¹²。その結果、ほとんどのラット研究は後外側固定術(PLF)に限定されており、これは^{臨床現場で}重要な骨融合のメカニズムを構造的に調査できていません。さらに、尾部モデルは存在しますが、臨床的な体間ケージと後方プレート固定を統合した評価システムがありません。

ラットの尾棘は、体間融合研究において独自の利点を提供します。尾椎間板は人間の腰椎椎間板と幾何学的、組成的、機械的に強い類似性を示し、椎間板研究でますます人気を集めています ^14,15。さらに、尾椎手術は腰椎アプローチと比べて手術へのアクセスが容易で、費用対効果が高く、術後の回復も迅速^です。しかし、これまでのところ、ラット尾部脊椎における後方ケージ挿入の成功例と、ケージ内外の骨形成の詳細な組織学的評価を報告した研究はありません。

組織学的評価、特に脱石灰化されていない骨組織形態計測は、骨統合および骨融合の評価において依然としてゴールドスタンダードです^17,18。具体的には、骨量/組織体積(BV/TV)、小梁数、小梁厚などの重要な骨形成パラメータの定量的解析を可能にし、編織骨とラメラー骨を区別して骨成熟度の質的評価^{を可能にします。}このような詳細な組織形態測定評価は、ケージ内およびケージと椎骨の境界における空間的および時間的骨伝導パターンを明らかにすることができる^21,22。しかしながら、ラットモデルにおけるケージ骨伝導の包括的な組織形態計測評価は不足しています。

本研究は、後方ケージ挿入と補助プレート固定を用いたパイロットラット尾部間融合モデルの開発を目的とし、その技術的実現可能性を示すことを目的としています。本研究は、ケージ内および椎骨エンドプレート界面における骨形成の詳細な外科的技術と包括的な組織学的評価を提示します。ラット尾椎に臨床的手技を模倣した後方ケージ挿入を行い、プレート固定を補助することで、神経学的な合併症なしに評価の高い骨融合環境を確立できると仮説が立てられました。このモデルは、体間融合材料の評価に効率的なプラットフォームを提供し、既存の文献では、ラットモデルにおける組織形態計測的骨伝導評価を用いた後方ケージ配置の成功に関する初期の技術的探求を示しています。

プロトコル

すべての動物実験は、ジケイ大学動物ケア・利用委員会(承認番号2023–034C1)が承認したプロトコルに従って実施されました。この研究はパイロットの実現可能性調査として設計されました。この非常に繊細で新しいラット尾部脊椎の後方ケージ挿入の技術的有効性を評価するため、倫理的ガイドラインに従い、初期の技術的評価では動物使用を最小限に抑えるために単体動物(n=1)を使用しました。脊椎固定研究の標準株として、オスのスプラグ・ドーリー(SD)ラットが選ばれました。対象は、椎間板の高さ(1.8〜2.2 mm)が2 mmケージと適合していることを確認するため、生後8〜10週の健康な男性で、体重200〜250 gの間でした。慣化期間中に体重>10%減少、活動量の低下、または尾の目に見える変形を示す動物は除外されました。本研究では、オスのスプラグ・ドーリーラット(生後8週、体重221.8g;日本 SLC(静岡、日本)が利用されました。動物は25°C、相対湿度50%(許容範囲30〜70%)の管理された環境で飼育され、12時間の明暗サイクルで、 自由に 水と標準的な齧歯類の食事が提供されました。ラットは環境改善のために巣材や噛み棒が用意された固底ケージに飼育されていました。手術前に3日間の順応期間が設けられました。ケージメイトが尾のインプラントをかじるのを防ぐため、研究期間中は単一飼育環境で飼育され、この実験設計において重要な要素となりました。

