発熱および咳の研究におけるドン医薬品のコンピュータ支援有効成分スクリーニングと検証

サマリー

ここでは、ネットワーク薬理学スクリーニング、分子ドッキング、LPS誘導マウスモデル検証を統合した「成分-標的-経路-疾患」の多次元ネットワークを構築しました。明確な主要パラメータを確立することで、同族の民族医学である冷玉小唐の有効成分の効率的な同定と、再現可能なプロセスの検証を可能にします。

要約

董族の民族医薬品冷玉小唐(LYXT; 発熱や咳の治療のために、セミ・ファルビティディス、 Verbena officinalis L.、 Zingiber officinale Roscoe)を用いて、ネットワーク薬理学予測と実験検証を統合した方法論プロセスを確立しました。まず、伝統中国医学システム薬理学データベースおよび分析プラットフォーム(TCMSP)を用いて、経口バイオアラビリティ(OB)≥30%、薬剤類似度(DL)≥0.18の基準を用いて、LYXTの主要な活性成分をスクリーニングし、発熱および咳の関連標的を複数の疾患データベースから収集しました。その後、「成分-標的-疾患」相互作用ネットワークを構築し、トポロジカル解析および遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路の濃縮を通じて、コアな作用標的(CYP3A4、POR)および主要なシグナル伝達経路(MAPK経路)が同定されました。分子ドッキング技術を用いて、主要成分とコアターゲットの結合能力を検証しました。最後に、リポ多糖(LPS)を鼻腔内滴入することで慢性気管支炎マウスモデルが確立され、予測された主要活性成分の 生体内 抗炎症効果が検証されました。結果は、ネットワーク薬理学でスクリーニングされたβ-カロテンやサパレノールなどの成分が動物実験で抗炎症効果の度合いにばらつきを示し、そのメカニズムがMAPK/p38シグナル伝達経路の阻害を伴う可能性があることを示しました。このスキームは、伝統的な民族医薬品における有効成分のスクリーニングおよびメカニズム研究における再現可能な例を提供します。

概要

董医は、伝統中国医学(TCM)の枠組み内にある民族医療体系であり、貴州、湖南、広西の董族によって実践されています。それは世代を超えて積み上げられた累積的な経験的知識を表しています。このシステムは漢方療法、鍼治療、骨の整復、マッサージ、食事療法、そして精神的な実践を統合しています。その特徴は、歴史的な地理的孤立と口承伝統に由来し、地域の環境や文化的信念に適応した独自の実践に基づく薬局供を育みました。

持続的な発熱は、体が体温をコントロールできなくなった状態であり、身体の機能障害の兆候であり、^{人間の細胞における}自己防衛の重要な機能です。ドン民族の温熱薬の治療法は多様です。その中でも、発熱は内熱と外熱に分類されます。内部熱は内部疾患によって引き起こされる熱を指し、外部熱は風邪や外傷によって発生する熱を指します^。外因性発熱は通常消化器機能に影響を及ぼします^。ドンの国民医は熱の治療に冷熱療法を用いています。さまざまなドン薬の処方の中で、冷玉小唐(LYXT)は発熱や痛み止めに使われる標準的な煎じ薬で、セミンファルビティディス、 ベルベナ・オフィシナリス L.、 ジンギバーオフィシナレ ・ロスコーを含み、常に叩き^、水と混ぜて作られます。主に風邪による発熱や頭痛に使われます。

しかし、LYXTの活性成分およびその基礎となる分子メカニズムは依然として十分に解明されていません。このギャップを埋めるために、本研究ではネットワーク薬理学的アプローチを用いて潜在的な有効成分と標的を予測しました。これらの予測を検証するために、発熱や咳に関連する主要な炎症反応(白血球浸潤や炎症性サイトカイン産生を含む)を模倣する、確立されたリポ多糖(LPS)誘導のマウスモデルが選ばれました。

