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方法論記事

緑 膿菌 集合体における宿主誘発ストレスへの反応のリアルタイムイメージング

173 閲覧数

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DOI：

10.3791/70682

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2026年5月15日

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

この記事について

サマリー

緑緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は抗生物質および免疫細胞に対する耐性の増加を示します。膜の完全性が骨材の生存に果たす役割は、現在十分に解明されていません。本研究は、P. aeruginosa集合体内の細胞膜動態の変化を定量化し、細胞の完全性が集合体の生存率にどのように影響するかを理解する方法を示します。

要約

嚢胞性線維症(CF)のような慢性感染症は、免疫や治療の圧力にもかかわらず持続する小さく高い寛容性 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa )の集合体によって維持されます。古典的なバイオフィルムとは異なり、これらの集合体は明確な病原単位、すなわちミクロスケールで空間的に組織された群集を表し、宿主によるストレス下でも構造的な完全性と生理的恒常性を維持します。しかし、これらの条件下で集合体が完全な状態を保つ仕組みや、これらの恒常性プロセスが選択的に破壊されるかどうかは、依然として不十分に定義されていません。このギャップを克服する上での主な障壁は、生理的ストレスと構造的安定性および崩壊をリアルタイムで結びつける動的で空間的に解決されたプロセスを捉えるツールの欠如でした。本研究は、宿主関連ストレッサーに対する総合的な反応を定量化するための統合イメージングおよび分析ワークフローを提示します。電圧感受性染料DiBAC4(5)を用いて、合成嚢胞性線維化痰培地(SCFM2)内で形成される集合体内の生理学的障害の早期指標として膜脱分極を監視しました。高解像度のタイムラプス共焦点顕微鏡は安定状態および応力誘導状態の両方の集合体の可視化を可能にし、画像セグメンテーションやボクセルベースの解析は膜の完全性および骨材分解の空間的異質性を定量的にマッピングし、単一細胞解像度で実現します。このワークフローは、多細胞細菌集合体における生理的ストレスと構造的結果を結びつける再現可能かつ適応可能なプラットフォームを確立します。集合体の完全性を維持または損なうプロセスを定量的に解析可能にすることで、このアプローチは集合体のレジリエンスを支える恒常性メカニズムを特定し標的化する重要な基盤を提供し、この臨床的に重要な細菌持続モードを破壊するための新たな戦略を推進します。

概要

慢性細菌感染は、表面に付着した大きなバイオフィルムではなく、宿主に関連する環境内で形成される小さな多細胞集合体によって維持されることが多いです。嚢胞性線維症(CF)やその他の慢性気道疾患において、Pseudomonas aeruginosaは上皮表面に伝統的なバイオフィルムとして付着するのではなく、粘液や痰中に埋め込まれた懸浮集合体として存在することが一般的です。これらの集合体は、微小な空間的組織、顕著な生理学的異質性、免疫および抗菌ストレスに対する卓越した耐性を特徴とする独自の成長様式を表します(1,2,3,4)。臨床的関連性があるにもかかわらず、このプロトコルでは膜の完全性と空間的組織を維持する能力と定義される集合安定性を支配するメカニズムは依然として十分に解明されておらず、過去の研究は表面付着バイオフィルム形成を支えるマトリックス成分に重点を置いています。

膜の脱分極や骨材構造の変化など、骨材の不安定化に寄与する事象を研究する上で大きな障壁は、リアルタイムで動的な生理学的・構造的変化を捉える実験的ワークフローが不足していることです7,8。従来のバルクアッセイやエンドポイントイメージング手法では、ストレス応答が凝集体内でどのように現れるか、これらの応答が空間的にどのように分布しているか、また膜の脱分極やイオン恒常性の喪失といった生理学的弱化が細胞ストレスの初期兆候や最終的な物理的崩壊にどのように結びつくかを解明できません。共焦点顕微鏡は表面付着バイオフィルムに広く応用されていますが、時間分解イメージングと細胞生理学を集合構造や膜活動と直接結びつける定量解析を統合する手法は少ないです。

