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方法論記事

OS-DCE OAI を用いたがんおよび創傷治癒の前臨床モデルにおける酸素供給および血管灌流の評価

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DOI：

10.3791/70689

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2026年4月7日

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1Department of Medical Physics, University of Wisconsin, 2University of Texas MD Anderson Cancer Center

この記事について

サマリー

ここでは、がんおよび創傷治癒の前臨床モデルを評価するための酸素感受性・動的造影強化光音響画像(OS-DCE OAI)を行うプロトコルを紹介します。OS OAIはオキシおよびデオキシヘモグロビンのイメージングを行い、組織の酸素化マッピングを行います。DCE-OAIは外因性造影剤の薬理動態を画像化し、血管灌流のマッピングを行うことができます。

要約

酸素感受性光音響イメージング(OS OAI)および動的造影強化光音響イメージング(DCE OAI)は、組織生理学の補完的かつ非侵襲的な読み取りを提供します。OS OAIは内因性オキシヘモグロビンおよびデオキシヘモグロビンの多スペクトル検出を活用し、血中酸素飽和度(%sO₂)のマップを作成し、一方でDCE OAIは近赤外吸収体の 生体内 薬物動態を追跡して血管灌流と透過性を定量化します。本プロトコルの目的は、オルトトピック乳がん腫瘍と全層皮膚創傷という2つの広く使われている前臨床環境において、酸素供給と灌流の同時評価を可能にする統一されたOS-DCE OAIワークフローを提示することです。

本プロトコルでは、乳がんや裂傷のマウスモデルのOAIを示しました。OS OAIでは、700〜875 nmでマルチスライス多波長スキャンを取得し、スペクトルアンミックスと%sO₂の推定を可能にします。DCE OAIでは、時間とOAの信号振幅曲線を生成するために、700-875 nmの多波長サンプリングまたは800 nmの単一波長サンプリングを用いて、時間対OA信号振幅曲線を生成するために、時間とOAの信号振幅曲線を生成するために、時間分解能で時間分解能を≤秒の時間分解能で繰り返し取得します。動物モデルの開発、OAイメージングの準備、OSのOAIおよびDCE OAI取得、酸素供給および血管灌流の特性測定のための解析、さらに運動アーティファクト、表層吸収体、失敗注射に関する重要なトラブルシューティングガイダンスも詳細に示しています。

このOS-DCE OAIプロトコルを組み合わせることで、低酸素症と血管輸送の機能的ポートレートを統合し、腫瘍や創傷の生理学的変化を解剖学的測定よりも早く検出できます。OS-DCE OAI は他の疾患モデルにも容易に適応可能です。

概要

光音響イメージング(OAI)は、フォトアコースティックイメージングまたは多波光オプトアコースティックトモグラフィーとも呼ばれ、光励起と超音波(超音波)検出を組み合わせて深部組織イメージングを可能にする比較的新しいモダリティです1,2。OAIでは、短時間ナノ秒のレーザーパルスがオキシヘモグロビンやデオキシヘモグロビンなどの内因性クロモフォアを励起し、局所的な熱弾性膨張と広帯域の音響波を発生させ、これらは米国トランスデューサーによって検出されます。これらの信号により、OAIは超音波のような空間分解能で光学コントラストのある画像を生成しつつ、生体内でセンチメートルスケールの画深を達成することを可能にします。複数の波長でデータを取得し、スペクトルアンミックスを用いて解析すると、酸素感受性(OS)OAIは酸素およびデオキシヘモグロビンの相対濃度を推定し、組織の酸素飽和度(%sO₂)2を推定できます。血中酸素飽和度は、他の方法では非侵襲的に得られない微小血管生理学の機能的評価を提供します。

血管灌流は微小血管生理学の評価にも有用です。血管灌流は、血管の流れ、透過性、血管表面積の組み合わせを表します。灌流を定量化するために、OAIは外因性造影剤と併用して動的造影強化OAI(DCE OAI)を行うことができます。このアプローチでは、造影剤注射の前後に時間的イメージングを行い、薬剤の薬理動態(PK)を監視します。これらの結果は、血漿区画から腫瘍細胞外血管区画への洗浄速度(NKtrans)と腫瘍細胞外血管区画から血漿区画への洗浄速度(kep)を測定するためにモデル化できます。私たちは、組織内で放射エネルギーが変動する散乱や吸収という悪名高い問題を回避するPKモデリング手法を開発しました。我々の手法では、動的OAI信号の変化を0%(注入前)から100%(最大強化)に正規化し、微分方程式を用いてNKトランスウォッシュイン率とkepを推定します。他のDCE OAI研究では、光のフルエンスが組織全体で均一であるという主要な仮定に悩まされる標準的なPKモデリング手法が用いられています5,6。

