ヒト線維芽細胞における細胞老化の定量的評価のためのLysoTrackerを用いたリソソームプロファイリング

サマリー

本記事では、IMR-90ヒト線維芽細胞における老化期のリソソーム再構築を測定するための生細胞LysoTrackerプロトコルを紹介します。

要約

細胞老化は、細胞形態の拡大、分泌シグナル伝達の変化、顕著なリソソーム再構築などの特徴的な表現型を伴う安定した細胞周期停止状態です。セネッセント細胞は一般的に酸性エンドリソーム区画の拡張を示し、ルミナル酸度や分解能力の変化を伴い、老化関連オルガネルのリモデリングを活細胞で簡単に読み取る機会を提供します。本研究は、酸性蛍光染料であるLysoTracker Deep Redを用いて、酸性小器官区画の介密かつpH依存的な代理指標として老化負荷の相関を示す生細胞イメージングプロトコルを説明しています。この方法は、連続通過を通じて重複老化を遂げるIMR-90ヒト肺線維芽細胞で実証されています。プロトコルは細胞培養および伝達追跡、LysoTracker染色、蛍光イメージング、および細胞ごとのリソソーム信号強度および信号正向き面積の画像ベースの定量を詳細に記述しています。並行培養における老年関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)染色は、参照標準ではなく、オプションの確認マーカーとして含まれます。代表的なアウトカムでは、後期継承培養で早期継承対照群よりも高い酸性蛍光染料シグナルと溶性陽性領域が大きくなり、老化期の酸性細胞小器官の拡張と一致しています。この数値は区画体積、陽子勾配、染料の利用可能性に依存するため、リソソーム数や生合成の直接的な測定ではなく、リソソームのリモデリングの間接的な相関として解釈するのが適切です。このプロトコルは採用が簡単で、他の細胞型や老化を誘発するストレスにも適応できるため、従来のエンドポイントアッセイの実用的かつ定量的な補完を提供します。

概要

細胞老化は、さまざまなストレスや加年に関連するトリガー(1,2,3,4)によって活性化される持続的な細胞周期停止プログラムです。上層細胞は古典的に複数のマーカーの集合によって識別されます。なぜなら、単一のマーカーが完全に特異的ではないためです。特徴としては、細胞形態の拡大・扁平化、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)活性、DNA損傷焦点の形成、炎症促進分泌プロファイル(SASP)^2,4,5が含まれます。これらの特徴の中で、リソソームのリモデリングは老化の顕著かつ機能的に重要な形質として浮上しています ^6,7。上色細胞はリソソームの大きな変化を示す。これにはリソソームのサイズと数の劇的な拡大、機能の変化(しばしばリソームpHの部分的中和や未分解物質の蓄積を伴う)6,7,8,9。このリソソーム増殖はSA-β-Gal活性の増加に寄与し、これは^{老化細胞における}リソソームβ-ガラクトシダーゼ活性の上昇を反映する確立された老化マーカー^です。実際、SA-β-Gal染色は、pHが最適でない6.0の培養を用いて、酵素を蓄積しpHが若い細胞よりも高いpHを示す老化細胞リソソームに色素を選択的に沈殿させることで、この現象を利用しています(10,12,13)。

リソソームはタンパク質のターンオーバーとシグナル伝達において中心的な役割を果たしており、その調節不全は現在、老化や老化の特徴と考えられています(1,2,4,6)。沈静細胞はしばしばリソソーム機能障害を示し、その証拠としては腔内pHの上昇、酵素活性の変化、リポフシン(酸化された高分子の自己蛍光色素)の蓄積が挙げられます^6,14。リソソームの生合成は、転写因子EB(TFEB)および関連因子^6,7,15の制御のもと、協調リソソーム発現・調節(CLEAR)ネットワークを通じて頻繁にアップレギュレーションまたは変化されます。この過程は、老化細胞がストレスに適応し、分解区画^6,7,10を拡大することでリソソーム質量を増加させることがあります。逆に、老化細胞はリソソーム機能低下(例えば酸性度の低下)を経験することがあり、これがオートファジーなどのプロセスに影響を与え、強磁性細胞死を含む特定のストレスに対する耐性をもたらすことがある^6,8。したがって、リソソームの含有量と機能の測定は老化の理解と特定において中心的です ^6,16。

