神経膠腫研究のための変異神経幹細胞生成のための二重レンチウイルストランスダクション

サマリー

このプロトコルは、逐次レンチウイルス伝達を用いたグリオーマ研究のための変異マウス神経幹細胞(NSC)の生成を説明しています。まずNSCにがん性変異が導入され、その後リポーター遺伝子を含むビシストロンレンチウイルスが導入されます。抗生物質の二重選択後、変異したNSCは腫瘍の成長と治療反応のリアルタイム画像化を可能にします。

要約

神経膠腫は成人で最も多く見られる原発性脳腫瘍であり、マウスモデルはNSCや早期分化前体におけるがん性変異に起因する可能性を示唆しています。変異したNSCから派生したオルトトピック移植モデルは、グリオーマの病因、転帰、治療反応に関する貴重な前臨床情報を提供する可能性があります。これらのモデルでは、NSCにがん原変異を導入し、特にリポーターと組み合わせて、トランスフェクション/トランスダクション効率の決定やin vivoでの腫瘍成長の監視を図ります 。 本プロトコルは、 in vivo 腫瘍モニタリングに適した変異NSCを生成するための二重トランスダクションベースの手法を示しています。この技術では、単離されたNSCにまず、目的の遺伝子(がん原変異または緑色蛍光タンパク質[GFP]制御)に加え、殺菌剤耐性要素を含むレンチウイルスを導入します。ブラストシジン選択後、細胞はルシフェラーゼと赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するビシストロン系レンチウイルスベクター、さらにプルマイシン耐性要素で二次的にトランスデューションされます。プロマイシン選択後、細胞は増殖アッセイ、オルトトピック移植、その他の下流応用のために増殖可能です。この二重トランスデュクションアプローチにより、両感染段階でのトランスダクション効率の推定と、非侵襲的生物発光イメージング(BLI)を用いたin vivo腫瘍の形成、成長、治療反応のモニタリングが可能です。このシステムは、成人神経幹細胞由来腫瘍モデリングの生物学的意義とリアルタイム画像技術の実用的な利点を融合させた膠質腫研究の有用ツールであり、最終的には膠質腫生物学の理解を深め、新たな治療アプローチの発展に寄与します。

概要

膠腫は成人に影響を与える原発性脳腫瘍の中で最も多く、この集団における悪性脳腫瘍の約80%を占め^{ています1。}これらの多くは高グレードの膠腫^{であり、通常}は非常に侵襲的で、神経外科技術、放射線療法、化学療法の大きな進歩にもかかわらず予後が悪い^3,4。これらの腫瘍患者の高い死亡率は、膠質腫の形成と進行に関する継続的な研究の必要性を浮き彫りにしています。

中枢神経系における膠質形成は、マウスモデル研究におけるNSCs6,7,8,9またはその初期分化子孫10,11,12にがん性変異を導入することで引き起こされることがあります。特筆すべきは、これらの研究により分化した細胞に同じがん性変異が導入されると腫瘍を発生させないことが多いことを示しています¹³。これにより、系統制限の増加が変化に対する感受性の低下と相関する起源細胞の階層構造が確立^{されています。}遺伝子組み換えNSCは、遺伝子移植技術またはオルトトピック移植法を用いて生物学的に関連性があり多用途なグリオーマモデルを作成するために一般的に用いられます¹⁵。いずれのアプローチも、未転換細胞からの脳環境における新生腫瘍形成の研究を可能にします。遺伝子組み換えモデルは免疫システムが完全な動物でもこの研究を可能にし、しばしばヒト腫瘍で観察される組織学や細胞の異質性をよりよく模倣します¹⁶。しかし、これらのモデルの作成は労力とコストがかかり、しばしば長い潜伏期間や低い腫瘍形成頻度を示す¹⁶。対照的に、直流的NSCモデルはより操作しやすく、コスト効率も高いです。変異NSCは、マウスまたはヒトの一次細胞または不死化細胞から実験的ニーズに応じて生成でき、in vitro実験にも適しています。^16,17。さらに、これらのモデルはNSCと受容マウスの発生段階や、NSCが由来し導入される空間的局在を正確に調整する能力も提供しています。これにより、特定の変異によって引き起こされる年齢や特定の脳領域が腫瘍形成にどのように影響するかを研究者が調査できます¹⁷。

本プロトコルは、in vitroおよびin vivo実験の両方に適した一次培養から変異マウスNSCを生成する方法論を示しています(図1)。このプロトコルは、特定の時間的順序で発生する2つの異なるトランスデュクション相から成ります。初期のトランスダクション段階では、単離されたマウスNSCが標的遺伝子構造(がん性変異または緑色蛍光タンパク質(GFP)制御を持つ組換えレンチウイルスに感染し、ブラストシジン耐性カセットとともに投与されます。その後、殺菌剤を用いた抗生物質選択圧が加えられ、残存した遺伝子移入細胞のみが二次的なトランスダクションイベントに進むようにします。この二次イベントは、ホタルルシフェラーゼと赤色蛍光タンパク質(RFP)リポーター遺伝子の両方をコードするビシストロン系レンチウイルス構造体を用い、その後の選択のためにプルマイシン耐性因子と組み合わせます。プロマイシンによる選択後、得られた二重トランスデューションされたNSC集団をin vitroで増殖させ、その後の実験を行います。この逐次トランスダクションアプローチは、いくつかの方法論的利点を持っています。(1) 各ステップ¹⁸でのトランスダクション効率の定量的評価を容易にし、(2) 縦断追跡に適した安定したレポーター細胞株を確立できること、(3) BLI手法を用いて腫瘍の開始、進行動態、治療応答を非侵襲的にモニタリングできる.また、一次または不死の^{NSC21、22、23}とも組み合わせて使用できます。