DCE OAIの結果は、最大信号強化(MSE)、MSE到達までのピークまでの時間(TTP)、傾斜(通常TTPへの注入時)、および曲線下の初期面積(IAUC;これも通常は注入後のTTP注入時)を経験的に測定することで、ウォッシュイン率を評価するためにも利用できます7。TTPがPK曲線の後半で起こる場合、傾斜またはIAUCは曲線の線形部分または注入時から注射後1分まで測定できることに注意してください。腫瘍モデルへの治療評価や創傷治癒の評価においても、実証的測定が有用であることを示しました8,9。他の研究でも、腫瘍血管透過性や肝線維症の評価に実証的測定を用いることに価値があることが示されています10,11。PK曲線の形状は、腫瘍の血管灌流を高または低に定性的に分類するためにも用いられます。

さらに、注射後の単一の時刻点におけるOAI信号は、非動的造影強化OAI(CE OAI)15として知られる灌流の経験的評価として利用できます。明るい腫瘍や創傷を示すCE OA画像は単純で非常に視覚的ですが、しばしば高灌流と低灌流の定性的評価にのみ用いられます。一般的に、TTP後のOAI信号の動的変化は、腫瘍における血管灌流を経験的に評価するために分析されていません。しかし、以下に示すように、創傷の洗浄率は非常に速いため、NKトランス、TTP、傾き、IAUCの測定が困難です。したがって、ウォッシュアウト相の線形または指数的傾きを創傷における血管灌流の経験的指標として用いています。

ほとんどのOAI薬剤は近赤外線(NIR)波長帯で吸収し、組織により深く浸透することができます16,17。しかし、900 nmを超える波長での水分吸収は、ほとんどの用途で生体内でのOAI波長範囲を700〜900 nmに制限します。インドシアニングリーン(ICG)は、780〜800nmで強い近近紅外吸収を提供し、中程度強いOAI信号を生成し、臨床使用のためのFDA承認による良好な生体適合性を持つことから、DCE OAIのプロトタイプ薬です。これらの特徴により、血管内造影や解釈可能なPK曲線が判明します。

私たちは、前臨床モデルにおける固体腫瘍および創傷8,9における酸素供給および血管灌流を評価するためのOS-DCE OAIプロトコルを開発しました。このプロトコルのOS部分は、マウスモデルの腫瘍や創傷体積全体をカバーできる複数の画像スライスでの酸素供給を評価することができます。私たちのプロトコルのDCE部分には、腫瘍や創傷の単一のスライスを複数のレーザー波長で撮影するオプション(造影剤検出の精度向上)もあれば、最大5つのスライスを単一のレーザー波長で撮影するオプションがあり(空間的カバレッジの向上)。放射線治療または血管湒�乱剤であるコンブレタスタチンA4リン酸を用いた腫瘍モデル治療後の酸素供給および血管灌流の変化を監視するためにOS-DCE OAIを用いています。また、OS-DCE OAIを使って創傷の治癒をモニタリングしています。DCE OAIは、さまざまな疾患に適用可能な血管灌流による進行を監視する能力を提供します。

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プロトコル

すべての手続きは、所属機関の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)の承認のもとで実施してください。以下のプロトコルのすべての手技は、当機関のIACUCによって承認されています。

1. 麻酔(後の処置用)

  1. 麻酔を誘発しろ。最初は100%酸素キャリアガス中に5%イソフルランを投与し、マウスが目覚めなくなるまで麻酔を誘導・維持します。
  2. 麻酔は維持してください。100%酸素キャリアガスに1.5〜2%イソフルランを投与し続けます。ペダル反射がないか確認してください。
  3. 常温維持。動物を温かい場所で管理し、麻酔期間中は体温を監視してください。
    注意:(間)動物が完全に麻酔されたら腫瘍の着床または創傷形成に進みます。

