方法論記事

潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

DOI：

10.3791/70693

⸱

2026年5月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular and Functional Biology Research, National Institute of Science and Technology in Tuberculosis, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, 2Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, School of Health and Life Sciences, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, 3Graduate Program in Medicine and Health Sciences, School of Medicine, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、4-アミノキノリン化合物の化学合成、結核菌に対する最小阻害濃度の決定、哺乳類細胞株における細胞毒性の評価を含む表現型スクリーニングを通じて潜在的な抗結核薬候補を特定するプロトコルを提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

結核(TB)は世界的に単一の感染症因子による死因の主要な原因の一つであり、薬剤耐性の増加により新規治療薬の開発は世界的な健康上の優先事項となっています。本プロトコルは、3つの統合段階を通じて潜在的な抗結核薬候補を特定する表現型スクリーニングアプローチを記述しています。まず、4-アミノキノリンクラスの化合物を三段階のルートで合成し、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、核磁気共鳴(NMR)分光法、高分解能質量分析法(HRMS)によって完全に特徴付けられます。次に、化合物の抗菌活性を結 核菌 に対して評価し、比色メトリウム・レサズリン還元マイクロプレートアッセイ(REMA)を用いて、単純な視覚的色変化読み取りによって最小阻害濃度(MIC)を決定します。第三に、この化合物の細胞毒性は、2つの哺乳類細胞株、Vero(アフリカグリーンモンキー腎臓)およびHepG2(ヒト肝細胞癌)で、MTTアッセイ(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)および中性赤色取り込み(NRU)アッセイを用いて評価されます。これら2つの補完的なアッセイは異なる細胞パラメータを測定し、細胞毒性の結果の相互検証を可能にします。MICと細胞毒性データを組み合わせることで、各化合物の治療可能性を評価する選択性指数(SI)を計算できます。このプロトコルは、初期段階の抗結核ヒットの特定と前臨床評価のための再現可能で段階的な枠組みを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主に結核菌(Mtb)によって引き起こされる結核(TB)は、主に肺を標的にするヒトの感染症であり、肺外変異も発生することがあります。結核は活動性疾患を持つ個人が放出する空気感染するMTB菌を通じて広がります。病気の進行状況によっては、結核に感染した人は即座に活動性結核を発症することがあります。しかし通常、新たに感染した個体は潜伏結核を発症し、代謝活動の低いMtb細胞が肉芽腫内で生存します。潜在結核の人は最終的に活動型の病気を発症し、臨床症状を示すことがある3.現在、世界人口の4分の1が潜在性結核感染を患っていると推定されています。

多くの進歩にもかかわらず、結核は世界的に深刻な公衆衛生問題として残っています。最新のグローバル・トゥーバークリズム・レポートのデータによると、2024年には1,070万人がこの病気を発症しました。同年、世界で結核による死亡が123万人記録され、結核は単一の感染症要因による死因のトップとなりました。MTBの病理学や複雑な生物学に加え、貧困や栄養失調といった社会経済的側面、喫煙、糖尿病、HIVの併感染といった健康関連要因も、病気の管理をさらに困難にしています5。これが結核が長年にわたり世界的な健康問題として存在し続けている要因となっています。

さらに、現在の結核治療には制限があり、病気との闘いを複雑にしています。感受性のMTB株に対する標準治療は、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RIF)、エタンブトール(EMB)、ピラジナミド(PZA)の4種類の薬剤の併用療法です。これらの抗生物質は最低6か月間投与され、治療中は厳格な遵守が必要です。この治療法は、ほとんどのケースで効果的で成功率は約85%であるにもかかわらず、多くの課題に直面しています5,6。最大の問題の一つは副作用と長期治療で、患者が早期に中断してしまうことが多いです。この中止と抗生物質の誤投与は、より毒性が高く高価かつ広範な治療法を必要とする耐性性MTB株の選択を有利にしています7,8。