ここで提示されたプロトコルは、統合された画像機能を備えた成体動物からNSC由来の膠質腫モデルを生成するための標準化され、効率的かつ生物学的に関連性の高いアプローチの緊急性に応えています。その結果生まれたモデルは、膠質腫の病因に関する臨床的意義のある知見をもたらし、新規治療標的の同定を促進し、新たな治療戦略の前臨床評価のための確固たる基盤を提供すると期待されています。

プロトコル

この研究は、セントルイスのワシントン大学が定めた倫理基準および規制ガイドラインに従って実施されました。このプロトコルでは、成マウスの皮質をBrossier研究所の先述技術²⁴ に基づき顕微解剖し、確立されたプロトコル^24、25、26に従って非付着培養で拡大するために一次マウスNSCを分離しました。培養に使用されるすべての試薬は、滅菌形式で供給されるか、0.2μM膜フィルターを通して滅菌性を確保します。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 微小解剖組織からの神経幹細胞の分離

1. 図2のレシピに従って解離培地(DM)とトリプシン消化培地(TDM)を準備します。
   1. 1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに200 μLのトリプシン消化培地を加え、使用前に少なくとも20分間氷で保管してください。DMはプロトコルの後半段階まで室温に置いておけます。
   2. チューブが事前に冷却されている間に、基礎神経幹細胞培地(NSC; レシピは図2参照)を準備し、NSCと胎児用牛血清(FBS)を37°Cの水またはビーズ浴で予温めます。サプリメント(B27、N2)や成長因子(EGF、FGF)のアリコートを氷桶に入れてゆっくりと解凍します。
      注意:TDMは使用前に毎回新鮮に準備する必要がありますが、NSCとDMは使用間に4°Cで保存可能です。レシピは 図2に示されています。N2、B27、EGF、FGFのストックは分割購入し、使用まで-20°Cで保管する必要があります。再構成されたストックの繰り返しの凍結融解を避けること(EGFおよびFGFストックの準備に関する詳細は 材料表 を参照)。
2. TDMを含むマイクロ遠心分離機チューブが十分に冷却された後、^前述の組織を微細解剖します。各マイクロ解剖の後、組織をマイクロ遠心分離機チューブに入れます。すべての解剖が完了するまでチューブを氷に戻してください。組織の加熱は酵素的消化プロセスを早期に始め、過剰な消化を引き起こす可能性があります。
3. マイクロ遠心分離チューブを37°Cの水またはビーズ浴で15分間キュベートし、酵素的消化を開始します。インキュベーション中、NSCに0.5 mL FBSを4.5 mL NSCに加えて10% FBSを準備します。
   1. インキュベーション後、1mLマイクロピペットでピペットサンプルを5〜10回優しく抽出して細胞をさらに解離させ、その後、各サンプルに10% FBSをNSCに200 μL加えてトリプシンを中和します。ピペットを上下に優しく動かして混ぜます。
      注意:推奨される37°Cの潜伏時間を守ることが重要です。 過剰なトリプシン化は細胞死を引き起こす可能性があり、トリプシン化不足はサンプルの解離を困難にします(この点やその他のトラブルシューティングのヒントは 表1、ポイント1–2を参照)。
      注:サンプルの培養には水浴またはビーズ浴のいずれかが使用されます。後者は汚染のリスクを減らす^{可能性がありますが、熱伝達効率}が低下するリスクを伴う可能性があります。
4. 分離した一次細胞を630 × g で4°Cで5分間ゆっくり減らします。 上清液を吸引し、ウェルの底の細胞を乱さないように注意してください。細胞ペレットに2.5 mL DMを加え、ピペットで3〜4回上下させて再懸濁させて洗浄します。630 × gで4°Cで5分間再度スピンダウンし、上清液を慎重に吸引します。
5. ステップ1.3を繰り返して2回目の洗浄を行います。最終洗浄時に、B27、N2、FGF、EGFを予温したベースNSC培地に加え、完全なNSC培地を作ります( 図2のレシピ参照)。
6. 上清液を吸引してください。各細胞ペレットに温められた完全なNSC培地2mlを加え、ピペットで3〜4回優しく上下させて再懸浮させます。再懸濁細胞を6ウェルの低付着プレートのうち1つのウェルに置き、37°Cで培養します。
   注:ベースNSC培地は使用間4°Cで保存可能ですが、この温度でサプリメントや成長因子が劣化する可能性があります。したがって、使用直前にB27、N2、FGF、EGFをNSC培地に加え、完全なNSC培地を作る必要があります。