2. モデルの準備

注意:すべての細胞解析は、曝露や汚染のリスクを避けるため、バイオセーフティキャビネット内で行うべきです。

  1. 4T1オルトトピック腫瘍モデルを確立します(図1)。
    1. 氷上の細胞準備:4T1細胞を氷のように冷たいPBSに2 ×10 7 cells/mLの濃度で再懸濁させます。
    2. 細胞とマトリックスを混ぜる:細胞懸濁液を1:1(v/v)と、細胞外マトリックスが豊富な氷のように冷たい生物ハイドロゲルと混同します。この組み合わせにより、1×107 cells/mLの細胞溶液が得られます。
    3. 注射器を装填:細胞混合物を1.0mL以下の無菌実験室用注射器に充填します。1回の注入で100μL(1×10個6 セル)に容量を制限してください。オプションとして、注射器を30°Cまで優しく温めることで、生物的ハイドロゲルがやや粘性を持ち、注射部位により焦点が留まります。
      注意:注射器は鋭利であることに注意し、キャップの交換は避けてください。
    4. 第1節で説明した通りにマウスを麻酔します。
    5. 毛がある場合は除去:胸パッドの部分を脱毛します。アティミックなヌードマウスを使う場合はこのステップを省略してください。
    6. 針を位置づけて注射する:4番目の鼠径部乳房脂肪パッドを消毒してください。針の面取りを挿入し、脂肪パッドに100μLをゆっくりと注入して逆流を防ぎます。
    7. 麻酔から動物を回復させる:マウスを温めたケージに戻し、歩けるようになるまでモニタリングします。
    8. 腫瘍の成長を待つ:4T1腫瘍が最小直径0.3cmに達するまで8〜10日間、画像検査を行います。
      注:直径の大きい腫瘍も画像診断が可能です。腫瘍の直径は校正済みのバーニアキャリパーで測定できます。IACUC(または同等の機関委員会)が承認した最大直径を超える腫瘍は安楽死させるべきです。オルトトピック注射に従い、細胞数や体積を希望の移植プロトコルに合わせて調整してください。
  2. マウスにおける切除創の生成(図2)
    1. 手術部位の準備:作業エリアと器具を消毒してください。
    2. 第1節で説明した通りにマウスを麻酔します。
    3. 毛がある場合は除去:背側の毛を脱毛してください。アティミックなヌードマウスを使う場合はこのステップを省略してください。
    4. 鎮痛を投与する:マウスを無菌の手術表面に固定します。背側領域にブプレノルフィンを皮下注射(SC)します。
    5. 創傷部位を消毒する:背側の皮膚をポビドンヨウ素で消毒し、その後70%エタノールを消毒します。
    6. 切除創を作る:6mm生検パンチで部位を輪郭を描きます。皮膚とパニクルス・カルノススを切除し、全層の欠損を形成します。
    7. シリコーンスプリントを装着する:
      1. 傷口の周りにドーナツ型のシリコンスプリントを中心に装着します。裂け目の内径が傷口の直径より2〜4mm大きく、添え木の幅は~5mmにしてください。
      2. シリコーン素材のシートからドーナツ型のシリコーンスプリントを切り取ります。透明な縫合材を使って添え木を縫い付けます。必要に応じて、薄い接着膜を使ってリングを固定してください。
        注意:色素付き縫合材料は近近紅外線(NIR)光を吸収する可能性があるため、使用すべきではありません。
    8. 添え木を縫合する:8本の間隔を均等に間隔で断続的に縫い合わせ、窒息せずに周囲の皮膚に添え木を固定します。
    9. 閉塞性ドレッシングを装着する:傷口と添え木を包み込み、ベッドを保護し創傷環境を整えましょう。
    10. 麻酔から動物を回復させる:マウスを温めたケージに戻し、歩けるようになるまでモニタリングします。
    11. 動物の治癒を待つ:研究デザインまたは傷が完全に治癒するまで、毎日のケアと評価を継続してください。
    12. 毎日ドレッシングを交換する:画像検査や写真撮影後、汚染を抑え滅菌性を維持するために、閉塞性ドレッシングを毎日交換してください。
      注意:(重要なステップ)傷口を添え木で固定して収縮を抑え、再上皮化を促進し、人間の治癒における翻訳的関連性を高めましょう。(間)ドレッシングを塗布した後は、次の予定された評価や画像診断まで一時停止してください。