創薬の過程で、さまざまな研究により、化合物が複数のタンパク質標的と相互作用できることが明らかになっています。したがって、「一つの薬、一つの生物学的標的」パラダイムはシステム性薬理学のパラダイムへとシフトしています。ウイルスや細菌の複数の生物学的標的タンパク質と相互作用する化合物は有用な薬^理学的効果をもたらす可能性があります。ネットワーク薬理学解析は、高額で長期化する創薬プロセスを軽減する実現可能かつ強力な方法です。薬剤間の相互作用をよりよく理解し、病気の原因メカニズムを予測し、副作用のない薬理学的効果を意図した代替薬剤の提案、そして伝統医療の生体活性の予測に役立ちます。化学情報学的アプローチ、分子ドッキング、データ由来モデルがバイオアクティビティの予測やメカニズム解析に成功裏に応用されています。これらの手法は臨床的な可能性を持つ抗ウイルスおよび抗菌化合物の迅速な発見を促進し、また薬剤の有効性や副作用の説明にも用い^{られています。}例えば、イマチニブメシル酸は小分子で、慢性骨髄性白血病の原因である融合タンパク質Bcr-Ablの阻害剤ですが、Abl、Kit、PDGFR⁷など複数のチロシンキナーゼの活性も阻害します。したがって、薬剤とその標的を特定する研究は、病気の治療に不可欠であり、薬物化合物が分子レベルで病気治療にどのように作用するかを理解するのに役立ちます。計算モデリングやネットワーク解析の手法は、潜在的な薬剤や標的を正確にスクリーニングでき、乗法的相互作用解析は実験検証のための理論的基盤と実践的な指針を提供します。本論文では、相互作用遺伝子/タンパク質の検索ツール(STRING)、注釈・可視化・統合発見用データベース(DAVID)およびその他のデータベースを活用し、動的遺伝子オントロジー(GO)解析および経路解析を組み合わせて、発熱および咳に対するDong medicine LYXTの有効成分および関連作用タンパク質に関するデータを収集し、有効成分の併用治療メカニズムを探りました。 これにより、ドン医薬品LYXTのさらなる研究に特化した理論的参考となり、民族医薬品処方の薬理学的メカニズムを探る再現可能な戦略を提供し、新たな抗炎症薬の開発に関する洞察も提供します。

プロトコル

動物実験プログラムは蘭州大学実験動物倫理委員会(D2024-292)によって審査されています。動物保護、動物福祉、倫理の原則および国家実験動物福祉倫理の関連規定に準拠しています。

1. データベースとソフトウェアの準備

1. 有効成分スクリーニングとターゲット遺伝子収集
   1. TCMシステム薬理学データベースおよび分析プラットフォーム(TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)にアクセスし、LYXT製剤内の各ハーブのラテン語名(Semen Pharbitidis、 Verbena officinalis L.、 Zingiber officinale Roscoe)をキーワードとして別々に検索し、それぞれのハーブに関連するすべての化合物を取得します。
   2. 各ハーブごとに採取した化合物をフィルターするスクリーニング基準を適用します: Verbena officinalis L.の場合、経口バイオアバリアビリティ(OB)≥30.1%、薬剤類似性(DL)≥0.12; ジンギバー・オフィシナーレ のロスコーは、セットOB≥60%、DL≥0.13;セミン・ファルビティディスの場合、産≥16.93%、DL≥0.50に設定されました。その後、3種類のハーブからフィルターされた化合物リストを統合し、TCMSP固有の識別子に基づいて重複項目を削除して、LYXTの最終的な有効化合物リストを作成します。
   3. TCMSPデータベースからこれらの有効化合物に関連するすべてのターゲットタンパク質を、化合物識別子とターゲットタンパク質名を含むテーブルとしてエクスポートし、このターゲットタンパク質リストをUniProtデータベース(https://www.uniprot.org/)にインポートします。
   4. UniProtKBのIDマッピングツールを使用して、すべてのターゲットタンパク質名を公式のヒト遺伝子シンボルに変換し、マッピング方向をタンパク質名から遺伝子名に設定し、有効な遺伝子シンボルを欠くエントリを削除して、LYXT活性成分に関連する最終的なターゲット遺伝子リストを作成します。
2. 疾患標的遺伝子収集と重複解析
   1. GeneCardsデータベース(www.genecards.org)から「fever」と「cough」というキーワードで別々に検索することで、発熱および咳に関連する遺伝子をダウンロードし、関連≥スコア5の遺伝子を保持し、両方の検索結果をデータベース内で統合します。
   2. 治療対象データベース(TTD)(db.idrblab.net/ttd)から「fever」と「cough」というキーワードで別々に検索して発熱および咳関連遺伝子をダウンロードし、関連するすべての標的遺伝子をダウンロードし、両検索結果をデータベース内で統合します。
   3. PharmGkbデータベース(www.pharmgkb.org)から「fever」と「cough」というキーワードで別々に検索して発熱および咳関連遺伝子をダウンロードし、関連するすべての遺伝子をダウンロードし、両方の検索結果をデータベース内で統合します。
   4. 「熱」と「cough」というキーワードで別々に検索することで、オンラインメンデル遺伝(OMIM)データベース(www.omim.org)から発熱および咳関連遺伝子をダウンロードし、関連するすべての遺伝子をダウンロードし、両方の検索結果をデータベース内で統合します。
   5. DrugBankデータベース^{(go.drugbank.com)} 8から「fever」と「cough」というキーワードで別々に検索して発熱・咳関連遺伝子をダウンロードし、関連するすべての遺伝子をダウンロードし、両方の検索結果をデータベース内で統合します。
   6. 5つのデータベースから取得した遺伝子リストを統合し、重複する遺伝子シンボルを除去して、発熱や咳に関連する疾患標的遺伝子の最終リストを作成します。
   7. ステップ1.2.6の疾患標的リストとステップ1.1.4のLYXT活性成分標的遺伝子リストを比較し、両リストに共通する重複遺伝子を選択し、この重複する遺伝子リストをCSVファイルとしてエクスポートします。
3. ID変換と断面解析
   1. ステップ1.2.7の重複遺伝子リストをR環境に読み込み、DAVIDのウェブサイト(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)にアクセスします。
   2. 重複する遺伝子リストをDAVIDにアップロードし、種を ホモ・サピエンス 、リストタイプを遺伝子シンボルに設定し、機能注釈ツールを実行して断面解析を行います。
   3. DAVID内の遺伝子ID変換関数を用いて、交差するタンパク質のシンボルIDをアンサンブルIDに変換し、遺伝子シンボルからアンサンブルIDへの変換方向を設定します。
   4. 変換されたアンサンブルIDリストと元の遺伝子シンボルをCSVファイルとしてエクスポートし、下流の濃縮解析用にします。

