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方法論記事

神経変性に関連する老化:齧歯類脳の組織学的断片におけるβ-gal活性とニッスル染色の同時評価

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DOI：

10.3791/70676

⸱

2026年7月17日

 ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ活性の検出、老化と神経細胞の完全性を同時に評価するためのニッスル染色の実施、そして老化負荷と神経変性の関連を調査するためのツールとして提示されています。

要約

細胞老化は、不可逆的な細胞周期停止を特徴とする生理学的プロセスであり、組織の再生と機能を損なうものです。この現象は、中枢神経系(CNS)内に老化細胞が蓄積することで神経変性の主要な原因として浮上しています。老化細胞は炎症性老化関連分泌表現型(SASP)を獲得し、慢性的な神経炎症を維持し、神経細胞の微小環境を乱します。その結果、神経新生、シナプス可塑性、神経細胞の生存といった重要なプロセスが損なわれます。膨大な文献では、細胞老化がパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症などのいくつかの神経変性疾患や、脳虚血や外傷性脳損傷などの急性神経障害と関連付けられています。

組織学的切片における老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性とニッスル染色の複合評価は、同一組織文脈内で細胞老化と神経細胞の完全性を同時に評価する包括的なアプローチを提供します。この戦略により、特定の脆弱領域(例:海馬や皮質)に蓄積した老化細胞と神経細胞の喪失や組織損傷との空間的相関を正確に示すことが可能になります。老化の機能的マーカーと神経の形態や密度の古典的指標を統合することで、このアプローチは解析の解釈的堅牢性を強化します。さらに、老化負荷と神経変性変化の関係をより正確に特徴付けることを可能にし、限られた組織サンプルから情報量を最大化します。

さらに、このプロトコルは神経変性疾患の齧歯類モデルにおける介入(薬理学的、遺伝子操作など)に応答して老化細胞の蓄積がどのように起こるかを明らかにでき、その病態生理への寄与を解析する強力なツールを提供します。

概要

細胞老化は、細胞周期の本質的に不可逆的な停止と広範な高分子変異を伴うことで定義されます。さらに、老化細胞は多様な炎症促進サイトカイン、成長因子、プロテアーゼを強力に分泌する過剰分泌表現型(SASP)を獲得します。これらの要因が総合的に、老化を強化し組織の恒常性に影響を与える炎症促進微小環境の形成に寄与します。中枢中枢神経系では、老化細胞が年齢とともに徐々に蓄積し、特に加齢に伴う病理に脆弱な領域に集中します3。細胞老化は加齢や神経変性疾患に関連する機能的変化に重要な役割を果たし、正常な老化の過程で老化細胞の負担は徐々に増加します。中枢神経系内の複数の細胞タイプは老化しやすい。アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経幹細胞などである。蓄積される証拠は、これらの中枢神経系細胞集団の老化がアルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症5型など複数の神経変性疾患の病因病理学に関与していることを示しています。神経変性疾患は細胞老化と関連しており、老化細胞はアミロイドβプラークや神経線維絡まりの近くに蓄積することが示されています。齧歯類の脳では、3か月、8か月、17か月、24か月の経齢者でSA-βガル活性の加齢増加が報告されており、統計的に有意な上昇が最も顕著で、最も古いコホート(24か月)で顕著です7。

脳損傷の機能的または行動的相関を扱う病理動物モデルにおいて、組織学的変化と認知障害や代謝調節障害などの機能的結果との関係について重要な洞察を提供しています8,9。

広範な研究にもかかわらず、老化細胞を他の非増殖状態と確実に識別しつつ、単一の普遍的なマーカーは存在しません。しかし、細胞老化の最も広く使われているマーカーは、pH6で検出されるリソソーム酵素老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)であり、β-ガラクトシドを単糖に加水分解するハイドロラーゼ酵素です。重要な区別要因の一つはpHです。SA-β-galはpH6で最適な活性を示しますが、細菌のβ-ガラクトシダーゼはpH 7.4で作用し、内因性リソソームβ-ガラクトシダーゼは酸性pH値が3から5 7,10の範囲で機能します。