3. OS-DCE OAI 取得プロトコル

  1. マウスと造影剤をOAIスキャン用に準備します。
    1. 造影剤を準備しろ。
      1. 無菌水中で1.62 mMのICG造影剤溶液を準備します。溶液を0.3μmのシリンジフィルターでろ過します。この溶液を100μμLの無菌実験用注射器に充填します。
        注:この用量は、ICG分子量775 g/molに基づく162 nmolまたは125.5 μμgです。マウスの体重は約20gであることを考えると、用量は6.28 mg/kgです。動物用量相当は人間の同等量18の12.3倍です。したがって、人間の同等量は体重の0.51 mg/kgとなります。人間の最大耐容量は2 mg/kgです。したがって、この前臨床試験で使用された用量は、ヒトにおける最大耐容量の約1/4に相当します。
    2. OAIスキャナーを準備しろ。
      1. イメージングタンクに脱イオン化の蒸留水を入れてください。体重<25gのマウス用に水槽の温度を36°Cに設定します。
        注意:この水槽の温度は、ネズミがクレードル内でビニール袋に包まれているため、体温を37°C近くに保ちます。大型マウス(体重>25g)の場合、過熱を避けるためにタンクの温度は35°Cに設定すべきです。大型マウスは断熱層として多くの皮下脂肪組織があるためです。
    3. 第1節で説明した通りにマウスを麻酔します。取得プロトコルの残りの期間は、マウスを1.5〜2%のイソフルランで100%酸素キャリアガスに麻酔状態に保ちます。
    4. DCE OAIを行う場合は静脈アクセスを挿入してください。
      1. 27Gの尾静脈カテーテルをヘパリン化生理食塩水で洗浄してください。カテーテルを外側尾静脈に挿入し、尾静脈から外れないように固定します(図3A)。気泡が存在しないか確認してください。
        注意:(重要なステップ)カテーテルの通通性を維持するためにヘパリン化生理食塩水を使用してください。
      2. さらに、カテーテルに接続可能な容量が500μL以下の無菌実験用シリンジを準備してください。注射器に2.14 mM ICGを100 μL(20 gマウスで~322 nmol、~16 μmol/kg)を必ず含めてください。
    5. マウスとクレードルを超音波ジェルで覆います(図3B)。
      1. 腫瘍または創傷部位に透明な超音波ジェルを薄く塗布します(図3C)。また、クレードルと腫瘍や創傷の部分の間に超音波ジェルを塗布して密着させます。
        注意:気泡を除去してください。オプションとして、超音波ゲルは遠心分離機で空気を除去してから使用することもあります。また、厚いジェル層で気泡ができるのを避けるため、超音波用ジェルは最低限使用してください。
    6. マウスをクレードルに入れる(図3D):機器の製造説明書を参照してください。マウスをホルダーに入れ、マウスの鼻をしっかり鼻の内側に固定します。手錠を使ってネズミの手足を固定してください。トゥースループを使って頭部を安定させてください。
      1. (任意)ネズミを撮影するときは、ネズミの鼻コーンをつけたクレードルを使いましょう。ネズミの鼻錐はネズミの頭をゆりかごの底から持ち上げるため、少量の水がゆりかごに漏れても誤って溺れるのを防ぐことができます。
    7. マウスとクレードルをOAI機器に入れます。楽器の製造説明書を参照してください。
      1. マウスクレードルに漏れがないか観察してください。漏れがある場合は、マウスとクレードルを機器から取り外し、誤って溺れないようにネズミをクレードル内で再度密封してください。
      2. DCE OAIを希望する場合は、造影剤を使ったカテーテルを注射器に接続してください。
    8. 画像取得前にマウスのバランスを取る:画像取得前に温水タンク内でマウスの生理状態を安定させるために10分間待つ(図3E)。
    9. マウスをOAIトランスデューサーに対して位置付けします:
      1. 製造元の指示に従ってマウスまたはOAIトランスデューサーを移動させ、腫瘍や創傷が多層画像セット内に位置するようにしてください。
      2. 画像セットに合わせて音速を最適化しましょう。このステップは、画像診断前にマウスが平衡化されている間に完了します(ステップ3.1.7)。
      3. (重要な一歩)すべてのマウスで動物の向きや切片位置を一貫させ、厳密な結果を確実にしてください
  2. OSのOAIパラメータを設定してください。
    1. 画像スライスパラメータを選択し、腫瘍または創傷全体を1mmのスライス厚で覆う複数のスライスを撮影します。