LysoTracker Deep Redは膜を貫通した蛍光プローブで、リソソーム膜をプロトン化によって捕捉することで酸性小器官に選択的に蓄積します^16,17。得られるシグナルはリソソーム質量ではなく、酸性区画体体積、プロトン勾配強度、局所染料の利用可能性を反映し、リソソームのpHや膜の状態の変化によって変動することがあります。^これらは総リソソーム数とは独立して起こります^。6,16。細胞老化の文脈では、細胞は老化前の対応者と比較して拡張され、より強く標識されたLysoTracker陽性区画を示します。⁹は、酸性細胞小器官の拡大と生化学的および超微構造的研究で報告されたリソソーム生合成の増加と一致しています。^6,7,10.この生細胞アプローチは、従来のエンドポイントSA-β-Gal染色に比べていくつかの利点があります。個別細胞の定量的かつ空間的に分解された解析が可能で、他の蛍光リポーターと組み合わせて使用可能で、固定を必要としず、二項エンドポイントではなく連続的な特徴を報告することで異質性を捉えることができる^6,16.このプロトコル全体を通じて、リソトラッカー信号は生細胞内の酸性細胞小器官区画の読み取りとして用いられ、状態依存の変化はリソソー^ム数の絶対的な指標として扱われるのではなく、それに応じて解釈^{されます。}

このプロトコルは、IMR-90線維芽細胞の複製老化を経るリソソーム変化をプロファイリングするためにLysoTracker Deep Redを用いる詳細を説明しています。IMR-90は正常なヒトの二倍体線維芽細胞株(女性、胎児肺由来)で、老化研究で広く用いられています。他の一次様線維芽細胞(例:WI-38)と同様に、IMR-90細胞はテロメア短縮とDNA損傷シグナル伝達により、50〜60倍の集団倍増(ヘイフリック限界)後に老化します^18,19。このプロトコルは、IMR-90細胞を培養して連続的な経過による老化誘導、形態学およびSA-β-Gal染色による老化の検証、そしてLysoTracker Deep Redで生培養を染色して蛍^{光イメージング}5^{、10、12、13}を行う方法を説明しています。画像取得と解析も含まれており、細胞ごとのリソソーム数、細胞あたりの総リソーム面積、平均蛍光強度などの定量的表示も含まれています。実験的管理および安全性の考慮事項が強調されており、染料や固定剤の慎重な取り扱い、画像撮影中の光毒性の最小化、老化細胞における細胞自家蛍光の考慮などが含まれます。この方法は複製的老化を用いて実証されますが、薬物誘発性老化(例:ドキソルビシンやエトポシド治療)やストレス誘発性早期老化(SIPS)など、酸化剤2,3,4,19,20など他のモデルにも適応可能です。いずれの場合も、LysoTrackerベースの読み取り値を適切な対照群(増殖細胞または静止細胞)と比較して、可能な限り少なくとも1つの従来の老化マーカー(SA-β-Galやp16INK4a発現など)と交差検証する必要があります。3,5,12,13。

生細胞リソソームプロファイリングは、老化細胞機能(例:分解能力や分泌活性の向上)に直接関連する重要な小器官表現型であるリソソーム拡大の再現可能かつ単細胞分解能測定を提供することで、老化アッセイにおける実用的なギャップを埋めます2,3,4,6 .LysoTracker染色は高スループット画像診断およびフローサイトメトリーと互換性があるため、薬物スクリーニング(例:セノリトティックスやリソソーム機能調節剤の検査)などの用途にも対応可能です^2,3,6。将来的には、このプロトコルによって生成される細胞ごとのリソソーム特徴は、機械学習モデルを含む下流の分類手法にも対応可能となります。このような分類器の訓練や検証は、このプロトコルの範囲外です。全体として、この手法(図1)は老化生物学におけるリソソーム側面の可視化と定量化を可能にし、老化やストレス時にリソソームの生合成や形態がどのように変化するかの洞察を提供し、老化細胞におけるリソソームを標的とした介入の検証のプラットフォームを提供します。核の分割、細胞関連領域の導出、閾値の導出、LysoTrackerの特徴量化、そしてここで示す各ウェルおよび細胞ごとの解析の再現に用いられる画像解析ワークフローは、オープンソースの補助パッケージ(SenTrackLite v0.5.0)として実装されており、補足ファイル1として提供され、引用および^{再利用のための}永続的なDOIとともにアーカイブされています。