2. ニューロスフィア文化の確立と拡大

1. 各NSC培養ウェルに3日ごとに新鮮なNSC栄養培地( 図2のレシピ参照)を0.5〜1mL投与します。
2. 神経球形成の監視を。完全に形成された小さな球体が見えると、培養物は通過準備が整います(通常、初期板付けから5〜10日)。
   注:細胞は頻繁に伝達し、対数成長段階にある時に最もよく成長します。大きな神経球は解離が難しく、この過程で細胞死が起こりやすいです。したがって、細胞の健康を促進するために、より早い頻度の伝達が推奨されます。通過準備が完了すると、分離された神経球体は直径約100〜200μmで、細胞は密に詰まり、明視野顕微鏡下では滑らかで明確な境界を持ちます。神経球体は不規則な突起や伸縮を示しません。神経球の中心は外縁よりやや暗くなりますが、過度に濃くはありません。過度に暗いコアは、神経球が過剰に成長したことで栄養不足による中心細胞の壊死によって生じることが多いです。過剰に成長した神経球を通過させることは、しばしば大量の細胞死を引き起こし、それが下流の応用に影響を及ぼします。この点やその他のトラブルシューティングのヒントについては 、表1のポイント3–4を参照してください。
3. NSC培地、DM、0.05%トリプシンEDTA、リン酸緩衝生食塩水(PBS)を37°Cで水またはビーズ浴で予温します。B27、N2、FGF、EGF、FBSのストックを必要に応じて氷に保管してください。
4. 通過するために、よく成長した神経球を血清学ピペットを用いて15mLの滅菌円錐形チューブに移します。神経球を沈殿させるために630 × g で4°Cで1分間遠心分離機を置く。上清液を吸引し、ペレット状の神経球を乱さないように注意してください。細胞を無菌の1x PBSに再懸浮させ、その後630 × gで4°Cで5分間遠心分離し、上清液を吸引します。
5. 細胞ペレットに0.05%トリプシン/EDTAを1mL加えます。1mLのマイクロピペットで3〜5回上下にピペットを回して混合し、その後37°Cの水またはビーズ浴で5〜6分間培養します。
   1. インキュベーション後、1mLマイクロピペットで神経球を5〜10回優しく上下にピペットで分離させます。NSC培地に10% FBSを1mL加えてトリプシンを中和します。ピペットで優しく混ぜます。
      注意:神経球の過剰なトリプシン化や過度なピペッティングは避けてください。これはNSCを損傷し細胞の生存能力に影響を与える可能性があります。
6. 2.5 mL DMを加え、630 × gで4°Cで5分間遠心分離します。 上清液を吸引してください。洗浄工程をさらに2.5 mL DMで繰り返し、遠心分離と上清液の吸引を行い、培地中のFBSの微量を除去します。
7. 細胞を1mLの新鮮な完全なNSC培地に再懸濁させます。フィルターセルの懸濁液は、40μmの滅菌フィルターを50mLのマイクロ遠心分離機チューブに置き、セル溶液をフィルターの上部に加え、重力で溶液をチューブ内に排出させます。残った解離していない細胞はフィルターに捕捉され、単一の細胞は下の溶液に通過します。
8. 再懸濁・ろ過した細胞から10μLを細胞計数のために取り、10μLのトリパンブルーと混合します。手動ヘモサイトメーターを用いて、10μLのサンプルを投与し、^{標準手順に従って}生存可能な細胞(すなわち青色でない細胞)をカウントします。あるいは、自動細胞カウンターを使用することもありますが、細胞残骸や集合体が存在する場合、精度は劣る^{場合があります。}
   注:一般的に、全細胞の10%〜15%未満が細胞死の兆候を示すべきです(例:トリパンブルーを除外できない)。細胞死率の上昇は、過剰なトリプシン化、細胞分離における過剰な機械的力、またはトリプシン化前の培養物全体の健康状態の悪化に起因する可能性があります( 表1、ポイント1–3参照)。これは下流の応用に悪影響を及ぼす可能性があるため、細胞死率が高い場合は、細胞の再プレート(ステップ2.9)および再度拡張(例:ステップ2.1–2.9の繰り返し)を行うことが推奨され、トランスデューションに進むのではありません。
9. 5×10個の⁵ 個細胞を2mLの新鮮な完全なNSC培地に希釈し、超低付着型6ウェルプレートの1ウェルにプレートします。最適な培養健康を確保するために、各ウェルに3日ごとに0.5〜1 mLの新鮮NSC供給を投与します。完全に形成され健康な球体が見えると( 表1、ポイント4参照)、培養はステップ3または4で使用可能となります。
   注:この時点で、100万個のNSCを1.5mLのクライオビアに再懸浮させて、血清フリー細胞凍結培地1mlに再懸濁し、-80°Cで保存することで追加のNSCを保存できます。必要に応じて、6ウェルプレートの追加ウェルに細胞をメッティングしたり、T-25フラスコにメッティングしたりすることで、さらに拡張することも可能です。