このような状況を踏まえると、新しく強力な抗結核薬の開発が緊急です。このプロトコルは、表現型スクリーニングを用いた新薬候補の研究の初期段階を示しています。このプロトコルの適用例を示すために、評価のためにLABIO-17由来の4-アミノキノリン化合物を選択しました。LABIO-17は以前、私たちの研究グループによってMtb中のエノイルACP還元酵素(InhA)の阻害剤として同定されており、これはイソニアジド(INH)と同じ分子標的です9,10。InhAはM. tuberculosisにおけるミコリン酸生合成に関与し、この菌の生存に不可欠であり、有望な分子標的としての重要性を示しています

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 化学合成と特性評価

注:化学化合物の合成および特性評価は、前述の通りに行われます。1.1から1.4までのすべての手順は、ニトリル手袋を着用して十分に換気されたフルームフード内で行うべきです。

  1. 試薬の調製
    1. 0.1%の蟻酸を用いたMeOH/CH₃CN(1:1)の製剤
      1. メタノール(MeOH)とアセトニトリル(CH₃CN)の体積を等量にして、1:1(v/v)の混合物(HPLCグレード)を準備します。
      2. 溶剤を清潔で乾いた容器(例:ボリュームフラスコ)で混ぜます。最終濃度0.1%(v/v)にするために蟻酸を加えます(例:1 mLの蟻酸を溶媒混合物1Lに加える)。
      3. 優しく回すかか混ぜてよく混ぜます。密閉容器で室温で、光を遮って保存してください。
    2. 超純水における1%(v/v)酢酸の調製
      1. ボリュームフラスコをウルトラピュアウォーターですすぐ後、作業台に置きます。最終的な超純水の80%以上をフラスコに加えます(例:100 mLフラスコは80 mL、1Lフラスコは800 mL)。
      2. 校正済みピペットを用いて氷河酢酸を加えて1%(v/v)にします。最終体積100 mLの場合→酢酸1.0 mLを加えます。最終1リットルの最終容量→10.0 mLの酢酸を加えます。
      3. くるくると回すかかき混ぜてよく混ぜます。フラスコに最終的な目に入った超純水を加えて混ぜます。
      4. 超音波洗浄機(タンク周波数~40kHz)を用いて脱ガスし、周囲温度で20分間脱ガスモードに設定して溶液を脱ガスします。
      5. ラベル付きの琥珀瓶(ラベル:内容、濃度、溶媒等級、日付、調製者)に移します。常温で密閉して保管してください。
    3. アセトニトリル製剤:メタノール(1:1、v/v)、HPLCグレード
      1. アセトニトリルとメタノールの体積を等しく測定します:最終体積100 mLの場合、50.0 mL アセトニトリル + 50.0 mL メタノール→最終体積1リットル→アセトニトリル500 mL + メタノール500 mL。
      2. 溶媒を清潔なボリュームフラスコまたはボトルで混ぜ、逆回転または攪拌で混ぜます。混合物を0.45μmのフィルターで清浄な容器に通し、粒子を除去します。
      3. 超音波洗浄機(タンク周波数~40kHz)を用いて脱ガスし、周囲温度で20分間脱ガスモードに設定して溶液を脱ガスします。
      4. ラベル付きの琥珀色のボトル(表示:組成、溶媒等級、日付、調製者)に移します。室温で密閉して、熱や光から離して保管してください。
    4. カラムクロマトグラフィー用のヘキサン/エチル酢酸エチル7:3(v/v)溶液の調製
      1. 最終体積の70%をヘキサンで測定してください。例:最終体積100 mLの場合、70 mLヘキサン→。
      2. 最終体積の30%をエチル酢酸で測定してください。例:最終体積100 mLの場合→30 mLのエチル酢酸塩。
      3. 両方の溶媒を清潔で乾燥した容器(例:ボリュームフラスコやボトル)で混ぜます。
      4. 均一になるまで、逆さまかかき混ぜてよく混ぜます。容器に組成、日付、溶剤等級、調製剤のラベルを付けてください。
    5. カラムクロマトグラフィー用ヘキサン/酢酸エチル1:1(v/v)溶液の調製
      1. 最終体積の50%をヘキサンで測定してください。例:100 mLの最終体積→50 mLのヘキサンの場合。
      2. 最終体積の50%をエチル酢酸塩で測定してください。例:最終体積100 mLの場合→50 mLの酢酸エチル。