図1:生細胞リソソーム老化アッセイの概要。 (A) 実験的なワークフロー。細胞はLysoTrackerの深紅染色剤と核染料で生染色され、標準的な蛍光顕微鏡で画像化され、検証のためにSA-β-Gal染色のために並行処理されることもあります。(B) 画像由来の細胞ごとの測定。核チャネルは個々の細胞を識別するために用いられ、核錨増殖はリソトラッカーチャネルからリソソーム関連の測定値を抽出するための細胞ごとの領域を定義します。代表的な細胞ごとの測定値には、リソソーム面積、平均LysoTracker強度、リソソーム数が含まれます。SA-β-Gal染色は、参照データセットの生成や確認時にオプションの検証ラベルとして使用できます。(C) 定量化と出力。細胞ごとのリソソーム測定値は、単純なスコアリング手法を用いて単一の細胞ごとの老化スコアまたは確率にまとめられます。出力には細胞ごとの値や、老化誘導や老化治療の条件下で比較可能なウェルレベルまたは状態レベルの老化負荷の要約が含まれます。BioRender.com で作られた
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プロトコル

IMR-90細胞は確立されたヒト線維芽細胞株であり、ヒト被験者の研究には該当しません。倫理的な承認やインフォームド・コンセントは必要ありませんでした。すべての手順は、ニューヨーク州立大学オールバニ校のバイオセーフティガイドラインに従い、バイオセーフティレベル2(BSL-2)条件下でヒト由来細胞株を対象とした研究に基づき実施されました。