2. 重要な有効成分および標的タンパク質のスクリーニング

1. 化合物-標的ネットワークの構築
   1. ステップ1.2.7の交差遺伝子リストとステップ1.1.4のLYXT活性成分ターゲット遺伝子リストをR環境に読み込み、比較解析を行い、標的遺伝子と交差遺伝子の両方に関連する化合物を特定します。
   2. 化合物と標的の関係データをCytoscapeバージョン3.8.1に取り込み、「LYXT-Feverおよび咳標的」ネットワーク図を作成して、有効成分とその関連標的間の相互作用を可視化します。
2. タンパク質間相互作用データ取得
   1. LYXT有効成分ターゲットと発熱・咳ターゲットの交差点の遺伝子IDファイルを https://stringdb.org/ のSTRINGデータベースにインポートし、種としてホ モ・サピエンス 、データ処理方法として複数のタンパク質を選択します。
   2. 信頼度閾値を≥0.90に設定し、相関が非常に低いタンパク質を分離してタンパク質間相互作用をフィルタリングし、その後、フィルタリングされた相互作用データを含むTSVファイルを生成して後流解析を行います。
3. 交差解析確認
   1. R言語を用いて、有効成分の標的タンパク質と発熱・咳の標的タンパク質の交差を解析し、ステップ1.2.7で特定された重複遺伝子セットを確認します。
   2. この確認された重なり遺伝子セットを、後のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析のために準備します。

3. 主要標的タンパク質のスクリーニング

1. PPIネットワーク可視化
   1. ステップ2.2.2のフィルタリングデータをCytoscapeバージョン3.8.1にインポートし、ネットワーク可視化ツールを使ってPPIネットワーク図を描画します。
   2. Cytoscape内でCytoNCAプラグインをインストールして開き、このプラグインを使ってネットワーク内の各ノードごとに次のパラメータを計算してトポロジカル解析を行います:次数中心性(DC)、ビトゥウィーンネス中心性(BC)、近接中心性(CC)、固有ベクトル中心性(EC)、ネットワーク中心性(NC)、局所平均連結性(LAC)。
2. 中央値基準スクリーニングを用いた主要標的タンパク質の同定
   1. CytoNCAから計算されたトポロジカルパラメータテーブルを、すべてのノード識別子と対応するDC、BC、CC、EC、NC、LACの値を含むCSVファイルとしてエクスポートします。
   2. ネットワーク内のすべてのノードで次数中心性(DC)の中央値を計算し、DCが中央値の2倍を超えるすべてのノードを特定します。
   3. ネットワーク内のすべてのノードで近接中心性(CC)および中間中心性(BC)の中央値を計算し、ステップ3.2.2で特定されたノードから、中央値より大きいCCと中央値を超えるBCを満たすノードのみを保持^{します。これは}Kibbleら9によるスクリーニング手法に従います。
3. 最終的なキーターゲットコンパイル
   1. ステップ3.2.3の保持ノードの識別子を主要なターゲットタンパク質のリストにまとめ、このリストをCSVファイルとしてエクスポートします。
   2. この中央値ベースのスクリーニングルール(DCが中央値の2倍以上、CCが中央値より、BCが中央値より大きい)を、論文全体で主要なターゲット識別の唯一の基準として適用し、プロトコルで確立された統一スクリーニングアプローチとの整合性を確保します。