    2. 吸収波長を選択します。OS OAIでは、700、730、760、800、850、875 nmの吸収波長を選択します。
    3. 信号平均を用いる:次の波長を取得する前に、次のイメージングスライスに進む前に、各波長あたり10の平均を取得するパラメータを選択します。波長あたり10の平均値により、各画像スライスの信号対雑音比率が増加します。
    4. 繰り返し回数を設定します:
      1. 表1に示されたように繰り返し回数を設定し、総習得時間を約2分に保ちます。10Hzの繰り返し率を持つ機器のユーザーの場合、1画像スライスあたりの総取得時間は6.0秒です。
      2. マウスを次のイメージングスライスに移動し、最初のスライス位置に戻るには平均0.2秒かかるため、各スライスあたり6.2秒かかります。
      3. 測定の安定性を確保するために最低3回の繰り返しを行います。繰り返し回数が増えたい場合は、総習得時間が2分を超えることも許容されます。
  3. OSのOAイメージを取得してください。
  4. DCE OAIパラメータを設定してください。
    1. 複数の波長を持つシングルスライスイメージングプロトコルのDCE OAI取得パラメータを設定します。
      1. イメージングスライスを位置決める。腫瘍または創傷部位を中心に位置し、厚さ1mmの画像切片を≤5枚選びます。
      2. 造影剤の最適な吸収波長を選択します。イン ビブ 環境でのインドシアニングリーンの場合、波長を800nmに設定します。
      3. 平均回数と反復回数を 表2に示すように設定します。これらの推奨事項は、10Hzの画像反復率を持つOAI機器のユーザーにとって、5秒≤時間分解能と総取得時間11.0〜11.2分を維持します。
        注意:異なる画像重複率を持つ他の機器のユーザーは、各画像セットで時間分解能を≤5秒維持するために平均数を調整する必要があります。
    2. ステップ3.4.1の代替として、単一波長のマルチスライスイメージングプロトコルのDCE OAI取得パラメータを設定します。
      1. イメージングスライスを位置決める。腫瘍または創傷部を中心に位置し、厚さ1mmの5枚の画像切片≤選択します。
      2. 造影剤の最適な吸収波長を選択します。イン ビブ 環境でのインドシアニングリーンの場合、波長を800nmに設定します。
      3. 平均回数と反復回数を 表2に示すように設定します。これらの推奨事項は、10Hzの画像反復率を持つOAI機器のユーザーにとって、5秒≤時間分解能と総取得時間11.0〜11.2分を維持します。
        注意:異なる画像重複率を持つ他の機器のユーザーは、各画像セットで時間分解能を≤5秒維持するために平均数を調整してください。
  5. DCE OA画像を取得してください。
    1. ベースライン画像の記録:取得を開始し、12セットの画像を収集します(~1分)。
    2. 造影剤を注射する:取得を続けながらカテーテルから100μLを投与します。
      注意:ボラス注射は、繊細な尾部静脈内のカテーテル内の圧力の蓄積を防ぐため、約10〜15秒間一定にとどめるべきです。この一貫性は、手動注射時にシリンジプランジャーに一定の圧力をかけるか、自動インジェクターを使用することで制御できます。重要なのは、10〜15秒の注射速度が腫瘍への初期投与を滑らかにし、注射タイミングの速さによるPK曲線のファーストパス速度学の急上昇を生じさせないため、PKのモデリングと経験的測定解析を向上させます。
      1. (重要な一歩)注射部位の造影剤が血管から周囲組織に漏れるのを防ぎ、正確なボーラスタイミングを保ちます。
    3. 画像撮影を継続:残りの128枚の画像セットを、注射後10.2分分に取得し、ウォッシュイン/ウォッシュアウトの動態を捉えてください。
    4. 画像取得のため画像処理を監視する:マウスの呼吸数を監視し、スキャン中のマウスの生理機能が安定しているか確認する。
    5. マウスとクレードルを楽器から外す:マウスをクレードルから外す。マウスが麻酔から回復するまで待ってください。ネズミを温めたケージに戻し、歩けるようになるまで観察してください。
      注意:適切なソフトウェアを使用し、OAI機器の製造説明を参照してください。以下のステップは、viewMSOT v4.0ソフトウェアおよびMatlab R2019bまたはそれ以降のMatlabソフトウェアを使用するOAI機器の再構築および解析手順を説明しています。