1. 一般的な準備とワークフローの概要

1. 実験的目標を、LysoTrackerの深紅染色法と生核染料を用いた生細胞リソソームプロファイリングアッセイと定義し、IMR-90細胞における老化負荷の連続的な読み取りとしてリソソーム再構築を定量化すること。一次生物学的比較を以下のいずれかの設計として定義します。
   1. 老化誘導と非誘導対照群の比較。
   2. 高齢期と低齢期の条件を、線量または時系列にわたって比較します。
   3. 高齢症はセノリティック治療と比較 されます。車両処理による高老化制御。
   4. 老化が低いベースライン群と高齢化グループの両方を含む老年溶解治療シリーズ。
2. すべての実験に対して最低限の管理体制を確立すること。
   1. プレート密度、染色タイミング、画像設定に適合した老化の低い対照群を含めます。
   2. 定義された老化トリガーや後期通過の複製的老化によって生成される高老化群を含める。
   3. 各条件ごとに生物学的複製を含め、各条件下で同じタイミングで染色および画像診断を行うこと。
3. アッセイの読み取りを、リソソーム再構築の直接的な画像ベースの測定と定義します。
   1. 一貫した強度閾値を一次アッセイの読み取り値として、リソ陽性マスク内の細胞ごとの平均LysoTracker強度を測定します。単一細胞レベルでは、この指標は効果量の大きい低い老化条件と高老化条件を区別し、フィールドレベルの核密度には無感です(補足図1参照)。
   2. 以下の値を二次的な読み取りとして記録します。これらは区画拡大を記録しますが、セグメンテーションの選択やフィールドレベルの核密度により敏感です:フィールドレベルでの細胞あたりのリソソーム濃縮面積および核ごとの統合LysoTracker強度。核ごとの積分強度は、多数の場では有用ですが、核数が少ない場では、核ごとの正規化が個々の細胞に支配されるため不安定になります。
   3. 画像解像度が点点識別をサポートする場合は、任意のリソソーム点数とサイズ指標を記録します。
4. 実験的制約に応じて、並行ウェルまたはマッチしたサンプルで実施するオプションの検証ステップとして、老化関連βガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)染色を用いてください。この検証を用いて、後期継承培養が早期継承培養と比較してSA-β-Gal陽性率が高いことを確認してください。
5. データ収集前に以下の変数を固定することで、条件間でのアッセイを標準化します。
   1. LysoTrackerの作業濃度(75 nM)と染色時間(30分)です。
   2. 核染料の同定および作動濃度範囲(例:Hoechst 33342は1 μg/mLから2 μg/mL)。
   3. 対物レンズ倍率、露光時間、照明強度、ビニング、ピント戦略などのイメージングパラメータ。
   4. プレートフォーマットおよびイメージング構成(クリアボトムイメージングプレートまたはガラス底ディッシュ)、レプリケートウェルレイアウトを含む。
   5. 閾値選択と強度正規化。
      1. 実験内のすべてのウェルにてLysoTrackerチャネルに単一の固定強度閾値を適用し、ライソ正マスクを定義します。
      2. アッセイ設定時に、予想される強度範囲にわたるフィールドの校正セット(例:2つの低老化フィールドと2つの高老化フィールド)を用いて閾値を一度選択し、そのセッション内のすべてのウェルで一定に保つ。閾値が井戸ごとに変動することを許すと、測定と結果の間に循環的な依存関係が生じます。
      3. 実験間比較のために、同一のレーザー出力、露光、ゲイン設定のもとですべての条件を1回のセッションで取得し、図の凡例でこれらの設定を報告してください。
      4. セッションを横断して絶対強度比較が必要な場合は、蛍光基準基準(例:参照ビーズプレートや固定参照井戸)を含め、測定強度を適切に正規化します。
         注: 同一の獲得設定や参照に基づく正規化なしで、セッション間の生の強度値を比較しないでください。
   6. 核密度正規化。
      注: 老化培養は通常、同様の種まき時間で増殖が減少し核密度も低いため、絶対ピクセル数に基づくフィールドレベルの指標(例:溶性陽性面積)は、圃場ごとの細胞数の影響を受ける可能性があります。
      1. 生および核ごとの正規化値(生値はホエスト分割核の数で割った値)の両方を報告してください。
         注: 核ごとの正規化は密度関連の交絡を制御し、細胞ごとの解釈に適した比較となります。面積ベースの読み取りでは、正規化された値は主要な指標となり、正規化されていない合計は完全性のために保持されます。
6. ライブセル信号の品質を保ち、技術的な変動を最小限に抑える条件下で画像を取得します。染色および輸送中は早期および後期のプレートを光から保護し、画像診断時には制御された培養条件外での時間を最小限に抑えましょう。
7. 蛍光画像を単一平面、単一チャンネル、ロスレスのTIFFファイルとして保存してください。核画像とLysoTracker画像のペアリングを保持し、トレーサビリティを維持してメッキリング、ウェル、コンディショニング、再現を行う一貫した命名方式を用いましょう。チャンネルの接尾辞(例:_Hoechst.tifや_Lyso.tif)を付けた共通のベース名を使いましょう。画像は実験ごとに整理された専用フォルダに保存し、必要に応じてサブフォルダを設けます。
   注: 実用的な中断点は、早期および後期通過のコホートを特定し、後期通過培養が成長の遅さと老化様の形態を示すことが確認された後です。
8. (任意)酸素を実験変数として含め、環境下および低酸素条件下で一致したIMR-90コホートを維持します。すべてのグループを同じ方法で処理してください。

