本記事では、IMR-90ヒト線維芽細胞における老化期のリソソーム再構築を測定するための生細胞LysoTrackerプロトコルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
細胞老化は、細胞形態の拡大、分泌シグナル伝達の変化、顕著なリソソーム再構築などの特徴的な表現型を伴う安定した細胞周期停止状態です。セネッセント細胞は一般的に酸性エンドリソーム区画の拡張を示し、ルミナル酸度や分解能力の変化を伴い、老化関連オルガネルのリモデリングを活細胞で簡単に読み取る機会を提供します。本研究は、酸性蛍光染料であるLysoTracker Deep Redを用いて、酸性小器官区画の介密かつpH依存的な代理指標として老化負荷の相関を示す生細胞イメージングプロトコルを説明しています。この方法は、連続通過を通じて重複老化を遂げるIMR-90ヒト肺線維芽細胞で実証されています。プロトコルは細胞培養および伝達追跡、LysoTracker染色、蛍光イメージング、および細胞ごとのリソソーム信号強度および信号正向き面積の画像ベースの定量を詳細に記述しています。並行培養における老年関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)染色は、参照標準ではなく、オプションの確認マーカーとして含まれます。代表的なアウトカムでは、後期継承培養で早期継承対照群よりも高い酸性蛍光染料シグナルと溶性陽性領域が大きくなり、老化期の酸性細胞小器官の拡張と一致しています。この数値は区画体積、陽子勾配、染料の利用可能性に依存するため、リソソーム数や生合成の直接的な測定ではなく、リソソームのリモデリングの間接的な相関として解釈するのが適切です。このプロトコルは採用が簡単で、他の細胞型や老化を誘発するストレスにも適応できるため、従来のエンドポイントアッセイの実用的かつ定量的な補完を提供します。
概要
細胞老化は、さまざまなストレスや加年に関連するトリガー(1,2,3,4)によって活性化される持続的な細胞周期停止プログラムです。上層細胞は古典的に複数のマーカーの集合によって識別されます。なぜなら、単一のマーカーが完全に特異的ではないためです。特徴としては、細胞形態の拡大・扁平化、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)活性、DNA損傷焦点の形成、炎症促進分泌プロファイル(SASP)2,4,5が含まれます。これらの特徴の中で、リソソームのリモデリングは老化の顕著かつ機能的に重要な形質として浮上しています 6,7。上色細胞はリソソームの大きな変化を示す。これにはリソソームのサイズと数の劇的な拡大、機能の変化(しばしばリソームpHの部分的中和や未分解物質の蓄積を伴う)
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プロトコル
IMR-90細胞は確立されたヒト線維芽細胞株であり、ヒト被験者の研究には該当しません。倫理的な承認やインフォームド・コンセントは必要ありませんでした。すべての手順は、ニューヨーク州立大学オールバニ校のバイオセーフティガイドラインに従い、バイオセーフティレベル2(BSL-2)条件下でヒト由来細胞株を対象とした研究に基づき実施されました。
1. 一般的な準備とワークフローの概要
- 実験的目標を、LysoTrackerの深紅染色法と生核染料を用いた生細胞リソソームプロファイリングアッセイと定義し、IMR-90細胞における老化負荷の連続的な読み取りとしてリソソーム再構築を定量化すること。一次生物学的比較を以下のいずれかの設計として定義します。
- 老化誘導と非誘導対照群の比較。
- 高齢期と低齢期の条件を、線量または時系列にわたって比較します。
- 高齢症はセノリティック治療と比較 されます。車両処理による高老化制御。
- 老化が低いベースライン群と高齢化グループの両方を含む老年溶解治療シリーズ。
- すべての実験に対して最低限の管理体制を確立すること。
- プレート密度、染色タイミング、画像設定に適合した老化の低い....
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結果
このプロトコルを低老化・高老化条件下のIMR-90線維芽細胞に適用すると、単一細胞レベルで、必要に応じて全圃場レベルでも要約可能な定量的なリソソーム表示が得られます。
図と表に示される代表的なデータセットは、13番(P13;低老化、~PDL 26)と23番(P23;高齢、~PDL 46)のIMR-90培養を比較した単一の生物学的実験に基づいています。各条件につき2本の井戸が画像化され、1井戸あたり44フィールド(合計176フィールド、各条件88フィールド)を取得しました。図2Dの各井戸相関は、これら44個のフィールドの平均から計算されており、n=4点(条件ごとに2点)です。 表1 および 補足表1 は、各条件ごとに代表的な20×フィールドを1つ報告しています。これら2つの表は条件ごとに両方の井戸をカバーしています(P13の場合はB01およびA01;P.......
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ディスカッション
このプロトコルは、リソソームのリモデリングを通じて老化を測定し、細胞ごとおよびウェルごとの老化負荷の定量的読み取りを生成する生細胞イメージングワークフローを記述しています。信頼できるアッセイを得るためには、特に重要なステップがいくつかあります。まず、生物学的モデル自体を適切に制御しなければなりません。IMR-90線維芽細胞における複製老化の誘導には、個体群倍増の綿密な追跡と初期通過培養の並行管理が必要であり、非老化の基準参照2,3,18です。通過履歴や合流の小さなずれが老化細胞の割合をずらし、その結果アッセイのダイナミックレンジを変化させます。第二に、リソソームおよび核染色条件は厳格に標準化されなければなりません。LysoTrackerの濃度、培養時間と温度、核染色の曝露はすべて信号強度と分断品質に影響を与えます。最後に、画像設定やプレートの取り扱いは、蛍光の違いが焦点のずれや不均一な.......