3. 親細胞におけるブラストシジン殺菌曲線

注:通過したNSCが健康な神経球を形成すると、細胞は次の実験に備えます。転換前に選択抗生物質(この場合は殺菌剤)の最適な濃度を決定することが重要です。これは経験的に行う必要があります。なぜなら、NSCの異なる集団が抗生物質に対する感受性が異なる可能性があるからです。もしこのことがすでに特定されているセルタイプであれば、ステップ4に進みます。

1. ベースNSC培地、DM、0.05%トリプシン-EDTA、PBSを37°Cで予温めます。 解凍後のB27、N2、FGF、EGF、FBS、そして殺菌剤のストック。開始前または以下のインキュベーション段階で、上記のように新鮮な完全なNSC培地と10%のFBSをNSC培地に作り上げます。
2. 上記ステップ2.9の培養後に新たに拡大した神経球を用いてトリプシン化し、ステップ2.5–2.6に従って分割し、その後1mLの新鮮NSCに再懸浮してカウントします。上記のように40μmの滅菌フィルターで細胞をろ過し、解離していない細胞を除去し、その後ステップ2.8で説明された細胞数を数えます。
3. 25,000個の生存可能な細胞を、2.5 mLの新鮮な完全NSCに15 mLの円錐形で再懸浮させ、検査する抗生物質濃度ごとに1つのアリコートを準備します。少なくとも4〜6種類の異なる濃度を検査する計画を立ててください。ただし、必要に応じてさらに多くの濃度を試すことも可能です。
4. 各2.5 mLアリコートに適切な量のブラストシジンを加え、望ましい最終濃度を達成します( 表2の試料計算を参照)。24ウェルの超低付着プレートに1ウェルあたり500μLの懸浮セル(5,000セル)をプレートし、各濃度は4倍でプレートします。
   注意:適切な最終濃度を得るためには、殺菌剤ストックを培地に加える前に希釈する必要がある場合があります。ブラストシジンはNSC培地またはPBSで希釈することができます。1:1000希釈ストック(10 mg/mL)の場合、希釈されていない(10 mg/mL)の殺菌剤ストック1 mLを999 mLのNSCまたはPBSに加えます。調査員は、材料が加熱される間に必要な濃度を達成するために必要なすべての計算を行うことが推奨されます(ステップ3.1)。表 2に示されたサンプル計算。
5. 細胞を37°Cで培養します。 24時間ごとにブライトフィールド顕微鏡で細胞の形態変化や細胞・神経圏の死を注意深くチェックしてください。3日ごとに、適切な濃度の殺菌剤を補足した新鮮なNSC栄養培地を0.5〜1mL追加して細胞に栄養を与えます。
6. 非遺伝子型移植細胞を殺す最も低いブラストシジン濃度を特定することで、その後の殺菌剤選択に適した濃度を決定します。
   注:成マウスNSCでは、抗生物質選択の最適濃度として1000 ng/mL(1 mg/mL)のブラストシジンが特定されました(図3)。その後の工程はこの濃度でブラストシジンを用いて行われます。最適なブラストシジン濃度は細胞調製によって大きく異なり、サンプルの種類、通過番号、^{培養条件によって}通常0.5〜10 μg/mLの範囲であることに注意すべき^です。したがって、経験的なキルカーブは各新しい細胞タイプに対してオプションではなく必須です。追加のトラブルシューティングのヒントは表1、ポイント5を参照してください。

4. 最初のレンチウイルス伝達

注:トランスダクションを進める前に、レンチウイルス粒子(LVP)を最適な感染多数率(MOI)でトランスデュクションすることが重要です。これは異なる細胞タイプに対して経験的に決定されなければなりません。その方法は以前からよく説明されています(^34,35)。示された結果では、一次マウスNSCの導入経験に基づくMOIが20で用いられました。