2. 細胞培養と複製老化の誘導

1. IMR-90のヒト肺線維芽細胞は標準的な細胞培養方法に従い解凍し、最小限量エッセンシャル培地(MEM)で細胞を増殖させ、10%胎児用牛血清を補完します。実験室の操作と実験設計に合致する場合は、ペニシリン-ストレプトマイシンを1%添加します。細胞は5%のCO₂で37°Cに保ちます。
2. 培養を対数的に成長し、70%から80%の合流点まで通過を維持。一貫した培地取り扱いと給餌スケジュールを用いて、実験的なランごとの変動を減らしましょう。2〜3日ごとに培養培地全体を交換してください。
   注: 培地を72時間以上変えずに放置しないでください。栄養素の枯渇や分泌因子の蓄積は、ストレス誘発性表現型を促進し、複製的老化を妨げる恐れがあります。
3. 老化率の低いベースライン群を、正常な成長行動を維持する条件下で活性的に増殖しているIMR-90培養と定義する。すべての実験グループにメッキの密度と取り扱いを一致させてください。
4. 実験目的に基づいて選ばれた以下のいずれかのアプローチを用いて、高老化群を生成します。
   1. 集団を倍増追跡しながら連続的に配序し、増殖の遅さや老化に伴う形態が明らかになるまで重複的老化を誘発します。
      注: 個体数倍増レベル(PDL)と通過数は別々の指標であり、別々に追跡されます。PDLは融解後の累積倍増を指し、各通路で次のように計算されます。
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂(収集セル / シードセル)¹⁸、
      一方、パッセージナンバーは解凍以降のサブカルチャーの数を数えます。培養は通常、約70%〜80%の合流点で1:4に分割されるため、各通路は約2回の個体群倍増をもたらし、通路数と累積PDLは互換性がありません。
      注: 高老化培養は通常、増殖が鈍化し、老化に伴う形態が明らかになる高度な個体群倍増レベルで観察されます。正確な閾値は各IMR-90ロットごとに実証的に決定すべきであり、PDLはベンダーによって異なるためです。
   2. 定義された老化トリガーを適用し、適切な表現型発生ウィンドウを設けることでストレス誘発老化。
   3. 治療による老化は、研究対象の疾患に細胞を曝露させることで、その状態が老化を引き起こすかどうかを検証することを目的としています。
5. 選択されたアプローチが、並行井戸で少なくとも1つの直交読み取りを行うことで、老化が高表現型になることを検証します。SA-β-Gal染色をオプションの検証方法として実施し、条件ごとに陽性細胞の割合を記録します。
   1. pH6.0での12〜16時間の培養後、少なくとも50%の細胞が明確な青色の核周SA-β-Gal染色を示す場合、同一^{染色条件下で}13の培養が10%以下の陽性細胞を示した場合、培養は老化高と認定されます。
   2. これらの範囲外の値は不完全な老化誘導や背景の上昇を示し、画像診断に進む前に再最適化が必要です。
      注: 老化が低いコホートと高老化のコホートを特定し、形態学および任意の検証染色によって明確な表現型の違いを確認した後の一時停止。
6. 任意: 老年溶解治療の設計
   1. 複製井戸で老化度が低い状態と高齢化状態をプレートし、細胞が付着し回復できるようにして処理を行います。
   2. 老化高濃度井戸はセノリティック化合物で処理し、車両処理による老化高コントロールも含めます。
   3. 非老化感受性を監視するために、同じ車両および該当する場合は同じ化合物濃度で処理した老化の低いグループを含めます。
   4. 治療後、すべての状態に対応して一定時間にリライブライソトラッカーと核染色を行ってください。
7. 後期の排出・治療進行中の培養を監視し、形態や成長パターンを記録します。増殖の遅化、形態の拡大・平坦化、細胞質粒度の増加によって老化培養を識別する。成長停止が明らかになったら、培養を老化高コホートとして維持し、染色と画像診断を行い、それ以上の移行は避けてください。
8. 培養維持中の交絡ストレス要因を最小限に抑えるために、一貫した培地準備、一定の給餌スケジュール、インキュベーター外での取り扱い時間の一貫を用いましょう。温度変動、制御されたCO₂の外での長時間の時間、不均一なメディア温暖化を回避可能な技術的変動の原因として扱う。
9. 任意:常温酸素と低酸素の両方でマッチング培養を維持すること。培養物は21%のO₂以下と5%以下の培養物を別々のコホートとして維持し、可能な限り通常の培養取り扱い時には各コホートを割り当てられた酸素状態に保つこと。移送時の周囲酸素曝露を制限し、低酸素コホートの画像診断準備を行います。
   注:実用的な一時停止点は、早期継代および後期継代のコホートを定義・安定化し、遅期継代培養が一貫して成長の遅さと老化に伴う形態を示すことを確認する場合です。