細菌膜電位の変化は、細胞ストレスや恒常性の喪失を早期かつ敏感に示す指標となります。ビス(1,3-ジブチルバルビツ酸)ペンタメチンオキソノール(DiBAC4(5))などの電圧感受性染料は脱分極細胞内に蓄積し、膜の完全性を示す非破壊的蛍光ベースの読み取りを提供します。DiBAC染料はプランクトニック培養や表面付着バイオフィルム9,10における膜脱分極の評価に用いられてきましたが、特に生理学的に重要な成長条件やタイムラプスイメージング下での多細胞集合体への応用は限定的です。

ここでは、P. aeruginosa集合体における膜脱分極および構造破壊のリアルタイム可視化と定量化を可能にする統合イメージングおよび分析ワークフローを提示します。集合体は合成嚢胞性線維化痰液培地(SCFM2)で形成されます。SCFM2は化学的に定義された培地で、CF気道の主要な栄養およびイオン的特徴を再再現し、表面や流れを強制することなく自発的な骨材形成をサポートします11,12。これらの条件下で、P. aeruginosaはCFの痰や気道サンプルで観察されるものと同等の大きさと構造的異質性を持つ懸浮凝集体を形成し、集合行動の研究に生理学的に重要なプラットフォームを提供します13。

温度と湿度が制御された環境でのタイムラプス共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、このワークフローは安定した集合状態と、膜の脱分極増加や細胞恒常性の喪失を伴うストレス誘発状態の両方を撮影します。DiBACベースの膜電位報告と高分解能のzスタックイメージングを組み合わせることで、この手法は単一細胞レベルでDiBAC₄(5)蛍光を定量化し、個々の集合体の空間的文脈内で値をマッピング・解析することを可能にします。下流の画像セグメンテーションとボクセルベースの表面解析により、集合体構造の変化と膜脱分極を並行して定量化することが可能になります。

重要なのは、このプロトコルはSCFM2で形成された P. aeruginosa 集合体を用いて実証されているものの、ワークフローは広く一般化可能である点です。画像戦略、染料ベースの生理学的読み取り、分析フレームワークは、他の細菌種、骨材促進培地、抗微生物剤、免疫効果因子、環境的攪乱などのストレス要因に容易に適応可能です。したがって、このアプローチは多様な実験文脈における細菌群集の安定性を検証するための移転可能かつ再現可能なプラットフォームを提供します。

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プロトコル

P. aeruginosaに関するすべての作業は、適切なBSL-2封じ込め条件および機関のバイオセーフティ承認のもとで行われなければなりません。本研究で使用される試薬および機器は材料表に記載されています。

1. 合成嚢胞性線維化痰培地(SCFM2)における 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa )の集合体の生成