細胞密度と脳細胞構造は神経の組織と機能の基本的な決定要因です。特定の細胞集団の空間的分布と存在比は回路機能に不可欠であり、その正確な定量化は選択的な細胞脆弱性や喪失を伴う神経病理学的状態の研究に不可欠です。ニッスル染色法は神経科学の標準的な手法であり、神経組織の神経密度および細胞構造を評価するために広く用いられている組織学的手法です。神経体性内のニッスル体を選択的に標識することで、この方法は脳領域全体の神経集団の信頼できる可視化と定量化を可能にします11。堅牢性に加え、ニッスル染色は技術的に簡便で低コスト、比較的短い処理時間が特徴であり、日常的な神経解剖学的および神経変性研究において実用的かつ手軽なツールとなっています。

同じ組織学的断片内でのニッスル染色と老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性の統合評価は、神経細胞の完全性と老化細胞負荷を同時に検証するための強固で空間的に解消された枠組みを提供します。この統合的アプローチにより、老化を神経細胞の喪失や細胞構造的障害を含む領域特異的な神経変性特徴への直接的なマッピングが可能となります。古典的な構造マーカーと老化の機能指標を組み合わせることで、データの解釈が強化され、老化細胞の蓄積と組織機能障害との機構的関連が明らかになり、限られたサンプルから分析的収量を最大化できます。

重要なのは、この戦略が組織の利用可能性が限られている研究、縦断的または介入ベースのデザイン(例:セノリティックやセノモルフィック治療)、複雑な脳構造における領域特異的解析に特に適しています。これらの分野では老化と神経の脆弱性の相関が重要です。

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プロトコル

すべての動物処置は、実験動物のケアおよび使用に関する機関および国家のガイドラインに従って実施し、適切な倫理委員会から事前承認を得てください。このプロトコルは、現行のメキシコ公式実験動物ケアおよび使用基準(NOM-062-ZOO-1999(Muñoz, 2001))、およびメキシコ国立自治大学医学部の倫理・研究委員会および施設動物ケア・利用委員会(CICUAL)による事前改訂および承認に準拠しています(FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023)。動物は、実験医学連合(Facultad de Medicina)のビバリウムから供給されていました。

注:齧歯類脳組織における老化関連βガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性とニッスル染色を同時に評価するため、本プロトコルでは4%のパラホルムアルデヒド固定齧歯類脳を-20±1°Cで冷凍解剖します。 すべてのセクションはまずSA-βガル活性(ステップ1)を評価し、その後ニッスル染色(ステップ2)、最後にアンチフェードマウントメディウム(ステップ3)を装着します。処理後、スライドは明視野光学顕微鏡で検査され、関心領域の高解像度画像を取得してさらなる解析が可能になります。

1. 組織切片の準備および老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性の検出

  1. 脳切片の準備
    1. ウーら(2021年、12)が先に述べたプロトコルに従い、4%のパラホルマルデヒドを用いた心肺灌流により脳を取得します。脳を0.01%アジドナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液(PBS)に移し、4°Cの長期保存を行います。
    2. プロトコルを進めるには、脳を30%ショ糖溶液に入れ、底に沈むまで待ち、その後-20〜-80°Cで保存します。 このプロトコルは、ラット、マウス、モルモットなど様々な齧歯類脳組織で使用可能で、2-メチルブタンに凍結されます。
    3. 組織を-20±1°Cで凍結切断し、最適切断温度(O.C.T.)化合物(厚さ20〜40μm)に均一な断片を埋め込み、ゼラチンコーティングされたガラススライドに取り付けます。
    4. 断片をガラススライドに取り付け、使用まで冷たい環境で保管してください。
  2. 老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性の検出。
    1. 表1に示された溶液から、使用当日に新たにSA-βガル染色液を準備してください。
    2. SA-βガル活性の特異性を確保するために溶液をpH6.0に調整します。
      注意:使用前にSA-βガル染色液を準備してください。水溶液での事前混合は避けてください。
      5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)は水溶液中では安定しません。
  3. 組織スライドの温度を平衡にします。
    1. 冷蔵庫からスライドを取り出してください。
    2. スライドをコプリンの瓶に入れ、室温(RT)で5分間平衡させます。
    3. コプリンの瓶にスライドを覆うのに十分なPBSを加えて、断片に水分を補給します。
    4. スライドを低速軌道シェーカーに5分間RTで置きます。
    5. 洗いを一度繰り返します。
  4. 染色用のスライドを準備してください。
    1. 吸収性のある紙でスライドの端に付いた余分なPBSを優しく取り除きます。
    2. 各セクションの周りに撥水性のバリアを描き、組織との接触を避けます。
  5. SA βガル染色を行う
    1. スライドを湿度チャンバーに入れます。
    2. マイクロピペットでは、各セクションに約200μLの染色液を加え、組織全体を完全にカバーします。
    3. 37°Cで48時間培養します。
    4. 培養後、吸収性紙で染色液を除去します。
    5. スライドをコプリンのジャーに入れ、PBSをスライドにかけてカバーし、低速軌道シェーカーで5分間RTで優しく攪拌します。
      注意:CO₂インキュベーターは使用しないでください。すぐにニッスル染色に進みましょう。