3. LysoTracker Deep Redおよび核染料を用いた生細胞リソソームおよび核染色

1. IMR-90セルをすべての実験条件下でクリアボトムイメージングプレートまたはガラス底プレートでプレートします。選択トリガーによって生成される老化低下対照条件と少なくとも1つの老化高状態を含め、それぞれの条件に対する生物学的複製を含めること。
2. 染色当日に細胞を種付けしてサブコンフルな単分子層を形成します。各実験ごとにシーディング密度とメッキと染色の間の時間を記録し、ランごとに比較可能にします。
3. 全培養培地を37°Cまで温めます。 温めた媒体に75 nMでLysoTrackerのディープレッド作業液を準備し、光から保護します。作業液は、1 mM LysoTracker Deep Red ストック(製造元がDMSOで供給)を温めた完全培養培地で1:13,333 希釈して調製されます(例:1 mMストック10 mLあたり0.75 μL)。
   注: 遅期通過およびストレス誘発性老化細胞は、リポフスシンやその他の非特異的自己蛍光物質を蓄積し、これらは広い波長範囲にわたって放出され、染色されていない対照群において見かけのLysoTrackerシグナルに寄与することがあります¹⁴。特定の実験における自己蛍光の寄与を推定するには、各条件に少なくとも1つの染色されていない井戸を含め、同一のイメージング設定で取得します。染色済み井の平均信号を染色済み井戸の測定値から差し引くか、生値と背景値の両方を報告します。
   注:実際には、IMR-90培養中の染色されていないLysoTrackerチャネル信号は染色された老化信号に比べて小さく(本データセットの染色老化平均の約5%から10%)、しかし通過回数とともに寄与は増加し、深層老化またはオンコジーン誘導の老化培養では20%を超えることもあります^6,14.新しい細胞タイプや老化誘導モデルにこのプロトコルを採用する際は、必ず自己蛍光の大きさを確認してください。
4. 流路で染色されるすべての井戸に対して十分なLysoTracker作業液を準備してください。作業液を優しく逆さまに混ぜ、使用まで光から守ってください。
5. 各井戸から使用済みの中液を吸引します。LysoTrackerの作業液をウェルの壁に沿って優しく加え、単一層を乱さず、ウェル全体で一定の染色量を維持します。
6. 細胞を37°C、5% CO₂で30分間培養します。すべての実験群を同じ培養期間と温度に保ちます。
7. LysoTrackerの孵化の最後の10分間に生核染料を追加してください。Hoechst 33342をメーカー推奨の作動濃度(例えば1 μg/mLから2 μg/mL)で直接LysoTracker含有培地に加え、プレートを優しく揺らして混合します。
8. 孵化の終わりに染色培地を取り除きます。一度、予温化されたリン酸塩緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、背景蛍光を減らします。
9. 洗浄直後に予め温めたフェノールレッドフリー培養培地またはイメージングバッファーを追加してください。直接ライブイメージングに進み、実験内のすべてのウェルでバッファ交換と画像取得の間に一定の時間を保ちます。
10. 転写や画像設定の際には、プレートを光から守りましょう。取り扱いや画像取得の際、温度管理およびCO₂条件外での時間を最小限に抑えましょう。
    注意: 蛍光染料は手袋と目の保護具を使って取り扱ってください。染料を含む液体や汚染された消耗品は、機関の化学物質安全手順に従って処分してください。
    注: イメージングで複数のプレートをステージングする必要がある場合は 、Step 3.9 の後に一時停止ポイントを設けてください。プレートは37°Cで光から保護し、染色ドリフトを抑えるためにできるだけ早く画像撮影を再開してください。
    注: 実験設計に酸素を変数として含める場合は、染色および培養中に各コホートを割り当てられた酸素条件内で維持し、割り当てられた条件外の取り扱い時間を記録します。

4. 検証のためのSA-β-Gal染色(任意)