注:このステップは、C . aeruginosa の培養およびCF気道環境を模倣した生理学的に重要な条件下での懸濁多細胞集合体の形成について説明します。

  1. 細菌培養の調製
    1. 実験前日に、凍結グリセロールストックから野生型Pseudomonas aeruginosa PAO1(プラスミドp9-1(GFP)14を5mLの溶原形成ブロス(LB)に接種します。
    2. プラスミド選択を維持するためにカルベニシリン(300 μg/mL)を追加します。
    3. 培養物は37°Cで一晩育て、200rpmで振る。
  2. 逆希釈と骨材形成準備
    1. 実験当日には、一晩培養を1:5(1 mL 1 mL 1 lb:4 mL LB)で希釈します。この段階では抗生物質の再添加はなく、残留残留は最小限で成長に影響しません。
    2. 37°Cで約2時間、振って(200rpm)培養し、対数位相に到達させます。
      注意:これらの条件下で細胞は通常、~2時間後の初期指数相に位置します。さらに、細胞はSCFM2への接種前に洗浄され、残留抗生物質の残留を最小限に抑えます。
  3. SCFM2の調製と平衡化
    1. 希釈期間終了の約30分前に、事前に準備されたSCFM2を無菌チューブにアリコートし、37°Cまで加熱します。
    2. 4ウェルのガラス底光学アンテナでのイメージングには、1ウェルあたり500μL SCFM2を割り当てます。ピペッティング誤差を考慮して余分な量を準備してください。
      注:SCFM2は4°Cで保存されます。 予温は温度ショックを最小限に抑え、骨材形成の再現性を向上させます。
  4. 接種の洗浄と標準化
    1. ペレット培養は4200 x g で遠心分離し、室温で4分間加熱します。
      注:回転数計算が必要な場合、スイングバケットローターのローター半径は172mmです。
    2. 上清液を取り出し、3mLの無菌PBS(pH7.0)にペレットを再懸浮させます。
    3. 洗う手順をさらに2回繰り返し(合計3回洗う)。
    4. OD₆₀₀を測定し、SCFM2を0.05の開始OD₆₀₀まで接種するために必要な体積を計算します。
    5. ボルテックスで細胞を均質化し、各ウェルに500 μL SCFM2を含む接種を行います。
  5. 静的条件下での骨材形成
    1. 37°Cで静的に4時間接種し、骨材形成を促すために培養します。
      注:4時間の培養は、CFの痰や気道サンプルで観察されるサイズと異質性に匹敵する懸浮集合体を再現可能に得られ、後期段階のバイオフィルム成熟を最小限に抑えます1,15。

2. 免疫関連ストレッサー(ヒト好中球エラスターゼ)の調製

注:このステップは、細胞ストレスや細菌集合体の不安定化を誘発するために用いられる宿主由来のストレッサーの調製について説明します。

  1. ヒト好中球エラスターゼ(HNE)の再構築と貯蔵
    1. 製造者の推奨に従い、50 mM酢酸ナトリウム、200 mM NaCl、滅菌水を用いてヒト好中球エラスターゼを再構成します。
    2. 50μg/Lのストック溶液を準備し、0.2μmフィルターでろ過します。
    3. 50 mLの容量に分割し、−20°Cで保存します。
    4. 使用前夜、アリコートを4°Cで解凍します。
      注:アリクォートは凍結・解凍サイクルを最小限に抑え、酵素活性を低下させばらつきが生じる可能性があります。アリコットは約1か月間4°Cで安定しています。

3. 膜脱分極を報告するためのDiBAC4(5)の調製および応用

注:このステップでは、集合体内の膜脱分極を可視化するために電圧感応染料の調製と使用について説明します。

  1. DiBAC4(5)の調製と保管
    1. まずDiBAC4(5)のストック溶液を準備します。無水DMSO中にDiBAC4(5)粉末を1 mg/mLに再構成します。
      注:DMSOにおけるDiBAC4(5)の再構成は標準的な製造業者の推奨に従います。
    2. 100μLの容量に分割し、光から保護された−20°Cで保存します。
    3. 各アリクォートは最大2回まで使わないでください。
      注:DiBAC4(5)は機能的にはDiBAC4(3)と同等ですが、ここではGFP励起/放出スペクトルに適合するように選ばれています。このプロトコルでは、DiBAC4(3)は結果のセクションで述べた追加の染色にのみ使用されます。このプロトコル全体で使用される主な染料はDiBAC4(5)です。