1. まずは拡張された未トランスデューションのNSCが健康な神経球を形成します(上記のステップ2.9で細胞の拡張後に生成されます)。上記のステップ2.3–2.8に従って細胞を分割、再懸浮、ろ過、カウントし、6個のセル密度で6個の細胞を6ウェルの2つのウェル(1つはがん性ウイルス用、もう1つはコントロール用)にプレートします。プレートは37°Cで一晩孵化します。
2. 翌日、細胞を調べてください。NSCは小さな塊を形成している場合、感染の準備が整っています。
3. 細胞に感染する前に、レンチウイルスアリコートを氷の上で慎重に解凍し、徐々に溶けていきます。このプロセスを急がないことが非常に重要です。
   注:説明のために、本プロトコルはレンチウイルスのトランスダクションを2つの代表的な構成要素で記述しています。(1) EF1-αプロモーターの下でブラストシジン耐性を持つGFPを発現する対照ベクター、(2) EF1-αプロモーターの下でN末端HAタグを付けたBRAF V600Eがん変異体を発現し、これも殺菌剤耐性を持つ実験ベクター。レンチウイルスの生成はこのプロトコルの範囲外ですが、以前からよく記述されています^36,37。
4. 解凍後、感染直前にウイルスを37°Cまで短時間温めます。各ウェルに加えるLVPの体積を、MOI×細胞数/ウイルスタイターの式で決定します。計算された体積に設定したマイクロピペットを使い、LVPをゆっくりと滴状に培養細胞に加えます。プレートを優しく回して分散させ、隣接するウェルに媒体をこぼさないように注意してください。細胞を37°Cで24時間培養します。
   注意:ウイルスアリコットは一度室温に解凍されると再冷凍できず、24時間以内に使用しなければなりません。アリコットが37°Cまで温められたら、30分以内に使用する必要があります。
5. この潜伏期間の後、神経球を630 × gで4°Cで5分間遠心分離し、その後上清液を吸引します。ウイルスや抗生物質を一切含まず、2mLの新鮮な完全NSCに再懸浮し、低付着型6ウェルプレートの新しいウェルにプレートします。
6. 翌日、蛍光顕微鏡を用いてGFPコントロール細胞のトランスダクション効率を複数領域で蛍光顕微鏡で全細胞・塊に占める割合を評価します。期待リポーター発現(GFP)は80%以上でなければ成功しません。
   注意:トランスダクション効率が最適でない場合は、2回目の感染(ステップ4.4–4.6の繰り返し)を行うことができます。効率が改善しない場合は、MOIの再最適化やレンチウイルスの別の製剤の試験を検討してください。これらやその他のトラブルシューティングのヒントは 表1、ポイント6を参照してください。
7. 発達中の神経球が健康に見え、感染の証拠(GFP陽性;~80%)が確認されたら、上記のステップ2.3–2.6に従って細胞分裂を進めます。細胞を適切なブラストシジン濃度(1000 ng/mL)を含む完全なNSC培地5mLに再懸浮させ、その後40μmの滅菌フィルターで細胞塊を除去します。細胞を数え、約5×10⁴ cells/mLで超低付着T-25フラスコでプレートを施します。
   注:抗生物質の初期投与後は、非遺伝子型細胞が死滅するため細胞死率が高くなることがあります。これは予想されており、今後の選考で改善されるはずです。
8. 細胞を増殖させるために、3日に一度ブラストシジンを含む栄養補助剤を摂取してください。完全に形成されると健康な球体が見え、通常は分割後5〜10日で培養がステップ5または6で使用可能となります。
   注:耐性クローンのさらなる拡張後、細胞を採取してウェスタンブロッティング(ステップ7で説明)を行い、非蛍光標識でHAタグ付きのがん性構造体が適切に発現されているかを検証します。この段階でウェスタンブロットを行う場合でも、適切な継続的な発現を確保するために、第2^次 トランスダクション(ステップ7)後に発現を確認することが推奨されます。

5. 殺菌剤耐性NSCにおけるプロマイシンキルカーブ

注意:2回目のトランスダクションの最適選択濃度も経験的に決定する必要があります。この段階では殺菌剤に耐性を持つトランスダクションされたNSCが用いられ、細胞は殺菌剤選択(1000 ng/mL)で維持されます。これは、トランスダクションと同時生の殺菌剤選択によってプロマイシンに対する感受性が変化する可能性があるためです。

1. ベースNSC培地、DM、0.05%トリプシン-EDTA、PBSを37°Cで予温めます。 B27、N2、FGF、EGF、FBS、ブラストティシジン、プロマイシンの解凍ストック。開始前または以下のインキュベーション段階で、上記のように新鮮な完全なNSC培地と10%のFBSをNSC培地に作り上げます。
2. 殺菌剤耐性神経球を用いてトリプシン化し、ステップ2.5–2.7に従って分割し、1mLの新鮮NSCに再懸浮してカウントとろ過を行い、塊を除去します。ステップ2.8で説明された細胞数を数え、25,000個の生存細胞を15mL円錐形の新しいNSCの2.5 mLアリコートに再懸濁し、検査する抗生物質濃度ごとに1アリコートを準備します。少なくとも4〜6種類の異なる濃度を検査する計画を立ててください。ただし、必要に応じてさらに多くの濃度を試すことも可能です。
3. ブラストシジンを加えて、以前最適化された濃度(1000 ng/mL = 0.25 mLの希釈なしストック/2.5 mLのアリコート)を達成します。その後、各チューブに適切な量のプロマイシンを加え、望ましい最終濃度を達成します( 表2のサンプル計算を参照)。
4. 24ウェルの超低付着プレートに1ウェルあたり500μLの懸浮セル(5,000セル)をプレートし、各濃度は4倍でプレートします。
5. 細胞を37°Cで培養します。 24時間ごとにブライトフィールド顕微鏡で細胞の形態変化や細胞・神経圏の死を注意深くチェックしてください。3日ごとに、ブラストシジンと適切な濃度のプロマイシンを補足した新鮮なNSC栄養培地0.25mLを加えて細胞に栄養を与えます。
6. プレートから72〜120時間の間に細胞を殺す最低濃度を特定し、その後のプロマイシン選択に適した濃度を決定します。
   注:GFPおよび/またはBRAF-V600Eレンチウイルスを導入した成マウスNSCでは、抗生物質選択に最適な濃度として100 ng/mLが実証的に決定されました(図4)。例のトランスダクションでは、その後のステップ3から1000 ng/mLのブラストシジンとステップ5の100 ng/mLのプロマイシンを用いて実施されました。トラブルシューティングのヒントは 表1、ポイント5を参照してください。