1. SA-β-Gal染色を任意の検証ステップとして用い、高老化状態が低老化対照群に比べてSA-β-Gal活性が増加していることを確認しましょう。同じプレートフォーマットで同じ取り扱いタイムラインで処理された並列ウェルの検証を行います。
2. 固定前に検証井戸のライブ画像を完成させます。同じフィールドのマッチング前・後固定比較(図2)、取得時のステージ座標を記録し、固定と染色後に各フィールドを手動で再配置し、核位置や細胞形態を視覚的にスポットチェックして一致フィールドが一致しているかを確認し、後続解析に含めます。
3. 推奨される1倍の作動濃度で調製されたSA-β-Gal染色キットの固定液(ホルムアルデヒド2%とグルターアルデヒド0.2%)を使用して固定細胞を設置します。室温で10分から15分孵育します。参考までに、固定液にはリン酸緩衝食塩水中に2%(w/v)のホルムアルデヒドと0.2%(w/v)のグルターアルデヒドが含まれています。pH 6.0のSA-βガロン染色液には、使用直前にジメチルホルマミドに溶解した1 mg/mL X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)、pH 6.0の40 mMクエン酸・リン酸ナトリウムバッファー、5 mMのフェロシアン化カリウム、5 mMのフェリシアン化カリウム、150 mM NaCl、2 mM MgCl₂^12,13が含まれています。これらの仕様に合致する市販キットは、染色バッファーのpHが6.0で検証されていれば、互換性を持って使用できます。
4. 固定液を除去し、リン酸塩緩衝生理食塩水でウェルを2回洗い流します。各ウェルにpH6.0のX-ガロン基質を含むSA-βガロン染色液を加えます。
5. 培養中の蒸発を抑えるためにプレートを密閉してください。プレートを37°CのCO₂フリーインキュベーターに12〜16時間置きます。
6. ブライトフィールド顕微鏡で井戸を検査し、染色パターンを記録します。各状態の代表画像を取得し、結果検証時に各ウェルあたりのSA-β-Gal陽性細胞の割合を報告します。
   注意: ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは有毒で揮発性があります。化学換気フードで固定液を準備・使用し、手袋、保護眼鏡、白衣などの適切な個人用防護具を着用してください。
   注: SA-β-Gal染色で老化-低制御で高い背景、または老化-高条件下で弱い染色が見られた場合は、板金密度、固定時間、培養期間、温度一貫性を調整した後、緩衝pHを6.0に保ったまま再度検証を行います。

結果

このプロトコルを低老化・高老化条件下のIMR-90線維芽細胞に適用すると、単一細胞レベルで、必要に応じて全圃場レベルでも要約可能な定量的なリソソーム表示が得られます。

図と表に示される代表的なデータセットは、13番(P13;低老化、~PDL 26)と23番(P23;高齢、~PDL 46)のIMR-90培養を比較した単一の生物学的実験に基づいています。各条件につき2本の井戸が画像化され、1井戸あたり44フィールド(合計176フィールド、各条件88フィールド)を取得しました。図2Dの各井戸相関は、これら44個のフィールドの平均から計算されており、n=4点(条件ごとに2点)です。 表1 および 補足表1 は、各条件ごとに代表的な20×フィールドを1つ報告しています。これら2つの表は条件ごとに両方の井戸をカバーしています(P13の場合はB01およびA01;P...