4. P. aeruginosa 集合体の膜脱分極のタイムラプス共焦点イメージング

注:このステップは、集合体の動的な生理学的および構造的変化を捉えるために、高解像度かつ時間分解能のある共焦点画像を取得する方法を説明します。

  1. 顕微鏡および環境チャンバーの準備
    1. 共焦点顕微鏡ステージに加熱されたマイクロプレートインサートまたは環境チャンバーを設置します。
    2. 撮影の少なくとも1時間前に温度と湿度の制御をオンにし、37°Cに設定してください。
    3. 取得タブでレーザータブを位置付け、使用約1時間前に必要なレーザーを起動して十分なウォームアップを行います(GFP用のアルゴンレーザー;DiBAC4(5)のDPSS 561-10(補足図1A)を評価。
      注:安定した環境制御により、焦点のずれを減らし、長時間のタイムラプス実験でも集合体の整合性を維持します。
  2. 免疫ストレスの適用
    1. 骨材形成4時間後、実験井にHNEを加え、最終濃度20 μg/L16にします。
    2. コントロールウェルはそのまま放置しましょう。
    3. 4ウェル皿を顕微鏡ステージに移します。
      注:HNEは、濃縮ストックではなく、誘導痰中の報告レベルに基づいて生理学的に関連性の高い濃度(μg/L)で調製されました。本研究で使用された濃度は、McGarveyら16の研究で、IS(誘導喀痰)、NE-AAT(NE/a1-抗トリプシン複合体)、HV(健康なボランティア)で確認できます。
  3. 関心地域の集合的同定
    1. 「 Locate tab」と20×の対物レンズを使い、 透過光 をオンにして明視野イメージングを用いて集合体豊富な領域を特定します(補足図1B参照)。
    2. 明視野イメージングを使いながら、 取得 タブに移動し、 位置 モジュールを使ってx、y、z座標を保存してください(補足図1C参照)。
    3. この繰り返しは、1井ごとに複数の技術的複製を行います。
  4. 高解像度Zスタックおよび時系列取得
    1. 保存された位置に移動し、63×の油浸水目標に切り替えます。
    2. 皿を配置する前に浸漬油を塗ってください。
    3. 取得タブで、スマートセットアップ(補足図1D)を使ってチャネルを設定します:GFP(488/509 nm)– 緑を割り当て、DiBAC4(5)(591/615 nm)– 赤を割り当てます。
    4. ライブビューに切り替え、Zスタックモジュールを使って、ファインフォーカスを調整してカバースリップの下部を特定し、まず「Set First」をクリックして最初のzポジションに設定します(補足図1E参照)。
    5. レンジ が 60μmを示すまで上方に移動し、最終的なZ位置を「 Set Last 」をクリックして設定します(補足図1E参照)。
    6. ライブビューをオフにして、確定フォーカスを有効にしてください。「Find Surface」を選択し、ステータスが「Reflex Found」を示した時点で「Store Focus」を選択してください(補足図1F参照)。
    7. Z スタック モジュールと Definite Focus モジュールを使って、保存した各位置ごとに再度焦点調整を行います。
    8. 時 系列 取得を設定し、各位置を3分ごとに6時間撮影する(補足図1G参照)。
      注意:ここでプロトコルは解凍、添加、培養のために一時停止され、孵化期間終了後に再開可能です。
    9. 「 実験開始」を選択します。
      注:3分間隔は時間的な解像度と光毒性および光漂白のバランスを取っています。
  5. DiBAC4(5)の追加と培養
    1. 各ウェルにDiBAC4(5)を加え、最終濃度5 μg/mL9にします。
    2. 暗闇で30分間孵卵させてからタイムラプス撮影を開始します。
      注:このインキュベーションにより、背景蛍光を最小限に抑えつ色料の平衡が可能となります。