2. ニッスル染色

  1. Nisslの作業液を準備してください。
    1. 表2に記載されたストック溶液を準備します。
    2. ストック溶液から、クレシルバイオレット溶液15mLとアセテート緩衝液85mLを混ぜてNissl作業液を準備します。
    3. 濾紙(グレード4、孔径20-25μm)で溶液を濾過し、沈殿物を除去します。
    4. ろ過液の後、37°Cで少なくとも30分間(または水浴で40〜43°C)予温します。
    5. 使用直前に0.1M酢酸を10滴、Nisslの作動液に加えます。
      注意:Nisslの作業用ソリューションは1日に最大4回使用してください。一晩中保管しないでください。
    6. 酸性エタノールを95mLの絶対エタノールを容量フラスコに加え、0.1Mの酢酸を15滴加えて酸性エタノールを準備します。蒸留水で100mLにしてよく混ぜます。
  2. スライドを事前に調理してください。
    1. スライドをコプリンジャーに入れ、必要に応じてPBSを加えてスライドを覆い、37°Cで5分間孵化します。
  3. ステインセクション。
    1. 事前に温められたNissl溶液にスライドを慎重にスライドごとに浸してください。
    2. スライドをニッスル溶液で5〜20分間キュベートします。
      注意:時間は組織の厚さによって異なります。深い紫色が出るまで5分ごとにステインをモニターしてください。
  4. 部分を洗いましょう。
    1. スライドを蒸留水で1分間優しくすすぐ。新鮮な蒸留水とともにコプリンジャーのスライドに移し、さらに1分間浸してください。
    2. 染色の質を評価しましょう。明視野顕微鏡(10×対物レンズ)でスライドを観察します。
    3. 明るい視野顕微鏡で、背景を最小限に抑えた強烈な紫色点染色を確認します。
      注意:背景が過剰な場合は、スライドを酸性化した95%エタノールに10秒浸してください。
    4. すぐに絶対エタノールに10秒間移し、分化を止めてください。
      注意:必要に応じて再染色し、色が弱い場合はステインの手順(8.1-9.3)を繰り返してください。
  5. スライドを脱水させてクリアにしてください。
    1. スライドをキシレンに少なくとも5分間浸します(必要に応じて最大2時間)
      注意:組織は~2分以内に脱水するため、迅速に作業してください。

3. マウント

  1. マウントメディアを準備してください
    1. 8 mLのマウンティングメディウムと2 mLのキシレンを混ぜます。
      注意:必要な量だけを準備してください。取り付け媒体はすぐに硬化します。
    2. スライドをキシレンから取り除き、縁を優しく吸い取ってください。スライドを平らな場所に置いてください。
    3. 組織に約120μLのマウンティング培地を塗布します。
    4. カバースリップは片側からゆっくりと置いて、気泡ができないようにしてください。
  2. スライドを乾かして画像を取得してください。
    1. スライドは少なくとも5分間RTで乾かしてください。
    2. 明視野顕微鏡で観察し、関心のある領域の画像を取得します。
    3. 取り付け後、取り付け媒体の完全な乾燥には24時間という長い時間が必要です。
  3. スライドは保管してください。
    1. スライドは長期保存のためにRTに保管してください(数ヶ月間)。