6. 第二レンチウイルス転換

注:細胞は第2トランスダクションフェーズの間、細胞は殺菌剤を含む培地内に留まり、第1トランスダクションフェーズで導入されたがん性コンストラクトやGFP制御が細胞内で維持されるようにします。

1. この手順は、活性化し安定性転生した殺菌剤耐性NSC(ステップ4で生成)を用いて開始します。まず、NSCを単一セル懸濁液に解離して(ステップ2.3–2.7)、メッキ中の均一性を確保します。
2. 細胞を1.5 x 10 x 6 cell 密度で、完全なNSC培地でブラストシジン(ステップ3で決定した1000 ng/mL)を6ウェル超低付着プレートにプレートします。プレートは37°Cで一晩孵化します。
3. 翌日には、細胞が小さな塊を形成すれば、トランスダクションの準備が整います。ルシフェラーゼとRFPを含むビシストロン系レンチウイルスを氷で解凍し、感染直前に短時間37°Cまで温めます。各ウェルに加えるLVPの体積を、MOI x 細胞数/ウイルスタイターの式を用いて決定します。ここではMOIが20です。
   1. 計算された体積に設定したマイクロピペットを使い、LVPをゆっくりと滴状に培養細胞に加えます。プレートを優しく回して分散させ、隣接するウェルに媒体をこぼさないように注意してください。細胞を37°Cで24時間培養します。
4. 翌日、神経球を630 × gで4°Cで5分間遠心分離し、新たに完全な殺菌剤を含むNSC(1000 ng/mL、ステップ3に従い)で再プレートします。
5. 翌日、複数フィールドで蛍光顕微鏡でRFP陽性細胞/塊の割合を測定し、最適な効率~60%で第2トランスダクションステップの効率を評価します。
6. 神経球が健康に見え、2回目の転接ステップが効果的であること(例:細胞塊の大多数がRFP+である)を観察すると、細胞は二重選択の準備ができます。まずNSCを単細胞懸濁液に解離し(ステップ2.3–2.7)、次に約5×10⁴ 細胞/mLで超低付着T-25フラスコで、ブラストシジン(1000 ng/mL)とプロマイシン(100 ng/mL)を含む完全なNSCで再版状します。
   注意:上記のステップ4.6と同様に、トランスダクション効率が最適でない場合は、2回目の感染(ステップ6.3–6.6の繰り返し)が実施されることがあります。さらなるトラブルシューティングのヒントは 表1 を参照してください。
7. ブラストシジンとプロマイシンを含む栄養補助剤で3日ごとに細胞に栄養を与えてください。
   注:培養の厳重な監視は、二重耐性クローンを特定するために不可欠であり、これらは両方の選択圧下での生存によって特徴づけられます。完全に形成された健康な球体が見え、通常は分割後5〜10日後に培養液はさらなる検証の準備が整います(ステップ7)。

7. 二重トランスデューションNSCの検証と特徴付け

注:さらなる in vitro または in vivo 実験を行う前に、HAタグ付き構造物およびルシフェラーゼが適切に発現されていることを確認するために、さらなる検証が推奨されます。