4. GO濃縮解析およびKEGG経路解析

1. DAVIDデータベースを用いた機能豊化解析
   1. Tanabeらの方法^{に従い、ステップ}1.3.4の交差遺伝子リストを遺伝子記号形式で https://david.ncifcrf.gov/ にDAVIDデータベースにアップロードし、種を Homo sapiens、リストタイプを遺伝子記号に設定します。
   2. 生物過程には GOTERM_BP_DIRECT 、細胞成分には GOTERM_CC_DIRECT 、分子機能には GOTERM_MF_DIRECT を選択し、 KEGG_PATHWAYを選択してKEGG経路濃縮解析を行う。
   3. 有意閾値をp < 0.05に設定し、ベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率(FDR)補正を複数検査に適用し、用語名、遺伝子数、p値、FDR調整p値および関連遺伝子を含むCSVファイルとしてエンリッチメント結果をダウンロードします。
2. OmicShareクラウドプラットフォームを用いたバブルチャート生成
   1. ステップ4.1.3のGO濃縮結果を https://www.omicshare.com/tools のOmicShareクラウドプラットフォームにインポートし、GO濃縮バブルチャートツールを選択してください。
   2. 用語名、遺伝子数、p値を含む結果ファイルをアップロードし、ツールをツールでp値が最も低い上位20語を表示するように設定します。
   3. x軸を濃縮比、y軸をGO用語、バブルサイズを遺伝子数、バブルカラーをp値に設定します。
   4. バブルチャートを作成し、高解像度の画像ファイルとしてダウンロードしてください。
3. KEGGマッパーを用いたKEGG経路の可視化
   1. KEGG経路の濃縮結果をp値で昇順に並べ替え、p値が最も小さい上位20の経路を選択します。
   2. 選択した各経路について、https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html のKEGGデータベースにアクセスして経路図を取得してください。
   3. 各経路に存在する交差遺伝子リストから標的タンパク質を特定し、濃縮結果の経路遺伝子セットと照合します。
   4. https://www.kegg.jp/kegg/mapper/ でKEGGマッパーツールにアクセスし、 カラーパス機能 を選択し、交差する遺伝子記号のリストとKEGG経路識別子を入力し、標的タンパク質を赤でハイライトした色分けされた経路図を作成してください。
   5. GOの3カテゴリの濃縮CSVファイル、KEGG経路濃縮CSVファイル、バブルチャート画像、上位20経路の色分け経路図を含むすべての濃縮解析出力をまとめ、これらのファイルをエクスポートして後続解析に用いてください。