ディスカッション

このプロトコルは、リソソームのリモデリングを通じて老化を測定し、細胞ごとおよびウェルごとの老化負荷の定量的読み取りを生成する生細胞イメージングワークフローを記述しています。信頼できるアッセイを得るためには、特に重要なステップがいくつかあります。まず、生物学的モデル自体を適切に制御しなければなりません。IMR-90線維芽細胞における複製老化の誘導には、個体群倍増の綿密な追跡と初期通過培養の並行管理が必要であり、非老化の基準^参照2,3,18です。通過履歴や合流の小さなずれが老化細胞の割合をずらし、その結果アッセイのダイナミックレンジを変化させます。第二に、リソソームおよび核染色条件は厳格に標準化されなければなりません。LysoTrackerの濃度、培養時間と温度、核染色の曝露はすべて信号強度と分断品質に影響を与えます。最後に、画像設定やプレートの取り扱いは、蛍光の違いが焦点のずれや不均一な...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェル組織培養プレート（底面フラット、TC処理済み）	CellTreat Scientific Products	229124	生細胞蛍光イメージングと互換性のある透明底多重培養プレート（例：6、12、または24ウェルTC処理済みポリスチレンプレート；高解像度イメージングにはガラス底イメージングプレートが好ましい）。
ベータガラクトシダーゼ染色キット（老化アッセイ）	Cell Signaling Technology	9860	SA-β-ガラクトシダーゼ検出用商用キットで、pH 6.0の染色バッファーが検証されている。参考までに、固定液はPBS中の2%ホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドを含み、染色液はDMF中の1 mg/mL X-gal、40 mMクエン酸/リン酸 pH 6.0、5 mMカリウムフェロシアニド、5 mMカリウムフェリシアニド、150 mM NaCl、2 mM MgCl2を含む。
BioRender（科学的イラストソフトウェア）	BioRender	N/A — ウェブアプリケーション	図表（図1–3）の作成に使用。https://www.biorender.com
炭酸ガス（CO2）、圧縮シリンダー	Airgas（または類似のサプライヤー）	N/A	細胞培養インキュベーターおよびステージ上イメージングチャンバーで5%の雰囲気を維持するために使用される医療グレードのCO2。
胎児ウシ血清（FBS）、熱不活性化	Thermo Fisher Scientific（Gibco）	10082147	完全培養培地に10% v/vで使用する、56 °Cで熱不活性化された、任意の細胞培養グレードFBS。
生細胞対応蛍光顕微鏡	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	生細胞温度およびCO2制御、遠赤（励起波長~647 nm / 発光波長~670 nm）およびDAPI/ホイスト（励起波長~405 nm / 発光波長~460 nm）チャンネル用のフィルターセット、およびリソソーム構造を分解するのに十分なNAを持つ20×-40×のレンズを持つ、任意の広視野または共焦点蛍光顕微鏡。本研究ではEVOS M7000イメージングシステムが使用された。
ホイスト33342核染色	Thermo Fisher Scientific	H3570	生細胞核染色（青色蛍光、励起波長~405 nm）用の細胞透過性DNA染料。生理的条件下では細胞透過性がないDAPIとは交換不可。
イメージ解析ソフトウェア	Python Software Foundation	N/A	核分割、核から細胞領域への拡張、強度しきい値設定、基本的なイメージ統計（例：Pythonとscikit-image、MATLAB、ImageJ/Fiji、CellProfiler）をサポートする科学計算環境。SenTrackパイプライン（補足ファイルS1を参照）が本研究用に開発された。
IMR-90ヒト肺線維芽細胞（細胞株）	ATCC	CCL-186	複製性老化をモデル化するのに使用される正常ヒト胎児肺二倍体線維芽細胞株。同様に特性化されたヒト線維芽細胞株を代用可能。
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific（Invitrogen）	L12492	酸性細胞小器官の生細胞染色用酸性トロピック蛍光染料。DMSO中の1 mMストックとして供給。使用濃度は、調製された細胞培養培地中の75 nM。  遠赤発光（ex 647 nm / em 668 nm）はリポフスチン自己蛍光との重複を最小限に抑えるが、完全には排除しない。
Minimum Essential Medium（MEM）	Thermo Fisher Scientific（Gibco）	11-095-080	IMR-90線維芽細胞の基本培養培地。FBS 10%およびペニシリン-ストレプトマイシン1%で補完。任意のイーグルのMinimum Essential Medium（Earle's塩およびL-グルタミン入り）の標準的配合で代用可能。
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（100×）	Thermo Fisher Scientific（Gibco）	15140122	完全培養培地用抗生物質サプリメント。1% v/v（最終濃度100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン）で使用。任意の標準的ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を代用可能。
フェノールレッドフリーイメージング培地	Thermo Fisher Scientific（Gibco）	A1896701	生細胞イメージングのバックグラウンド蛍光を低減するために使用される、フェノールレッドフリーDMEMまたはHBSS。FluoroBrite DMEMはよく使用されるオプションの一つ。10% FBSで補完された任意のフェノールレッドフリーイメージングバッファーを代用可能。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4（1×）	Thermo Fisher Scientific（Gibco）	10010023	細胞洗浄および試薬希釈用の等張緩衝液。pH 7.4の任意の滅菌1× PBSを代用可能。
SenTrackLite v0.5.0（ソフトウェア）	オープンソース（Estrada / Melendez Lab）	v0.5.0	リソソーム老化イメージ解析用オープンソースの単一ファイルPython / Tkinterアプリケーション。補足ファイルS1として配布。Zenodoでアーカイブ済み、doi:10.5281/zenodo.19701255。MITライセンス。ソース：https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
ステージトップ環境チャンバー	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	温度（37 °C）およびCO2（5%）制御を備えたマイクロスコープ上の生細胞イメージング用環境チャンバー。本研究ではEVOS Onstage Incubatorが使用された。同等のステージトップインキュベーターを代用可能。