      3. 両方の溶媒を清潔で乾燥した容器(例:ボリュームフラスコやボトル)で混ぜます。均一になるまで、逆さまかかき混ぜてよく混ぜます。
      4. 容器に組成、日付、溶剤等級、調製剤のラベルを付けてください。
    6. 飽和重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)溶液の調製
      1. 過剰な重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)(水100 mLあたり約15〜20g)を計量します。
      2. 炭酸水素ナトリウムを、蒸留水の既知の量(例えば100 mL)を含む清潔なビーカーに加えます。磁気攪拌棒やガラス棒を使い、室温(20〜25°C)で混合物を連続的に攪拌します。
      3. さらにかき混ぜ続け、固体が溶けず、底に少量の未溶解の炭酸水素ナトリウムが残るまで続きます。これは溶液が飽和していることを示します。
      4. 懸濁液を10〜15分間休ませて、未溶解の固形物を沈殿させます。混合液を紙フィルターや焼結ガラスのじょうごでろ過し、余分な未溶解の炭酸水素を除去します。
      5. 透明なろ液、すなわち飽和重曹溶液を採取します。
      6. 溶液は密閉したボトルに保存し、化合物名、濃度(飽和濃度)、調合日、イニシャルを正しくラベル付けしてください。
      7. 溶液は室温に保ち、必要に応じて新鮮に準備してください。CO2 は徐々に漏れ出し、時間とともに濃度を変えることがあります。
  2. 6-ブロモ-2-メチルキノリン-4-オールの合成(3)
    1. 4-ブロモアニリン(1.2g、7.3 mmol)と無水硫酸マグネシウム(1.08 g、9.0 mmol)をエタノール(15 mL)に含む溶液を準備します。
    2. 溶液に氷河酢酸(0.33 mL)とエチルアセト酢酸(1.8 mL、14.1 mmol)を加えます。反応混合物を90°Cで16時間かき混ぜます。
    3. 反応混合物をセルロース、11μmの保持、定性フィルターペーパーでろ過し、懸濁した硫酸マグネシウムを除去します。
    4. 回転蒸発器を使ってエタノールを蒸発させ、アクリレート中間体を得ます。
    5. 高性能合成熱伝達流体(材料表参照)を含む適切な油浴(材料表参照)を用いて230〜250°Cで15分間加熱し、反応を完了させます。
    6. 混合物を室温まで冷やします。形成された沈殿物をろ過し、ヘキサンとクロロホルムで洗浄します。
    7. 最終製品は低圧で回転蒸発器を用いて濃縮し、残留溶媒をすべて除去します(材料表参照)。
  3. 6-ブロモ-4-クロロ-2-メチルキノリンの合成(4)
    1. トルエン(10 mL)に6-ブロモ-2-メチルキノリン-4-オール(0.65 g, 2.8 mmol)溶液を準備します。溶液にリン(V)オキシクロリド(0.65 mL、6.9 mmol)を加えます。
    2. 反応混合物を110°Cで2時間かき混ぜます。回転蒸発器を使って余分なリン(V)オキシ塩化物を除去します。
    3. 残留物を氷水浴で冷やします。反応混合物を飽和水素炭酸ナトリウム溶液で中和します。
    4. エチル酢酸(3×50 mL)で製品を抽出します。有機相を混ぜて無水硫酸ナトリウムで乾燥させます。
    5. 回転式蒸発器を使って溶媒を蒸発させ、固体残渣を得る。粗い製品を確保するために回転蒸発器を使って生成された固体を乾燥させます。
    6. 溶出液としてヘキサン:エチル酢酸(7:3)を用いて、シリカゲル(35–70メッシュ)上でフラッシュクロマトグラフィーで化合物を精製します。
  4. 6-ブロモ-2-メチル-N-(4-(ピペリジン-1-イル)フェニル)キノリン-4-アミンの合成
    1. 6-ブロモ-4-クロロ-2-メチルキノリン(0.53g、2 mmol)、4-(ピペリジン-1-イル)アニリン(0.57 g、3 mmol)、ピリジン(0.24 mL)、および塩酸37%(0.2 mL)をイソプロパノール(20 mL)に含む反応混合物を準備します。
    2. 反応混合物を85°Cで16時間かき混ぜます。回転蒸発器を使って溶媒を除去します。
    3. 残留物は飽和重炭酸ナトリウム溶液で処理します。
    4. 得られた固体をセルロース、11μmの保持定性フィルター紙でろ過し、クロロホルム(50 mL)に溶解させます。