5. 分子ドッキング検証

1. https://www.rcsb.org/ 年にRCSB PDBデータベースから、ネットワーク解析の主要ターゲットとして特定された重要タンパク質の3D構造をダウンロードし、ホ モ・サピエン スから共結晶化リガンドを含む解像度≤2.5 Åの構造を選択して活性部位を定義し、活性化合物(ベータカロテンを含む)の構造データファイルをダウンロードしてください。 スパツレノールおよびベータシトステロール)は、PubChemデータベースのSDF形式から抽出されています。
2. AutoDockToolsを使って水分子と共結晶リガンドを除去し、極性水素を加え、ガスタイガー電荷を割り当ててタンパク質構造を準備し、準備済みタンパク質をPDBQT形式で保存し、 Open Babelで化合物SDFファイルをPDB形式に変換し、AutoDockToolsで各配位体の回転可能な結合を検出し、配位子をPDBQT形式で保存します。
3. 共結晶リガンドの結合部位座標を中心に、60 × 60 × 60 Åの寸法を持つドッキンググリッドボックスを定義し、AutoDock Vinaを用いて 抽出度 を8、 num_modes を10に設定して分子ドッキングを行い、各リガンド-タンパク質ペアごとに10の結合ポーズを生成します。
4. 得られたドッキングファイルと対応するターゲットファイルをPyMOLにインポートし、最も低い結合エネルギー(最も負の値)のドッキングモデルを代表的なポーズとして特定・保存します。
5. その後、このモデルを https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ 年にPLIPデータベースに提出し、水素結合、疎水性相互作用、π積層、塩橋などの小分子とタンパク質間の相互作用を解析します。
6. LYXT内のすべての有効成分の結合エネルギーを、発熱や咳に関連する標的タンパク質に対して計算・まとめ、その後、化合物名、標的タンパク質、結合エネルギー(kcal/mol)、主要な相互作用タイプを含む要約表を作成し、結果セクションで提示します。
   注:ネットワーク薬理学解析に使用されるRスクリプトは 補足ファイル1で入手可能です。

6. 動物実験

1. 実験的タイムライン
   1. 動物を1週間慣らし、0日目にLPSまたは生理食塩水投与を行い、7日目から20日目まで2週間毎日薬物治療を行い、21日目にサンプル採取を伴う安楽死を行います。
2. 動物の獲得とグループ化
   1. 体重25±±4gの成体オスのC57BLマウス60匹を購入し、1週間給餌した後、ランダムに生理食塩水グループ(6匹)とLPS損傷グループ(54匹)に分けます。
   2. 治療開始7日前には、LPS損傷群をさらに6匹のマウスを含む7つのサブグループにランダムに分割します:モデル群、陽性群(デキサメタゾン、50 mg·kg·¹·^d-1)、LYXT治療群(200 mg·^kg-1·^d-1)、ベータカロテン群(50 mg·^kg-1·^d-1)、スパツレノール群(50 mg·^kg-1·^d-1)、 およびベータシトステロール群(50 mg·^kg-1·^d-1)です。
      注:治療投与およびアウトカム評価は盲検化されました。
3. LPS誘発肺炎症モデル
   1. 麻酔用に腹腔内注射で2%のペントバルビタールナトリウムを60 mg/kgの用量で投与します。尾をつまむ反応がないことで、麻酔の深さが中程度であることを確認しましょう。最後に、記録された体重に基づき、10 mg/mL濃度で必要なLPS注射量を計算します。
   2. 鼻投与の準備として、正確に計算されたLPS溶液をピペットに取り込みます。右手で尾の付け根を掴み、左手の親指と人差し指で耳のあたりを優しく固定してしっかりと固定します。
   3. 液体をゆっくりと排出し、ピペット先端に約2μLの小さな滴が形成されるまで続けます。滴をネズミの右鼻孔に慎重に近づけ、接触させます。すぐに左手を素早く30〜40cm持ち上げ、そっと左手とマウスを元の位置に戻します。
      注意:マウスの鼻孔に注意を払うと、上向きの状態を維持する必要があります。
   4. 同じ方法で、マウスの左鼻孔に小さな液体の滴を注入し、液体注入が完了するまで左右の鼻孔に順番に加えます。
   5. その後、マウスを離し、テープでマウスボードに固定し、腹部を上げて頭を上げた状態で4時間以上その姿勢を保ちます。ネズミが目を覚ました後、Lorenzらが説明した方法に従って観察のためにケージに戻します。¹¹。
4. 気管支肺胞洗浄液採取