ねじとプレートの準備

手術前に内固定材料が準備されました。市販のステンレス製ネジ(元の直径1.2mm、長さ14mm)はワイヤーカッターで正確に6mmに切断されました(図1A)。これらのネジは標準的な蒸気オートクレービングで121°Cで20分間滅菌されました。ポリオキシメチレン(POM)内部固定板(長さ18mm、幅3mm、厚さ1mm)では、直径1.2mmのネジ穴を手動ドリルで12mm間隔で開けました(図1B–D)。その後、POMプレートの角をワイヤーカッターで丸くし、周囲の軟部組織への刺激を最小限に抑えました(図1E)。プレートは、高分子の熱感受性を考慮し、エチレン酸化物(EtO)ガスまたは過酸化水素ガスプラズマで滅菌されました。チタンケージは直径300〜500μmの縦方向チャネルを持つ相互連結した格子構造を特徴としています。表面はラメラー3Dチタン技術を用いて3〜5μmの微細表面粗さを得ており、直接的な骨成長を促進しています。

麻酔と外科的手技

不必要な代謝ストレスを避けるために術前断食は行われませんでした。麻酔は、メデトミジン(0.15 mg/kg)、ミダゾラム(2 mg/kg)、ブトルファノール(2.5 mg/kg)からなる三重麻酔混合物によって誘導され、25ゲージの針²³を用いて皮下注射で背中に投与されました。足踏筋の撤退反射(足の指をつまむ)の喪失を確認し、ピンク色の粘膜を維持し、呼吸数(70〜110回/分)を監視することで、15分ごとに十分な外科的麻酔面を評価しました。その後、尾椎の体間固定術の外科手術が行われました。動物は伏せ姿勢(図2A)に置かれ、尾全体を消毒しました。3回交互のスクラブ(エタノール70%、ヨウ素ホイ素スクラブ、70%エタノール)を行い、無菌フィールドを確保しました。標的椎骨を特定するために、仙骨から遠位から手触診が行われました。最初の可動継ぎは仙骨-Co1接合部と特定され、直近のセグメントはCo2と呼ばれ、Co2–Co3のターゲット部位を定義しました。背側側面に約2cmの縦切開(Co2–Co3)(図2B)を開け、各椎骨の後部を露出させました。曝露中は背側尾静脈の特定と損傷の回避に注意を払いました。鈍的解離と双極性電気焼灼が軽度出血の管理に用いられました。融合部位の準備のために、Co2とCo3椎骨の間の線維環をメスで切開しました(図2C)。線維環と髄核はキュレットと小型鉗子を用いてキュレットで慎重に除去されました(図2D)。このステップは高倍率外科的拡大鏡(≥3.5倍)で実施されました。除去の完全性は、点状出血(「出血したエンドプレート」の兆候)の視覚的確認と残留軟部組織の全無によって客観的に定義されました。許容できないエンドプレート損傷は、総面積の>25%に及ぶ深い侵食、またはカンパス骨への0.5mm>貫通と定義されました。その後、チタン製ケージ(断面積2 × 2 mm、高さ2 mm)(図2E)が椎間隙の深くに挿入され、物理的な停止点に達し、両エンドプレートとの完全な接触が視覚的に確認され、しっかりとした干渉フィットが形成されました(図2F、2G)。

固定と創傷の閉鎖

板の固定を容易にするために、Co2およびCo3椎骨の指定された穴の周囲の骨面は、2.0mmの球形ファイルタイプバリを備えた電動ハンドヘルドルーター(7,800 RPMで動作)で平らにしました(図2H)。骨穴は、プラスチック製の内部固定板のネジ穴に対応する間隔で、直径1.2mmのドリルビットを備えた手ドリルで個別に開けられました(図2I)。その後、2本の6mmステンレス製ネジがあらかじめ穴に取り付けられました。プラスチックプレートの図2J。ネジは90°の角度で標準的な深さ5mm、中心間12mmの間隔で挿入されました(図2K)。最後に皮膚切開部は4-0ナイロン縫合糸で閉じられ、尾部は再び70%エタノールで消毒されて処置を完了しました。