4. OS-DCE OAI結果分析

  1. OA画像を再構築してください。
    1. 画像再構成パラメータを選択する:50 kHz–6.5 MHzのバンドパスフィルターを用いたフィルタ付きバックプロジェクション法を用いて画像再構成を設定し、自動パルス間エネルギー補正を有効にします。
    2. すべての画像を再構築する:すべてのレーザー波長、すべての画像スライス位置、すべての時間点で画像を取得します。この大量のデータには画像再構成にかなりの時間が必要になることがあります。
  2. OSのOAイメージを分析してください。
    1. クロモフォアのアンミックス:スペクトルアンミックスを行い、オキシヘモグロビン(HbO)、デオキシヘモグロビン(Hb)、総ヘモグロビン(HbT = HbO2 + Hb)、および%sO2(ここで%sO2 = HbO2/HbT)のパラメトリックマップを生成する。
    2. ROIの定義:
      1. 各画像スライスで腫瘍や創傷を表すROIを手動で描きます。腫瘍周辺や創傷周辺のピクセルを除外する方向に偏った保守的な投資報酬率(ROI)を算出してください。
      2. 代わりに、1つは腫瘍の縁を表すROI、2つ目のROIは腫瘍コアを表すものを手動で描く方法もあります。腫瘍の縁は腫瘍コアよりも血管化が強い場合があり、サブリージョン解析に有用な可能性があります。
        注:腫瘍や創傷のサブリージョンの追加ROIを描画したり、HbO2、Hb、HbT、または%sO2 のピクセル単位の値を評価することは可能です(ROI不要)が、これらの小さな領域は信号対雑音比が低いため、測定精度が不正確になります。
      3. 各波長と時間点ですべての画像でROIの位置を一貫性に保ちましょう。
    3. 腫瘍全体の平均パラメータを計算します。
      1. 各画像スライスおよび各時点における腫瘍ROIまたは創傷ROIにおけるHbO2、Hb、HbT、%sO 2の平均値を計算します。
      2. マルチスライスOSのOAIでは、すべての画像スライスからHbO2、Hb、HbT、%sO2 の平均値を計算し、腫瘍または創傷全体の各パラメータに対して単一の平均値を得ます。
    4. パラメータの安定性を評価してください。各反復ごとに%sO2 の値をプロットします(ステップ3.2.4参照)。スキャン中に%sO2 値が10%以上変化したかどうかを評価し、時間的に不安定な測定を示してください。
  3. DCE OA画像を解析します。
    1. 多波長DCE OA画像におけるクロモフォアのアンミックス:スペクトルアンミックスを行い、HbO2、Hb、造影剤のパラメトリックマップを作成します。このステップは単一波長DCE OAIには必要ありません。
    2. ROIとは何かを定義してください。
      1. 各画像スライスで腫瘍や創傷を表すROIを手動で描きます。腫瘍周辺や創傷周辺のピクセルを除外する方向に偏った保守的な投資報酬率(ROI)を算出してください。
      2. 代わりに、1つは腫瘍の縁を表すROI、2つ目のROIは腫瘍コアを表すものを手動で描く方法もあります。腫瘍の縁は腫瘍コアよりも血管化が強い場合があり、サブリージョン解析に有用な可能性があります。
        注:腫瘍サブリージョンの追加ROIを描画したり、造影剤のピクセル単位の値を評価することは可能です(ROI不要)が、これらの小さな領域は信号対雑音比が低いため、測定精度が不正確になります。
      3. 各波長と時間点ですべての画像でROIの位置を一貫性に保ちましょう。
    3. DCE OA画像からPK曲線を抽出します。
      1. 各画像スライスでのROIについては、タイムポイントを平均ICG信号(多波長DCE OAIからの)または選択した単一の波長でのOAI信号(単一波長DCE OAIの場合)に対してエクスポートします。
      2. すべての画像スライスに対して平均信号を計算します。腫瘍や創傷全体にわたる平均信号を時間と割り出すプロットはPKカーブとして知られています。
      3. 各時刻におけるすべての画像スライスの平均信号を、以下に記載した経験的パラメータを評価できるコンピュータプログラムに転送します。例えば、Microsoft ExcelやGraphpad Prismはグラフの簡単な解析を行うことができます。
    4. ステップ4.3.5–4.3.11で説明された経験的パラメータを計算します。
    5. PK曲線の正規化:注入前の時間点の平均値(基準信号)を求めます。すべてのインジェクト後信号値から基準信号値を差し引いてください。
    6. 最大信号強化(MSE)を求める:PK曲線で注入後信号値が最も高いものを特定します。
    7. ピークまでの時間(TTP)を決定する:MSEのタイムポイント値を特定します。
    8. PK曲線の初期傾きを計算します。
      1. この初期の傾きは、初期注入時点からTTPまでのものとなります。あるいは、曲線の形状が急すぎる場合やTTPが遅すぎる場合、注入後1分の傾きを計算する方法もあります。
      2. このシナリオでは、1分間のプリインジェクション画像を取得し、PK曲線上で1.0分から2.0分までの傾きを計算します。
    9. 曲線下の初期面積(IAUC):初期注入時点からPK曲線上のTTPまでの信号値の平均値を計算します。
    10. 洗浄フェーズの経験的率を計算します。
      1. TTPの1分後から最後の時刻点までのPK曲線の部分については、この曲線の部分に直線または定数オフセット項を持つ単一指数関数でフィッティングします。
      2. 直線の傾きや指数減衰定数をウォッシュアウト相のPKレートの経験的指標として用いてください。
    11. 造影剤強化OAIを計算してください。
      1. TTPより長い時間点を選びましょう。この時点での信号値をコントラスト強化の指標として算出します。
        注意:注射後10分の時刻が選択されることが多いですが、必要に応じて他の時刻も選択可能です。
      2. 代わりに、TTPから選択した時刻点までの平均信号、TTPから最後の時刻点までの平均信号、または必要に応じて他の時間帯を計算する方法があります。
      3. 平均信号はこれら2つの時間点におけるPK曲線下面積に相当し、技術的には信号振幅の指標ではなく信号強度の指標として知られています。
    12. ステップ4.3.13–4.3.20で説明されているPKモデリングを実行します。
      注:以下の手順は、inVision OAI機器で取得したDCE OA画像を解析します。他のOAI機器は異なるデータ形式の画像を生成することがあります。以下の手順は、他のOAI機器を用いてDCE OA画像を解析するためにも、他の機器のデータフォーマットをMatLabに転送し、ソフトウェアパッケージに付属するサンプルデータファイルに合わせて調整すれば可能です。