   1. LPS損傷群マウスを無作為に7つのグループに分けました:陰性対照群、モデル群、陽性群(デキサメタゾン50 ^mg.kg-1.d-1)、LYXT治療群(200匹 ^mg.kg-1.d-1)、ベータカロテン群(50匹 ^mg.kg-1.d-1)、スパツレノール群(50 mg.kg-1.d-1)、ベータ-シトステロール群(50 mg.kg-1.d-1)、各群に6匹ずつ。
      注意:LYXTの準備は以下の通りです:Pharbitis nil (L.) Choisy、Verbena officinalis L.、Zingiber officinale Roscoe 粉末を質量比5:3:2で混ぜます。 粉末を水と1:30(g/mL)で混ぜ、80°Cで2時間リフラックスします。溶液をろ過して濃縮(30°C、0.01〜0.08 MPa)し、水に溶かして2 g/mLの溶液を準備します。ベータカロテン、ベータシトステロール、スパチュレノールが実験的検証の基準として用いられました。LPS治療後1週間から各グループに1日1回、2週間投与します。Jinらによると、チオペンタール(100 mg/kg)の過剰投与で動物を安楽死させると^{述べています。}
   2. No.23カニューレで心室挿管。次に、25 cm H₂Oの圧力で肺組織に10 mLのPBSをゆっくり注射し、この洗浄を約6回繰り返して、Pinheiroらが述べた方法に従い気管支肺泡洗浄液(BALF^)を得ます。
5. BALFおよび血清における白血球およびサイトカイン解析
   1. 集めたBALFを500× g で4°Cで10分間遠心分離します。 細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸浮させ、トリパンブルーで1:10で希釈し、400×倍率の光学顕微鏡下でヘモサイトメーターで総白血球を数えます。
   2. 心臓穿刺からBALF上清液と血清サンプルを採取してください。
   3. 製造元の指示に従い、市販のELISAキットを用いてTNF-α、IL-1β、IL-18の濃度を測定し、マイクロプレートリーダーで450 nmでの吸収を読み取り、標準曲線から濃度を計算します。BCAアッセイを用いてBALF中のタンパク質濃度を測定します。
6. HEおよびWB分析による能動成分の検証
   1. LYXTの有効性に寄与する有効成分を特定するために、6.3節の後にLPS誘発性肺炎症モデルを再構築します。
   2. 60匹のマウスを購入し、1週間慣れさせ、ランダムに5つのグループ(n=12)に分けます:モデル群、LYXT群(200mg·^kg-1·^d-1)、ベータカロテン群(50mg·kg-1·^d-1)、スパツレノール群(50mg·^kg-1·^d-1)、および組み合わせ群(各25mg·^kg-1·^d-1)。
   3. LPSは0日目に実施し、7日目から20日目まではステップ6.3で説明されています。21日目に肺組織¹⁴を採取します。
7. 組織学的解析
   1. 左肺上葉を4%のパラホルムアルデヒドに24時間固定し、パラフィンに埋め込み、5μmの断片を切断し、ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色を行います。
   2. 200×および400×倍率の光学顕微鏡下で切片を調べ、炎症性細胞浸潤と肺泡壁の肥厚を評価します。代表的な画像を撮影しましょう。
8. ウェスタンブロット解析
   1. 放射免疫沈殿アッセイ(RIPA)バッファーでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を用いた肺組織の均質化。12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。
   2. 1ウェルあたり30μgのタンパク質をナトリウムドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルに施し、ポリフッビニリデン(PVDF)膜に移し、5%無脂肪ミルクでブロッキングします。
   3. p-p38、p38、TNF-α、IL-1β、IL-18、β-アクチンに対する一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし、その後HRP結合二次抗体で培養します。
      注:抗体の希釈は 材料表に記載されています。
   4. ECL基板を用いてバンドを可視化し、画像をキャプチャし、ImageJで強度を定量化します。標的タンパク質の発現をβアクチンまたは全p38に正規化します。