1. HAタグ付き構成体の発現を検証するためのウェスタンブロッティング
   1. 培養NSC(GFP対照群およびHAタグ付き BRAF。 V600E(例示)は、分割準備が整うまでT-25の超低接着フラスコに入っています(ステップ2.2に従い)。
      注:次のステップに進む前に、培養液でGFP発現が進行中(GFP対照細胞)およびRFP発現(全細胞)を二重に確認することが推奨されます。
   2. 培養液の半分を除去し、ステップ2.2〜2.7に従って分割し、その後、ブラストシジン(1000 ng/mL)およびプロマイシン(100 ng/mL)を用いて新鮮な完全なNSC培地に再プレートし、培養を継続して増殖させます。残りの神経球を630 × g、4°Cで回転させ、その後上清液を吸引します。
   3. その後、氷冷PBSでNSCを2回洗浄し、4°Cで630× gでスピンダウンし、各洗浄後に上清液を吸引しました。各サンプルに約200μLの氷冷RIPA溶解バッファーに加え、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加します。
   4. 溶除液を氷上で30分間孵化させ、10分ごとに断続的に渦巻きを起こすようにしてください。サンプルを14,000 × gで4°Cで15分間遠心分離します。 クリア済み溶解液と呼ばれる上澄液を慎重に、新鮮に冷却されたチューブに移します。溶解液は-80°Cの深冷凍庫で保存します。
   5. その後、溶解液は既存のプロトコルに従い、西方ブロッティング(構成概念の発現を検証するための)に使用^{されます。}
      注意:すぐに使用しない場合は、使用まで-80°Cで溶解液を保存してください。試料の完全性を維持するために、繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください( 表1、ポイント7参照)。
2. ホタルルシフェラーゼの適切な発現を検証するための生物発光強度(BLI)
   注:このプロトコルは、特定のハードウェアとソフトウェアを用いて生細胞のBLIモニタリングを用いてルシフェラーゼ発現を検証します(詳細は 材料表 を参照)。BLI検出および定量に異なるシステムを使用する場合、方法論は異なる場合があります。
   1. NSCを分割し、上記のステップ2.2–2.8に従って定量化し、細胞を完全なNSC培地で希釈し、異なる濃度(例:2.5×10×⁴ 細胞、1×10×⁵ セル/ウェル)で24ウェル超低接着プレート(500mL/ウェル)でプレートを施し、各細胞濃度を四重にプレートします。細胞はブラストシジン(1000 ng/mL)およびプロマイシン(100 ng/mL)を含む完全なNSC培地で維持されます。
      注:測定中に1つのウェルのルシフェラーゼ分泌による発光強度が隣接ウェルに漏れるのを防ぐため、隣接ウェルのNSCをプレート化しないでください。
   2. イメージングシステムは少なくとも30分前に電源を入れ、電荷結合装置カメラが最適な動作温度(約-90°C)まで冷却されます。定量ソフトウェアを起動し、イメージングチャンバーを70%エタノールで消毒し、使用前に完全に乾燥させます。
      注意:長時間の画像撮影中に細胞の生存を確保するため、イメージングチャンバーの温度を37°Cに保ちましょう。
   3. D-ルシフェリンのストックアリコットを解凍し、光から守ります。細胞を含む各ウェルに15 mg/mLのD-ルシフェリン作動溶液を5 μLの体積を優しく加え、最終濃度を150 mg/mLにします。皿を軽く回して溶液の均一な分布を保ちます。
   4. プレートを37°Cで10分間キュベートし、基質の細胞への拡散を促進し、最大限の光の生成を促進します。
   5. プレートを感度の高い生物発光イメージングシステム内に位置付けます。プレートの上にグリッドを置きます。 発光 イメージングモードを選択し、露出時間の自動露出から始めます。ビニングを中程度に設定し、絞り値を1に調整して光の収集を最適化します。
      1. 24ウェルプレート用に視野角を「D」に設定し、被写体の高さを1.5cmに固定します。画像取得はイメージングソフトで行われます。信号が弱い場合は、露出時間を手動で調整できます(トラブルシューティング表ポイント8参照)。
   6. 制御井戸に対する背景補正を行い、イメージングソフトウェアを用いた分析のために必要に応じて相対光単位を定量します。
      注:BLIの検証後、細胞は既に定められたプロトコル¹⁹に従い、合成マウスまたは免疫抑制マウスの脳にオルトピソ移植が可能です。

結果

成体のNSCは成体のC57BL/6マウスの皮質から分離され、非接着培養³⁹で培養した結果、7日から10日以内に一次神経球(20〜250μm)が形成されました(図1)。その後、細胞はin vitroで増殖されました。 その後、未トランスデューションNSCでブラストシジン選択の最適化が行われました(ステップ3)。選択から24時間経過後、ブラストシジン濃度が1000 ng/mL(1 μg/mL)以上になると神経球のサイズが減少しました(図3A)。その後、トリパンブルー排除法を用いて手動の細胞定量および生存可能性評価を行いました。選択から24時間後には、1000 ng/mL(1 μg/mL)の殺菌剤で約50%の細胞死が認められました(図3B)。72時間...