    13. ソフトウェアをダウンロードしてください。
      1. マルチウェーブ長DCE OAIの場合は、GithubのCAMEL-MartyPagelリポジトリからOE-DCE_MSOT_Matlabをダウンロードするか、https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab。
      2. 単一波長DCE OAIの場合は、GithubのCAMEL-MartyPagelリポジトリからDCE-MSOT_SingleWavelength_Matlabをダウンロードするか、https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab。
      3. 圧縮ファイルを解凍してください。 doc フォルダ内のSOPファイルを開き、ソフトウェアのインストールと使用に関する標準手順に従ってください。
    14. ソフトウェアのコンポーネントを異なるフォルダに整理してください。以下のソフトウェアファイルを1つのフォルダに格納します:
      メインコード:run_MSOT_nonneg.m
      サブコード:run_DCE_MSOT_MSP.m;run_OE_MSOT_AK_nonneg.m
      その他のコード:Negative_pixel_count.m;Voxel_count.m;ROI_modification.m
      フォルダタイトル:com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      再構成とスペクトルアンミックス後にViewMSOTからエクスポートされたデータ。
    15. MatLabでプログラムを起動します。
      1. run_MSOT_nonneg.mをダブルクリックすると、Matlabでプログラムを開始します。Matlabウィンドウの上部にある「実行」ボタンをクリックしてください。コードは現在のフォルダやMATLABパスに見つからないエラーを報告することがありますrun_OE_MSOT_AK_nonneg。
      2. このエラーを修正するには、addpathと入力し、ファイルの場所を引用符で囲んでからコードを実行してください。
    16. 解析の種類を選択してください:OE解析には N 、DCE解析には Y を入力してください。
      注:本プログラムは、酸素強化(OE)OA画像の解析が可能です。これは、21%酸素吸入ガス(医療用空気)または100%酸素2呼吸ガスと組み合わせて取得した酸素強化(OE)OA画像の解析が可能です。これらは本プロトコルで記述されるOS-DCEのOAI研究には使用されません。
    17. データを選択してください:
      1. DCE OAIファイルが入っているフォルダを選択します。MSPのサブフォルダではなく、メインのスキャンフォルダを選択してください。
      2. 次にスキャン名を確認してください。最後に、解析データを保存するフォルダを選択します。
    18. クロモフォアの数は 3 を入力してください。クロモフォアはHb、HbO2、 そしてコントラスト剤です。
      注:このプログラムは、必要に応じてマウスモデルに共注入される複数のクロモフォアのDCE OAI解析に対応するよう設計されています。しかし、このプロトコルのDCE OAIプロトコルは1つのクロモフォアのみを使用します。
    19. ROIは4.3.19.1–4.3.19.4の手順に従って引き出します。
      1. 解析のための動脈入力機能として機能する血管のROIを描き、スキャンのグレースケール画像が表示されます。血管を表すROIを手動で追跡してください。
        注意:画像右上にプラス記号が付いた虫眼鏡をクリックしてズームインしてください。もう一度虫眼鏡をクリックして、ROIを描くモードに戻ってください。脊椎近くの下大静脈はしばしば識別され、AIFとして用いられます。
      2. 腫瘍のROIを描く:スキャンのグレースケール画像が表示されます。腫瘍全体、腫瘍の縁、または腫瘍のコアを表すROIをなぞります。複数のROIを分析するには、このPKモデリング手順(ステップ4.3.12)を繰り返して追加のROIを得ます。
      3. 筋肉部位のROIを描く:このROIはDCE OAI計算に使用しないでください。このレポートでは使用されていない線形参照領域モデル(Linear Reference Region Model)を用いたDCE OAI解析に筋肉のROIを使用します。この手順はプログラムを継続するために必ず実行しなければなりません。
      4. 正しいROIが引き出されているか確認してください。PK曲線のモデリングが始まります。
    20. 解析されたDCE OAIの結果を可視化します。
      1. 解析済みのDCEデータを読み込むには、ブラウザバーに行き「DCE_MSOT_MSP」を選択してください。
      2. コマンドウィンドウで「 すべてクリア」と入力します。
        注:現在のフォルダタブは解析済みのDCE OAIデータで満たされており、以下が含まれます:
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat:これをダブルクリックすると、腫瘍ROIのNKtrans およびkep の集計値が表示されます。運動的パラメータは3つの方法で表に表されます。
        NKトランス_avg:各ピクセルごとに計算されたNKトランス の平均値。
        NKトランス _avg_signal:腫瘍全体の信号を平均して計算した単一のNKトランス 値
        NKトランス_nz:NKトランス_avgゼロでないピクセル値のみで計算されます。
        同様に、kep の数値も表示できます。
        NKtrans.fig:NKトランス _avg地図をグレースケール画像に重ね合わせて表示します。
        kep.fig:kep_avgマップをグレースケール画像に重ねて表示します。
        Maps_Wavelength_ICG.mat:これは他の北朝鮮のトランス やケイプの マップを視覚化するために読み込む必要があります。この行列を読み込んだ後、「オーバーラップコード」(別途含まれている)を使って、目的のパラメータを表示します。
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.matおよびMuscle_Maps_Wavelength_ICG.mat:筋肉のROIパラメータを表示します。
        ICG.figの正規化シグナル:3つのROIにおけるICGの平均シグナルを示し、最大シグナルに正規化したものです。
        ICG.figのシグナル:3つのROIにおけるICGの平均シグナルを示します。