結果

TCMSPデータベースは409種類の有効成分を収集するために使用されました。そのうち、58成分はVerbena officinalis L.、86成分はセミュ・ファルビティディス(Semen Pharbitidis)、265成分は Zingiber officinale Roscoeから採取されました。指数に基づく26の主要有効成分がスクリーニングされ、 Verbena officinalis L.はOB≥30.1%、≥DLは0.12、O≥Bは60%、DLは Zingiber officinale Roscoe≥≥0.13、OB16.93%、DL≥0.50、表1。

LYXTの有効成分の交差解析から27個の相互作用タンパク質が得られました。発熱や咳に関連するタンパク質はStringデータベースからインポートされ、タンパク質相互作用図が得られました(図1)...

ディスカッション

本論文では、発熱や咳に使われる伝統的なドン薬の煎じ液であるLYXTの有効成分26種類と潜在的な標的207点を成功裏に特定しました。主な発見には、ネットワークトポロジー解析によるCYP3A4の重要標的タンパク質の同定、LPS誘発肺炎症モデルにおけるLYXT、ベータカロテン、スパツレノールの有効化合物としての実験的検証が含まれます。これらの発見は、ネットワーク薬理学(データベーススクリーニング、PPIネットワーク解析、分子ドッキング)とin vivo 実験的検証(BALF白血球計数、サイトカイン測定、組織学、ウェスタンブロット)を統合したアプローチによって達成されました。

まず、中国漢方薬の独自のシステム薬理学プラットフォームであるTCMSPは、疾患、薬剤、標的間の関係を捉えています。本研究では、TCMSPプラットフォームを用いて発熱や咳の重要な成分を探索し、分子ドッキングを実施して有効成分および標的の結合親和性を評価しました。本研究では、以下のスクリーニング基準を適用してLYXTの主要有効成分26点...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンチIL-18	プロテインテック、武漢、中国	27095-1-AP	ウサギ多クローナル、1:500
抗IL-1&β;	プロテインテック、武漢、中国	66737-1-Ig	マウスモノクローナル、1:500
アンチp38	プロテインテック、武漢、中国	14064-1-AP	ウサギ多クローナル、1:1000
アンチp-p38	プロテインテック、武漢、中国	28796-1-AP	ウサギ多クローナル、1:1000
抗TNF-&α;	プロテインテック、武漢、中国	80258-6-RR	ウサギモノクローナル、1:500
抗βアクチン	プロテインテック、武漢、中国	66009-1-IG	マウスモノクローナル、1:2000
オートドック・ヴィナ	https://vina.scripps.edu/	バージョン 1.5.6	分子ドッキングソフトウェア
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	バージョン 1.5.6	分子ドッキング準備ツール
BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム、アメリカ合衆国	23225	タンパク質濃度測定のために
ベータカロテン	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	83-46-5	高純度標準、>95%
ベータシトステロール	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	83-46-5	高純度標準、>95%
C57BL/6マウス	蘭州大学医療動物センター 	-	成年男性、25歳以上;4 g
サイトスケープ	https://cytoscape.org/	バージョン 3.8.1	ネットワーク可視化および解析ソフトウェア
デキサメタゾン	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	D4902	ポジティブコントロール
ECL基板	ミリポーアシグマ、マサチューセッツ州バーリントン、アメリカ合衆国	WBKLS0500	ウェスタンブロット検出用
ELISAキット
GraphPad プリズム	https://www.graphpad.com/	バージョン8.0以降	統計解析およびグラフ作成ソフトウェア
ヘマトキシリンと嗜酸(H&E) 染色キット	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社、北京、中国	G1120	肺組織染色のために
組織学
HRP共役アンチマウス	プロテインテック、武漢、中国	SA00001-7G	二次抗体、1:5000
HRP結合アンチラビット	プロテインテック、武漢、中国	SA00001-7H	二次抗体、1:5000
IL-18 ELISAキット	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社、北京、中国	SEKH-0016	BALF中のIL-18と血清の測定のために
IL-1とベータ;ELISAキット	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社、北京、中国	SEKM-0004	IL-1とベータの測定には、BALFと血清において
イメージJ	https://imagej.nih.gov/ij/	バージョン 1.53	画像解析ソフトウェア
リポポリサカリド(LPS)	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	L2630	From 大腸菌およびnbsp;O111:B4
LYXT原材料	淮華大学	-	粉末混合物は...ファルビティスはnil (L.)チョイジー、ヴァーベナ・オフィシナリス L., and ジンギバー・オフィシナレ ロスコー(5:3:2、w/w/w)
その他の資料
ペントバルビタールナトリウム	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	P3761	麻酔用の2%溶液
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	タンパク質-リガンド相互作用プロファイラー
PVDF膜	ミリポーアシグマ、マサチューセッツ州バーリントン、アメリカ合衆国	IPVH00010	ウェスタンブロット移送の場合
PyMOL	https://pymol.org/	バージョン2.5	分子可視化ソフトウェア
R	https://www.r-project.org/	バージョン4.0以降	統計計算およびグラフィックスソフトウェア
スパスツレノール	MedChemExpress、ニュージャージー州モンマスジャンクション、アメリカ合衆国	HY-N1205	高純度標準、>95%
ストリング	https://stringdb.org/	-	相互作用遺伝子/タンパク質の検索ツール
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	伝統中医システム薬理学データベース
チオペンタール	シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国	T102	安楽死のために
TNF-およびα;ELISAキット	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社、北京、中国	SEKM-0034	TNF-およびαの測定には、BALFと血清において
ユニプロット	https://www.uniprot.org/	-	タンパク質配列および注釈データベース