5. 骨材構造およびDiBAC4(5)共局在の定量的画像解析

注:このステップでは、膜脱分極とアグリゲートアーキテクチャおよび不安定化を結びつける定量的なワークフローを説明しています。

  1. 画像インポートとチャンネル分離
    1. 画像ファイル(.cziまたは同等のもの)をImaris x64ソフトウェアバージョン10.2.0以降にアップロードしてください。
    2. 画像メタデータのx、y、zピクセル寸法(ボクセルサイズ)が共焦点取得パラメータ(対物レンズ、ズーム、zステップサイズ)を正確に反映しているかを確認して、ボクセルキャリブレーションを検証します。誤った較正は空間的および体積的測定の誤差を引き起こします。
  2. 細菌集合体の表面レンダリングとDiBAC4(5)シグナル
    1. Surfaceモジュールを使ってP. aeruginosaの骨材をレンダリングしてください:
      1. セ グメンテーション設定で GFP チャネルを選択してください(補足図2A参照)。
      2. 「分割接触オブジェクト(領域成長)を有効にする」を選択し、強度閾値を調整して集約体を完全にキャプチャします(補足図2B参照)。
      3. フィルターシードポイントモジュール内で、フィルタータイプをボクセル数(Img = 1)に変更し、90%に設定してください(補足図2C参照)。
      4. レンダリング処理後、表面を100%に設定します(補足図2D参照)。
    2. レンダリングを完了し、細菌の表面に緑色を割り当てます(補足図2E)。
    3. DiBAC4(5)チャンネルのレンダリングを繰り返し、赤色を割り当てます。
  3. 共局在化と体積ベースの定量化
    1. DiBAC4(5)表面レンダリング(補足図3A)を選択し、どの時間点で共局在解析を行うかを決定してください。
    2. 具体的な値>詳細>タブ(補足図3B)にナビゲーションしてください。
    3. 細菌 表面への最短距離 が0.00の対象を選択することで共局在を定義します(補足図3B参照)。
    4. Locate Edit を行い、これらのオブジェクトを複製して、DiBACとセルが重なる面を生成する(補足図3C)。この面の名前は、重複する性質を示すために必ず変更してください。
    5. 詳細タブの平均値下で、各選択した時間点での合計体積値を記録します:(1) Total DiBAC4(5) 信号(補足図3D);(2) 共局所化されたDiBAC4(5)信号(補足図3E)。
    6. 重複率を次のように計算してください:
      figure-protocol-1
      注:重なりの割合は、集合体内の細胞関連DiBAC₄(5)シグナルの割合を反映し、特定の時刻における膜脱分極を反映しています。
      注:P . aeruginosa の集合体をSCFM2に用いてHNEでストレスを施すことが示されていますが、このワークフローは他の細菌種、集合促進培地、蛍光レポーター、抗微生物剤や環境攪乱を含むストレッサーにも広く適応可能です。

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結果

上記のプロトコルには、嚢胞性線維症の肺環境でモデル化されたP. aeruginosaの集合体の膜動態の変化を追跡する方法が提供されています(図1)。pMRP9-1(GFP)プラスミドを運ぶ野生型PAO1株(図1A)、免疫ストレスを模擬するHNE、およびDiBAC4(5)膜染料(図1C)を用いて、膜電位の破壊と細胞恒常性の破壊を反映した膜脱分極の変化を定量化しました(図2M)。当初、培養は4時間の静的培養で、自由浮遊凝集の形成を確保していました(図1B)。その後、PHNE曝露されたP. aeruginosa培養液をDiBAC4(5)染料を用いたCLSMを用いて6時間...

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ディスカッション

膜電位は細胞ストレスやホメオスタシスの乱れを早期に敏感に読み取ります。多細胞細菌集合体内では、これらの生理的変化はその後の構造的不安定化の前から起こり、またそれを引き起こすことがあります。ここでは、反応が遅く潜在的に敏感な染料ビス(1,3-ジブチルバルビツル酸)ペンタメチンオキソノール(DiBAC4(5))を用いて、宿主由来ストレスにさらされた 緑膿菌 の集合体の脱分極を追跡するイメージングベースのワークフローを紹介します。脱分極の追跡は、集合体内の細胞の生理学に関する貴重な洞察を提供し、イオン恒常性を変化させたり膜電位を乱す外部ストレス要因がこれらの多細胞群集の不安定化にどのように寄与するかをより深く理解することを可能にします。このアプローチを用いることで、生理学的に関連した条件下で培養された骨材内の膜活動を直接可視化・定量化することが可能です。

DiBAC染料はこれまでP. aeruginosa20,21<...