術後管理と安楽死

即時の回復期(0日目)では、動物は15分ごとにモニタリングされ、完全な胸骨横たわりと目的的な歩行が得られるまで直腸温度が維持されました。長期評価(第1〜12週)には、体況スコア(BCS)、グルーミング状況、一般的な活動に基づく日次スコアリングシステムと、感染や裂孔の有無を毎日の手術部位モニタリングが実施されました。最初の48時間はケージの床で湿った食事が提供されました。体重は週に一度測定されました。早期安楽死の人道的評価項目は厳密に以下の通りでした:体重減少≥20%、BCS ≤2.0、12時間に食>水に到達できない持続性、激しい痛み・呼吸困難の兆候、または重度の手術部位合併症(例:壊死)。これらの基準を満たす動物は24時間以内に人道的に安楽死されました。術後ケアには、術直後および術後24時間に感染予防のためにセファレキシン(15 mg/kg)を筋肉内投与が含まれていました。鎮痛剤としては、カルプロフェン(2 mg/kg)を手術直後皮下投与、術後12時間、24時間、48時間に合計4回投与しました。着床から12週目に、イソフルラン過剰投与により安楽死処分されました。第2尾椎から第3尾椎のセグメントは一 括 で採取され、70%エタノールで固定されました。

トレーニングの推奨事項、トラブルシューティング、サンプルサイズ。この厳しいプロトコルの採用を円滑に進めるために、新しいオペレーターはラットの死体に対して3〜5回の練習手技を行い、3回連続の配置でX線写真の誤位が見られない場合に熟練度を達成しなければなりません。一般的なトラブルシューティングには、ケージのサイズ選択を最適化するためにX線で椎間板の高さを事前に測定したり、ケージの移動を防ぐために背側の骨の平坦度を再確認したりすることが挙げられます。スクリュー購入が不十分な場合は、ドリル速度を低くすることを推奨します。今後の検証研究では、十分な統計的検出力を得るために、グループあたり最低サンプル数n=6から10(離脱時にはさらに10〜20%)が推奨されます。さらに、今後の研究では対照群(例:空ケージや自己移植)を取り入れ、バイオマテリアルの性能を検証する必要があります。

放射線学および組織学的解析

マイクロコンピュータ断層撮影(CT)スキャンおよびデジタルX線撮影は、管電圧80 kV、電流0.1 mAのマイクロCTスキャンシステムを用いて実施されました。取得時には、チタンインプラントによるビーム硬化アーチファクトを最小限に抑えるため、厚さ1.0mmのアルミニウムフィルターが使用されました。縦断評価については、術後1週および4週間に120μmのボクセルサイズを用いた生体内画像検査を実施しました。術後12週に24mmの検体ホルダーと24μmのボクセルサイズを用いてエクス ビブ 画像検査を実施しました。CTデータと放射線画像は標準的なフィルタ付きバックプロジェクションアルゴリズムで再構築され、DICOMビューアで解析されました。骨結合を評価するために定量的基準が定義されました。放射線学的には、少なくとも3回連続した切面にわたりマイクロCTで頭蓋末板と尾椎末板をつなぐ連続した小梁構造が観察され、融合が成功したことが確認されました。画像セグメンテーションの際には、グローバルに700ハウンズフィールドユニット(HU)の閾値が適用されました。組織形態計測学的には、ケージ内でBV/TV比率が70%以上であれば、物理的空間的充足と融合の閾値と考えられていました。組織学的には、骨の結合は線維組織の間を除き、頭蓋側から尾側への完全な骨橋によって定義されました。組織学的解析のために、安楽死の2日前にカルセイン(8 mg/kg)を皮下注射して連続フルオロクロム標識を施し、最終12週時点における活性炭化の空間分布を特定しました。切除された尾椎は70%エタノールに7日間固定され、ビジャヌエバ骨染色で 一括 り染色されました。標本はエタノールの上昇グレードで脱水され、メチルメタクリレート樹脂に埋め込まれ、ダイヤモンドソーミクロトームを用いたマイクロCT誘導の事前断片によりケージの正確な幾何学的中心で矢状切片を行った。未脱鈣の地面標本(厚さ5μm)は、伊藤骨組織形態測定研究所(新潟、日本)で製作されました。画像は明視野顕微鏡と蛍光合体のための共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて取得されました。さらに偏光顕微鏡下での検査と、コンピュータ画像解析装置を用いた組織形態測定解析が行われました。関心領域(ROI)は金属ストラットを除くケージの総内部体積と定義され、頭蓋内ROIと尾側のケージ内ROIに細分化されました。骨組織はビジャヌエバ染色の下で紫/マゼンタ色で識別されました。ラメラー骨(Lm.V)は偏光光の下で高度に組織化された平行なラメラー構造が特徴で、一方で編成骨(Wo.V)は不規則な繊維パターンを示しました。