4. 老化負荷の定量化

注:このアプローチは質的評価として適用されます。しかし、研究デザインで求められる場合は定量分析も含めることも可能です。

  1. 老化負荷を、特定の関心領域(ROI)における老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)陽性細胞の相対的な存在比と定義します。この指標は、正のセル数の総セル数に対する割合、または単位面積あたりの正セル密度(セル/mm²)として表します。
  2. 選択された関心地域(ROI)。種や年齢に適した脳アトラスを用いて、標準化された神経解剖学的ランドマークに基づくROIを特定します。推奨領域には、海馬のサブフィールド(CA1、CA3、歯回)や明確な層状組織を持つ皮質領域が含まれます。
    1. 各セクションごとにROIごとに3〜5の重複しないフィールドを選択します。
    2. 動物ごとに少なくとも2〜3のセクションを分析し、一定の解剖学的間隔で配置してください。
    3. すべてのサンプルでROIのサイズと形状を同じに保ちます。
    4. ROI選択時の実験条件をオペレーターに認識させないため、バイアスを最小限に抑えましょう。
  3. 画像を取得しましょう。
    1. 標準化された条件下でデジタルカメラを搭載した明視野顕微鏡を用いて画像を取得する:
      1. 一定の倍率(例:地域全体像には10×、定量化には20×または40×)を用いてください。
      2. すべてのサンプルで一定の照明、露光時間、ホワイトバランスを維持してください。
      3. SA-β-gal信号(青)の飽和を避け、ニッスル染色(紫)をはっきりと可視化してください。
      4. 画像はロスレス形式(例:TIFF)で保存し、下流解析に使います。
  4. 画像を前処理してください。
    1. 画像解析ソフトウェア(例:ImageJ/Fiji)を用いて前処理を行います13。
      1. 必要に応じて画像をRGB形式に変換してください。
      2. 背景の引き算を適用して、不均一な照明を修正します。
      3. 相対的な信号強度を変えずに、すべての画像でコントラストを均一に正規化します。
      4. 信号境界を歪める可能性のある過剰処理は避けてください。
  5. SA-β-gal陽性細胞を特定してください。
    1. 細胞質内に局在する明確な青色沈殿物の存在に基づいて陽性細胞を定義します。色の閾値を使って青信号(例:経験的に決定された色相・彩度・強度範囲)を分離します。
    2. 背景染色を排除するために、陰性対照(若年または未治療組織)を用いて閾値を検証すること。
  6. ニッスル染色で観察された細胞プロファイルとの形態的整合性を確認します。
  7. 定量化アプローチ
    1. 細胞ベースの定量:SA-βガル陽性細胞を手動または半自動ツールで数えます。同じROI内の細胞の総数をNissl染色で決定します。
    2. 結果を次のように表す:
      老年負荷(%) = (SA βガロン陽性細胞/総細胞) '100
    3. 密度ベースの定量化:単位面積あたりのSA βガロン陽性細胞数を計算します:
      セル密度 = 正セル/ROI面積(mm²)
    4. 閾値の定義と制御:検出閾値を経験的に確立する:
    5. ネガティブコントロールを使ってバックグラウンド信号レベルを定義します。
    6. 感受性を検証するために、肯定対照(例:老化した脳組織やストレス誘発モデル)を含めてください。
    7. 実験内のすべてのサンプルに対して同一のしきい値設定を適用します。再現性を確保するためにすべての閾値パラメータを文書化してください。

5. データの正規化と統計解析

  1. 細胞密度の地域差を考慮して老化負荷を正規化すること;Nissl染色を使ってROIあたりの細胞数を推定します。これはROI、切片、動物の平均測定値です。実験設計に応じて適切な検定(例:t検定、ANOVAなど)を用いて統計解析を行います。
  2. データをSEMまたはSDの±平均として報告し、生物学的複製数(n)を指定します。
  3. 盲検と再現性:すべての定量解析は盲検条件下で実施します。再現性の検証は、(a) 少なくとも2人の観測者による独立解析、または(b) 画像の一部を再解析して観測者内変動を評価することによって検証されます。
  4. 定量化戦略の限界:可能な限り、補完的なマーカーと並んで定量的結果を解釈すること。さらに、セクションごとの染色強度の変動は閾値ベースの定量に影響を与える可能性があるため、慎重に管理する必要があります。