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

S.E.Dは、サウスフロリダ大学分子医学科からのスタートアップ資金および嚢胞性線維症財団(CFF)(DARCH19G0年、年DARCH22P0年、DARCH25G0年)からの研究助成金によって支えられています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,3-ジブチルバルビツル酸)ペンタメチンオキソノール(DiBAC4(3))AATバイオクエスト21411 脂溶性・陰イオン分子 
1,3-ジブチルバルビツル酸)ペンタメチンオキソノール(DiBAC4(5))AATバイオクエスト21410 脂溶性・陰イオン分子 
カルベニシリン 国際的な研究成果など;C46000-5.0PAO1のGFP発現株の選定に用いられます
セルヴィス4室35mmガラス底皿フィッシャーNC0600518ガラス底チャンバーディッシュは、画像撮影中に成長培地中の懸浮骨材の管理を可能にする。
遠心分離機ベックマン・コールター生命科学B06320ベックマン・コールター ライフサイエンス SX4400 スイングバケットローター(部品番号 B01425)と組み合わせて
共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)ツァイスLSM 880このプロトコルで記述された実験で使用されたCLSMモデルは現在は利用できませんが、LSM 900は更新された同等の選択肢です。
培養チューブジェネシー21-130不妊、ポリプロピレン 
ダピサーモ・フィッシャー62248将来の好中球染色の提案用途に使用されます。DiBAC4(5)
使い捨てのキュベット ブランドテック759086D1.5mL、セミマイクロ
DMSOミリポール・シグマ276855-100MLDiBAC4(3,5)の再編成に使用されました。
ドラク5サーモ・フィッシャー65-0880-92将来の好中球染色にDiBAC4(3)で使用されます。
CLSMの環境会議所PECONLSM 880このシステムはツァイス製品専用に製造され、一般に「インキュベーションシステムS」と呼ばれ、すべての部品はLSM 880(または類似)システムの追加としてツァイスを通じて発注可能です
ゲンタマイシン硫酸塩 フィッシャーBP918-1PA1633の発現株を発現するRFPの選別に使用されます
グリセロール ジェネシー18-205長期保存用の株を-80度から-nbspで凍結するために使用されていました。°C
ヒト好中球エラスターゼ(HNE)ミリポール・シグマ324681-50UG再構成されると、1か月間は4 で安定しています。°Cまたは20歳で1年;°C
Imaris x64ソフトウェアオックスフォード・インストゥルメンツ バージョン 10.2.0
イマージョンオイル 電子顕微鏡科学など;16919-12乾燥しない;標準化は37 °C
インキュベーター ベンチマーク・サイエンティフィックH1001-M揺れ動く能力がある
溶菌ブロス(LB)ジェネシー11-118ミラーミックス
mCherry plasmid コラボレーターから取得しました。
PA1633 トランスポゾン変異株 nbsp;コラボレーターから取得しました。
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)サーモ・フィッシャー3002pH 7.0
酢酸ナトリウムサーモ・フィッシャーAM97403歳の男性;pH 5.5;RNaseフリー
塩化ナトリウムフィッシャー S271-500HNEの再建に使用されました
分光光度計およびVWR634-0882細胞密度を測定し、PAO1/PA1633をSCFM2に接種するために用いられます。
滅菌.22&マイクロ;mフィルタージェネシー25-244再構成されたHNEの精製に使用されました
無菌マイクロ遠心分離機チューブジェネシー24-272LR0.6mL
滅菌注射器フィッシャー14955459再構成されたHNEの精製に使用されました
SX4400スイングバケットローター ベックマン・コールター生命科学B01425ベックマン・カウルター生命科学遠心分離機(部品番号B06320)とのペアリング
合成嚢胞性線維症痰培地(SCFM2)シンセバイオーム10002-500バッチ#:001-CF2-0724
ウルトラピュアウォータージェネシー18-195HNEの再編成に使用されました
野生型Pseudomonas aeruginosa PAO1とpMRP9-1プラスミド このpMRP9-1プラスミドはGFPを含み、カルベニシリン耐性を発現します。
ZEN Black Edition 2.3 Zeiss イメージングソフトウェア ツァイスLSM 880と互換性があります

参考文献

  1. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
  2. Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
  3. Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
  4. Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
  5. Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
  6. Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
  7. Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
  8. Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
  9. Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
  10. Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
  11. Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
  12. Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  13. Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
  14. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  15. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  16. McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
  17. Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  19. Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
  20. Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
  21. Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).

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