結果

体重(表1)

術後12週まで体重を測定し、221.8gから346.8gへと着実に増加し、生理的恒常性を示し、重度の慢性的苦痛の消失を間接的に支持しました。これは、日常のマルチモーダル評価によって正常な活動と合併症のない創傷治癒が確認されたことで裏付けられました。

傷(図3)

創傷治癒は術後4週間で達成されました。自然な縫合糸の押し出しが起こり、術後の経過は特に問題なく、12週間にわたり感染の兆候は認められませんでした。

マイクロCTおよびデジタルX線撮影

マイクロCTを用いた逐次放射線評価により、術後1〜12週間の間にケージの緩みや移動は認められませんでした(

ディスカッション

ここで、ラット尾棘の新しい体間融合モデルが確立されました。このモデルは、後方アプローチでチタンケージを挿入し、プレートとスクリュー固定を補助します。その後、ケージ内の骨形成を詳細な組織形態測定解析を用いて評価しました。このモデルの特徴は三つあります。1) 臨床的な後方腰椎間固定術や経椎間孔の腰椎間固定術を非常によく模倣し、体間ケージと後方器具を組み合わせることで、2) 尾椎を解剖学的にアクセス可能な部位として利用し、手術技術と動物福祉の標準化を確保しています。そして最も重要なのは、3) 未脱鈣断片を用いて、対象領域全体、ケージ内部を含む全域の体系的な組織形態測定と偏光顕微鏡検査を可能にすることです。したがって、このモデルは従来のラットモデルでは測定が困難だった「ケージ内骨量」と「骨成熟度」を評価し、インターボディケージ材料や骨代替品の前臨床評価に適したプラットフォームとして機能します。骨量の増加、ラメラ骨比の増加、そして頭蓋領域における蛍光標識の低下の組み合わせは、骨形成がほぼ完了し成熟期に入ったことを示しており、尾部の所見は新たな骨形成が進行中であることを示しました。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-0 ナイロン縫合糸	夏目製作所	ER-25-30N2
明視野顕微鏡	キーエンス (大阪, 日本)	BZ-X800
ブトルファノール	富士フイルム	021-19001
カルセイン	富士フイルム	76082
カルプロフェン	富士フイルム	037-19761
セファレキシン	富士フイルム	036-11051
コンピュータ画像分析システム	システムサプライ (長野, 日本)	Histometry RT CSS-840
蛍光重合用共焦点レーザー走査型顕微鏡	カール・ツァイス (イェーナ, ドイツ)	LSM 980
キュレット	夏目製作所	E-8-00
ダイヤモンドソーマイクロトーム	ライカ (ウェッツラー, ドイツ)	SP1600
電動ドリル	タミヤ	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A9% E3%83%95%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%8B% E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%BC%E3% 82%BA-%E3%83%8A%E3% 83%8B-42-%E9%9B %BB%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3 %83%87%E3%82%A3% E3%83%AB%E3%83%A5 %E3%83%BC%E3%82% BF%E3%83%BC-%E3% 83%91%E3%83%A9%E3 %83%A2%E3%83%87%E3 %83%AB%E7%94%A8%E5 %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%BF%E3%83%9F%E3 %83%A4+%E9%9B%BB%E5% 8B%95%E3%83%8F%E3%83% B3%E3%83%87%E3%82%A3% E3%83%89%E3%83% 83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
ハンドドリル	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
メデトミジン	富士フイルム	135-17473
ミダゾラム	富士フイルム	135-13791
ピンバイス	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%E3%83%8D%E3%83%83%E3% 82%AF%E3%8