    5. クロロホルム溶液を水(3×15mL)で洗います。有機相を無水硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。
    6. 回転蒸発器を使って溶媒を蒸発させ、緑色の固体を得ます。熱いヘキサン(4×10 mL)で連続洗浄して製品を精製します。
    7. ヘキサン:エチル酢酸(1:1)を溶出液としてシリカゲル(35–70メッシュ)上でフラッシュクロマトグラフィーで最終精製を行います。
  5. 薄層クロマトグラフィー(TLC)
    1. TLCシリカゲル60 F254プレートの薄層クロマトグラフィー(TLC)を用いて反応進行を監視します。
    2. 起始物質4を基準に反応を監視し、消費量を評価してください。
  6. メルティング・ポイント(M.P.)
    1. 化合物の先端を融点装置に加えます。融点範囲を記録してください。
    2. 測定値に補正を加えないでください。実験を三つずつ行ってください。
  7. 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)
    1. 化合物6を1〜2 mg 重みで測定します。化合物のストック溶液を1.0 mg/mLのアセトニトリル/メタノール(1:1、v/v)に調製します。
    2. 分析のためにストック溶液を0.5 mg/mLに薄めます。デュアルポンプ、自動インジェクター、UV検出器を備えたHPLCシステム(材料表参照)で試料を分析します。
    3. クロマトグラフィーデータ取得ソフトウェア(材料表参照)を用いてデータを取得・処理します。
    4. クロマトグラフィー条件は以下の通りに設定されます:逆位相のC18カラム、5μm(250 x 4.6 mm)(材料表参照)を使用します。流量を1.5 mL/minに設定し、254 nmでUV検出を監視します。移動相を0分から7分まで100%水(0.1%酢酸)に保つこと;100%水(0.1%酢酸)から90%アセトニトリル/メタノール(1:1、V/V)までの線形勾配を7〜15分かけて適用します。5分間100%水(0.1%酢酸)に戻し、さらに10分間保持します。
  8. 核磁気共鳴(1H, 13C)
    1. 化合物6を15〜20mgのNMRチューブに重量します。溶剤としてDMSO-D 6 を加えます。
    2. 標準パルスシーケンスを用いてNMR分光計(材料表参照)で1Hおよび13CのNMRスペクトルを取得します。
    3. 1H原子核の場合は400MHz、13C原子核では100MHzで機器を運転します。内部基準としてテトラメチルシラン(TMS)を使用してください。
    4. 化学シフト(δ)はppm(百万分の一)で表されます。実験から得られたFIDファイルを用いてNMRデータを可視化し処理します。
  9. 高分解能質量分析法(HRMS)
    1. 化合物6を1〜2 mg 重みで測定します。MeOH/CH3CNの1:1混合液で、0.1%の甲酸を含むサンプルを準備します。
    2. 解析は、線形イオントラップ質量分析計とオービトラップ質量分析装置を組み合わせた高分解能オービトラップ質量分析計(材料表参照)で行われます。
    3. エレクトロスプレーイオン化(ESI)を用いて、正イオンモードで10μL/minの流量で直接注入します。
    4. 質量分析データ解析ソフトウェアの元素組成ツール(材料表参照)を使って元素組成を決定します。
  10. カラムクロマトグラフィー – 化合物4
    1. シリカゲルカラムを60 Å(70–230メッシュ、0.063–0.200 mm)で準備します。カラムを適切にシリカゲルで詰めてください。
    2. 移動相としてヘキサン/エチル酢酸(7:3、v/v)を使います。原油化合物4をカラムに載せます。化合物を洗い出し、分株を集めます。
    3. TLCで分画を監視し、純粋な生成物を含む分画を組み合わせます。
  11. カラムクロマトグラフィー – 化合物6
    1. シリカゲルカラムを60 Å(70–230メッシュ、0.063–0.200 mm)で準備します。カラムを適切にシリカゲルで詰めてください。
    2. 移動相としてヘキサン/エチルアセテート(1:1、v/v)を使いましょう。粗い化合物6をカラムに載せます。化合物を洗い出し、分株を集めます。
    3. TLCで分画を監視し、純粋な生成物を含む分画を組み合わせます。