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、JAMおよびTJBへのNIH助成金R15CA274603、ML、ST、JAMへのR56DE033253、そしてSTおよびJAMへのR01GM125870 1R41AG081123の助成金によって資金提供されました。図形は BioRender.com で作成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェル組織培養プレート（底面フラット、TC処理済み） | CellTreat Scientific Products | 229124 | 生細胞蛍光イメージングと互換性のある透明底多重培養プレート（例：6、12、または24ウェルTC処理済みポリスチレンプレート；高解像度イメージングにはガラス底イメージングプレートが好ましい）。 |
| ベータガラクトシダーゼ染色キット（老化アッセイ） | Cell Signaling Technology | 9860 | SA-β-ガラクトシダーゼ検出用商用キットで、pH 6.0の染色バッファーが検証されている。参考までに、固定液はPBS中の2%ホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドを含み、染色液はDMF中の1 mg/mL X-gal、40 mMクエン酸/リン酸 pH 6.0、5 mMカリウムフェロシアニド、5 mMカリウムフェリシアニド、150 mM NaCl、2 mM MgCl2を含む。 |
| BioRender（科学的イラストソフトウェア） | BioRender | N/A — ウェブアプリケーション | 図表（図1–3）の作成に使用。https://www.biorender.com |
| 炭酸ガス（CO2）、圧縮シリンダー | Airgas（または類似のサプライヤー） | N/A | 細胞培養インキュベーターおよびステージ上イメージングチャンバーで5%の雰囲気を維持するために使用される医療グレードのCO2。 |
| 胎児ウシ血清（FBS）、熱不活性化 | Thermo Fisher Scientific（Gibco） | 10082147 | 完全培養培地に10% v/vで使用する、56 °Cで熱不活性化された、任意の細胞培養グレードFBS。 |
| 生細胞対応蛍光顕微鏡 | Thermo Fisher Scientific | AMF7000 | 生細胞温度およびCO2制御、遠赤（励起波長~647 nm / 発光波長~670 nm）およびDAPI/ホイスト（励起波長~405 nm / 発光波長~460 nm）チャンネル用のフィルターセット、およびリソソーム構造を分解するのに十分なNAを持つ20×-40×のレンズを持つ、任意の広視野または共焦点蛍光顕微鏡。本研究ではEVOS M7000イメージングシステムが使用された。 |
| ホイスト33342核染色 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | 生細胞核染色（青色蛍光、励起波長~405 nm）用の細胞透過性DNA染料。生理的条件下では細胞透過性がないDAPIとは交換不可。 |
| イメージ解析ソフトウェア | Python Software Foundation | N/A | 核分割、核から細胞領域への拡張、強度しきい値設定、基本的なイメージ統計（例：Pythonとscikit-image、MATLAB、ImageJ/Fiji、CellProfiler）をサポートする科学計算環境。SenTrackパイプライン（補足ファイルS1を参照）が本研究用に開発された。 |
| IMR-90ヒト肺線維芽細胞（細胞株） | ATCC | CCL-186 | 複製性老化をモデル化するのに使用される正常ヒト胎児肺二倍体線維芽細胞株。同様に特性化されたヒト線維芽細胞株を代用可能。 |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific（Invitrogen） | L12492 | 酸性細胞小器官の生細胞染色用酸性トロピック蛍光染料。DMSO中の1 mMストックとして供給。使用濃度は、調製された細胞培養培地中の75 nM。 遠赤発光（ex 647 nm / em 668 nm）はリポフスチン自己蛍光との重複を最小限に抑えるが、完全には排除しない。 |
| Minimum Essential Medium（MEM） | Thermo Fisher Scientific（Gibco） | 11-095-080 | IMR-90線維芽細胞の基本培養培地。FBS 10%およびペニシリン-ストレプトマイシン1%で補完。任意のイーグルのMinimum Essential Medium（Earle's塩およびL-グルタミン入り）の標準的配合で代用可能。 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（100×） | Thermo Fisher Scientific（Gibco） | 15140122 | 完全培養培地用抗生物質サプリメント。1% v/v（最終濃度100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン）で使用。任意の標準的ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を代用可能。 |
| フェノールレッドフリーイメージング培地 | Thermo Fisher Scientific（Gibco） | A1896701 | 生細胞イメージングのバックグラウンド蛍光を低減するために使用される、フェノールレッドフリーDMEMまたはHBSS。FluoroBrite DMEMはよく使用されるオプションの一つ。10% FBSで補完された任意のフェノールレッドフリーイメージングバッファーを代用可能。 |
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4（1×） | Thermo Fisher Scientific（Gibco） | 10010023 | 細胞洗浄および試薬希釈用の等張緩衝液。pH 7.4の任意の滅菌1× PBSを代用可能。 |
| SenTrackLite v0.5.0（ソフトウェア） | オープンソース（Estrada / Melendez Lab） | v0.5.0 | リソソーム老化イメージ解析用オープンソースの単一ファイルPython / Tkinterアプリケーション。補足ファイルS1として配布。Zenodoでアーカイブ済み、doi:10.5281/zenodo.19701255。MITライセンス。ソース：https://github.com/goldbader-hub/Sentrack |
| ステージトップ環境チャンバー | Thermo Fisher Scientific | AMC2000 | 温度（37 °C）およびCO2（5%）制御を備えたマイクロスコープ上の生細胞イメージング用環境チャンバー。本研究ではEVOS Onstage Incubatorが使用された。同等のステージトップインキュベーターを代用可能。 |
再版と許可