ディスカッション

この2段階のレンチウイルストランスダクション法は、腫瘍学研究に適した遺伝子組み換えNSCを成功裏に生成しました。ここでは、BRAF V600Eがん原変異(成人の高等級グリオーマの一部に存在し、ここでは概念実証として使用)やGFP制御と、生物発光イメージング(ルシフェラーゼ)および蛍光顕微鏡検出(RFP)用のデュアルレポーターシステムとの効果的な統合を示しました。一定MOI20での連続的なトランスダクションと、ブラストシジンを用いた二重抗生物質選択スキームとプロマイシンの組み合わせにより、高いトランスダクション効率、非トランスダクション細胞の除去、蛍光の連続モニタリングにより安定したトランスデュース細胞株の生成が実現しました。高いトランスダクション効率は、技術的には安定した細胞株生成に必須ではありませんが、より速い安定細胞株の生成を可能にします。選択過程を生き延びる細胞^数が40,41となり、実験に必要な十分な細胞を生成するための連続細胞増...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
β-メルカプトエタノール（BME）	シグマ	M3148-25ML	生物安全キャビネット内で使用してください。50 mMのストックを作るために、BMEを35 mL低グルコースDMEMの10 mLに加え、滅菌フィルターをかけ、培地調製用に500 mLのアリコートに分けて使用します。
Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody	Cell Signal Technology	7076	1 %の脱脂粉乳で1:2000希釈して使用
B-27サプリメント（50X）	Gibco	17504-044	初回使用時は、1mlのアリコートを将来の使用のために凍結し、-20℃で保存します。凍結後、氷の上にサプリメントを置き、メディアに加えられるまで冷やしておきます
Blasticidin S HCl（10 mg/mL）	Gibco	A1113903	10 mg/mLのストックからアリコートを作ります。200 mLの小さなチューブに入れて、使用するまで-20℃で保管します。
ウシ血清アルブミン（BSA）	Millipore-Sigma	A1470-10G	1x PBSに10%のBSA重量/体積で使用します。BSAは粘着性があるため、適切に重量を量り、適切な量の希釈剤を加えて正確な溶液を作ってください。
セルストレーナー（40 μm）	Midsci	40ICS	滅菌済みで個別包装されています。生物安全キャビネット内で開封してください。素手で触らないでください
D-ルシフェリン、カリウム塩	Gold Biotechnology	eLUCK-100	使用前に15 mg/mLの作用溶液（分子グレードの水で希釈）を作り、滅菌フィルターをかけます。毎回新鮮なストックを準備し、直接培地に加え、最終作用濃度150 mg/mL（例：500 mL培養あたり5 mLの作用溶液）を達成します
DMEM、低グルコース	Gibco	11885-084	基礎NSC培地を作るために使用
上皮成長因子（EGF）	Corning	354001	滅菌された凍結乾燥パウダーとして供給されます。1000倍ストックを再構成するために、100 μgの凍結乾燥EGFパウダーに4.95 mL PBSと10% BSA（1x PBS中）の50 μLを加え、ピペットで混合します。完全なNSC培地とNSCフィード補充用に500 μLまたはそれ以下のアリコートを小さなチューブに作り、-20℃で保存します。繰り返しの凍結融解を避けてください。
線維芽細胞成長因子、ベーシック（FGF）	R&D systems	233-FB	滅菌された凍結乾燥パウダーとして供給されます。1000倍ストックを再構成するために、25 μgの凍結乾燥FGFパウダーに1.24 mL PBSと10% BSA（1x PBS中）の12.5 μLを加え、ピペットで混合します。完全なNSC培地とNSCフィード補充用に500 μLまたはそれ以下のアリコートを小さなチューブに作り、-20℃で保存します。繰り返しの凍結融解を避けてください。
グルコース、45%	Corning	25-037-CI	滅菌溶液として供給されます。生物安全キャビネットの外で開封しないでください
HA-タグ（C29F4）ウサギmAb	Cell Signal Technology	3724	HA-タグ発現を確認するためのウエスタンブロッティングで1: 1000希釈で3%ウシ血清アルブミンで使用
HBSS、10x	Gibco	14185-052	滅菌溶液として供給されます。生物安全キャビネットの外で開封しないでください
HEPES、1 M	Corning	25-060-CI	滅菌溶液として供給されます。生物安全キャビネットの外で開封しないでください
IVIS 50	PerkinElmer		最適な温度にカメラを冷却するために、使用の30分前に機器の電源を入れてください。定量化にはLiving Imageソフトウェア（バージョン4.3.1）を使用します。
Lentivirus-ルシフェラーゼ（ホタル）-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVPは-80℃の冷蔵庫でアリコートし保管する必要があります
L-グルタミン、200 mM	Corning	25-005-CI	滅菌溶液として供給されます。生物安全キャビネットの外で開封しないでください
モレキュラーグレードの水	Corning	46-000-CM	滅菌溶液として供給されます。生物安全キャビネットの外で開封しないでください
N-2サプリメント（100x）	Gibco	17502-048	初回使用時は、1mlのアリコートを将来の使用のために凍結し、-20℃で保存します。凍結後、氷の上にサプリメントを置き、メディアに加えられるまで冷やしておきます
ネスティン（E5C7I）ウサギmAb	Cell Signal Technology	89529	NSCマーカー発現を確認するためのウエスタンブロッティングで1: 1000希釈で3%ウシ血清アルブミンで使用
Neurobasal培地	Gibco	21103-049	基礎NSC培地を作るために使用
ペニシリン-ストレプトマイシン（10,000 U/mL）	Gibco	15140-122	滅菌溶液として供給されます。アリコートし、使用するまで-20℃で保管します。
リン酸緩衝生理食塩水、1x（PBS）	Corning	MT21040CV	滅菌溶液として供給されます。生物安全キャビネットの外で開封しないでください
プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤	Cell Signal Technology	5872S	-20℃で保管する必要があります
プクロマイシンジヒドロクロリド	Gibco	A1113803	10mg/mlのストックからアリコートを作ります。200 mLの小さなチューブに入れて、使用するまで-20℃で保管します。
RIPA溶解バッファー、10x	Millipore-Sigma	20-188	-80℃で保管し、滅菌した二重蒸留水で1xのアリコートを作ります
無血清凍結培地	Bambanker（日本遺伝学）	CS-04-001/BB02	NSCを保存するために、各クライオバイアルあたり1mlの凍結培地で細胞を希釈します。凍結培地を細胞に加えた後、細胞を-80℃で長期保存できます。ゆっくり冷却する必要はなく、液体窒素で保管する必要もありません。
ナトリウムビカボネート（7.5%）	Corning	25-035-CI	滅菌溶液として供給されます