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結果

老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)染色とニッスル染色の組み合わせにより、同一脳切片内で老化細胞負荷と神経細胞構造を同時に可視化することが可能になります。

SA-βガル染色手順(ステップ1)の後、明視野顕微鏡でスライドを観察します。染色成功は、β-ガラクトシダーゼ活性を示す細胞内に局在する明確な青色沈殿物の存在によって示されます(図1)。低倍率で、海馬や大脳皮質などの主要な脳領域を特定します(図1A)。高倍率では、特にCA3サブフィールドのような領域内で、個々の細胞が細胞内青色染色を示す様子を観察します(図1B)。このシグナルは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド(X-gal)の酵素的加水分解によって生じ、酵素活性部位に蓄積される不溶性の青色生成物(5,59-ジブロモ-4,49-ジクロロインディゴ...

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ディスカッション

現在、中枢神経系の老化細胞を同定、分離、選択的に除去するための強固で特異的なツールの利用が限られていることが、機構的研究における大きな障壁となっています。この方法論的なギャップは、細胞老化が神経病理に与える原因を、単なる疾患進行との関連から切り離す能力を制限しています。ここで提示するワークフローは、SA-β-gal酵素検出とNisslカウンターステインを組み合わせ、定義された神経解剖学的文脈内で推定される老化細胞負荷をマッピングし、酵素的読み取りを神経変性領域に典型的な細胞構造変化と結びつけます3。SA-β-gal陽性細胞と局所細胞構造を同定することで、老化がどこに蓄積し、それが病態生理にどのように寄与するかを明らかにする助けとなるかもしれません。

ここで述べる構造的および老化に伴う変化に加え、蓄積された証拠は免疫調節障害と炎症シグナル伝達が脳病理に寄与していることを浮き彫りにしています。最近の研究では、免疫恒常性の変化や炎症経路の持続的な活性化が神経障害の進行に中心...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この活動は、個人アカデミコ総合アスントス局、UNAM(PAPIIT IN224624)、および科学・人道・技術・革新事務局(SECIHTI)のプログラム、Ciencia de Frontera CBF-2025-I-1337およびUNAM博士プログラム(POSDOC)の支援を受けました。RJRCはCONAHCyTからフェローシップ番号1020262を受けました。VSVはUNAMの個人アカデミコ総合局(DGAPA)からポスドクフェローシップを受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メチルブタンSIGMAM32631-500ML
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル &ベータ;-D-ガラクトピラノシド (X-ガル)PROMEGAV394A-30～-10 ℃で保存
クエン酸MERCK251275-5G
クレシルバイオレット酢酸エステルSIGMAC5042-10G
組織学用DPXマウンタントSIGMA06522-500ML
濾紙WhatmanWHA1001929
氷酢酸SIGMA695092-500ML
疎水性ペンMERCKZ672548
組織学グレードのキシレンSIGMA534056-500ML
湿度チャンバーSTAINTRAY25501
無水塩化マグネシウムSIGMAM8266-100G水和塩化マグネシウムを使用する場合は、モル濃度を調整する。
OCTSAKURA FINE TEK4583
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)SIGMAP4417-50TAB市販のタブレットを使用する。
カリウムフェリシアン化物 (カリウムヘキサシアノフェレート(III))SIGMAP8131-100G
カリウムフェロシアン化物 (カリウムヘキサシアノフェレート(II) 三水和物)SIGMAP9387-100G
無水酢酸ナトリウムSIGMAS2889-250G水和酢酸ナトリウムを使用する場合は、モル濃度を調整する。
塩化ナトリウムSIGMAS9888-2.5KG
リン酸ナトリウム (二水和リン酸二ナトリウム)SIGMA71649-500G

参考文献

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