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結果

OAI信号は腫瘍や創傷の酸素飽和度のマップを生成することができます
多波長OAIデータセットの取得と再構築後、腫瘍や創傷床内で関心領域(ROI)を定義し、異なる波長での信号強度を定量化できます。その後、スペクトルアンミクシングアルゴリズムを用いて、合成光音響信号からオキシヘモグロビン(HbO)とデオキシヘモグロビン(Hb)の寄与を分離します。この処理により、HbO2、Hb、総ヘモグロビン(HbT)、および血中酸素飽和度(%sO2)の定量的マップが作成されます(図4)。

OAIから導き出された%sO2 マップは、腫瘍および創傷における組織の酸素化および低酸素状態の評価に利用できます。腫瘍では、異常で歪んだ血管が血管網を形成し、酸素供給が制限されるため、腫瘍内部に低酸素領域がよく観察されます。異常な血管構造と高い酸素消費が組み合わさり...

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ディスカッション

DCE OAI PK曲線は、PK解析の信頼性を低下させるさまざまなアーティファクトの影響を受けることがあります。よくある落とし穴の一つは、イメージングフィールド内に浅い傷やかさぶた、乾燥した血液が存在することで、皮膚表面に強く非特異的な吸収が入り、より深い信号を遮断することがあります(図8)。腫瘍内でROIを描画する際は、これらの表層構造を含まないよう注意し、抽出した曲線が表面の人工物ではなく腫瘍内造影の動態を反映するように注意が必要です。

血管アクセスや注射の質も非常に重要です。図8Eは、造影剤注射失敗または部分的な注射後に現れる代表的なPK曲線を示しています。カテーテルが静脈通路を維持できなかったり、注射が漏出した場合、またはボーラスが比較的迅速かつ一貫して投与されない場合、期待される急激な信号の増加が現れなかったり、著しく鈍化したりすることがあります。同様に...

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開示事項

著者には本書に関して利益相反はありません。

謝辞

著者らは、iThera Medical, GmbHのニール・バートン医師にご相談いただき感謝申し上げます。この研究は、UW-マディソン放射線学NRSA助成金(2T32CA009206-46)、ITPT放射線科学研修パイロット助成金、臨床・トランスレーショナル科学賞(CTSA)プログラム、全米トランスレーショナルサイエンス推進センター(NCATS)、助成金UL1TR002373・1 TL1TR002375、NIH R43 CA265603、NIH R01 EB034261、NIH R21 EB037731、そしてフォーク医療研究信託のフォーク触媒賞によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20G針エクセルINT26417注射針;20G x 1インチ、ヘパリン溶液の調製に使用
4T1細胞ATCCCRL-2539トリプルネガティブ乳がん細胞株
アンチアンチ(100倍)ギブコ15240-062抗生物質カクテル
生検パンチインテグラ 33-366mm使い捨て生検パンチ 
細胞培養グレードの水コーニング25-055-CV500 mL;USP無菌規格に試験し、nbsp;
コラーゲンマトリックス溶液コーニング354262腫瘍形成および注射のためのコラーゲンマトリックス
エタノールディーコン・ラボラトリー2701汎用抗菌剤
眼の潤滑剤など;Optixcare 50-218-844220 g/.70 oz;動物専用 
ガーゼ フィッシャーブランド22-415-468綿のガーゼパッド;3インチ×3インチ(7.6×7.6cm);12層
手袋VWR76457-130ニトリル検査用手袋
ヘパリンメイシルNDC71288-402-1010 mLあたり10,000 USP単位、1000 USP単位/mL;10 mL マルチドージドバイアル
インドシアニングリーンTCII0535光音響造影剤
イソフルランアイソスパイア17033-091-25馬や犬に使用される非可燃・非爆発性吸入麻酔薬;250 mL  
ラボフィルムパラフィルム PM-9922インチ×250フィート;直径1インチのコア
ナイアボディブリームの脱毛剤 ナイルLL4038恥ずかしさクリーム;リッチココアバター&ビタミンE
ニードル 照もNN2732R27G x 1 1/4インチ(6.40 mm x 32 mm);R.W. レギュレーター・ベベル 
光音響イメージングマシンiTheraMedical MSOTインビジョン512光音響スキャナー
PBS、1倍コーニング 21-040-CV500 mL;カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸塩水付き生理食塩水。
RPMIコーニング 10-040-CV細胞培養培地
生理食塩水ホスピラNDC0409-4888-0210 mL 単回投与;0.9%塩化ナトリウム注入、USP
ストップウォッチiTheraMedical 4135333分や秒を記録するために使われていました。
注射器カーディナル・ヘルス11881280121 mL インスリン注射器;U-100インスリンのみ;27G x 1/2インチ(0.35 x 12.7 mm)
透明創傷ドレッシングテガデルム1624W透明フィルムドレッシングフレームスタイル;2 3/8インチ x 2 3/4インチ(6 cm x 7 cm)
ピンセットテルモ・エレクトロン 7626マウスに細胞を注入する際に皮膚を引き戻すために使われました
超音波ジェルエコビュー28332gのパック、プリピレングリコールフリー、水溶性、パラベン、染料フリー
未染色縫合エティコンVR49318インチカッティング;P-3 3/8 13 mm;未染色で編み込み、合成吸収性縫合、非USPです
ウォーミングパッドレプティ・サーム UTH120VAC 60Hz 8W 麻酔中に動物を温めていた。 
添え木グレース・バイオラボ476684透明シリコーン、外径14mm、内径10mm、厚さ0.5、縫合部位あり。
創傷クリップリフレックス7203-1000リフレックススキンクロージャーシステム、7mm、ステンレススティー

参考文献

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