figure-protocol-1
図1。 試薬および条件:i = MgSO4、AcOH、EtOH、90°C、16時間;ii = C12H10, C12H10O, 230-250 °C, 15分;iii = POCl3、トルエン、110°C、2時間;iv = ピリジン、HCl、(CH3)2CHOH、85°C、16時間。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

2. 最小阻害濃度の決定

  1. 実験設計とプレート配置
    1. 前述の最小阻害濃度(MIC)を決定するために、比色メトリメトリーレサズリン還元マイクロプレートアッセイ(REMA)を用いて、M. tuberculosisの増殖抑制能力を評価する化合物を評価します。
    2. 技術的な重複を行わず、各化合物に対して独立した実験(生物学的複製3回)を実施します(化合物ごとに1行、実験ごとにプレート1回)。
    3. ポジティブコントロールとして作用する化合物と試験化合物を評価し、アッセイ条件が成長阻害を可能にするか確認します。
    4. 陽性対照としてイソニアジド(INH)およびリファンピシン(RIF)のアッセイ。
    5. A行とB行を制御化合物(それぞれINHとRIF)に割り当てます。
    6. テスト化合物( 図2のAからF)に次の行を割り当てます。
    7. 1列から10列までは、対照化合物と試験化合物を2倍に連続希釈し、各化合物が1行を占め、高濃度が第10列、低濃度が第1列に置かれます。
    8. 11柱を培養培地と細菌を含む生存性制御として、最終DMSO濃度2.5%で、対照や試験化合物を一切添加せずに準備します。
    9. 無菌制御用として、細菌細胞を含まない培養培地に、連続希釈濃度の高い制御化合物(カラム10と同じ)で対照化合物や試験化合物を加えます。
    10. MICプレートの代表的なレイアウトについては 図2 を参照してください。
  2. 試薬の調製
    1. オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ(OADC)を補足したミドルブルック7H9ブロスの調製。
      1. 200mLのガラス瓶に90mLの超純水を加え、7H9粉末0.47g、85%グリセロール0.24mL、10%トゥイーン80000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
      2. 培地を121°C、98.07kPaで10分間オートクレーブします。
      3. 培地を温かくして触ると温かくなるまで(約45〜50°C)冷ます。
      4. 10 mLのOADCを加えます(市販のOADCを使用しています。詳細は材料表を参照)。
      5. 保存温度は4°Cです。
        注意:試薬の比率を考慮し、実験に適した量を準備してください。
    2. ADCを用いたミドルブルック7H9ブロスの準備
      1. 200mLのガラス瓶に90mLの超純水を加え、7H9粉末を0.47g加えます。培地を121°C、98.07kPaで10分間オートクレーブします。
      2. 培地を温かくして触ると温かくなるまで(約45〜50°C)冷ます。ADCを10mL追加します。保存温度は4°Cです。
        注意:実験に適した量を準備し、試薬の比率を維持してください。
    3. 化合物ストック溶液の調製
      1. 各化合物のストック溶液を2 mg/mLでDMSOに溶かして準備します。
      2. -20°Cで保存してください。
        注:実験前に最大試験濃度は溶解度評価に基づいて定められています。溶解度の限界を判断するには、結晶の有無を目視で調べてください。結晶が観察された場合は、アリコートをさらに希釈して前の濃度の半分にします。この評価は5%のDMSOを用いて行います。
    4. 化合物作動溶液の調製
      注意:作業液は実験時に、7H9のスープにストック化合物を希釈し、10%のADCを補足して新たに準備してください。作業中の最終的なDMSO濃度は5%で、化合物濃度は意図された最高濃度の2倍であるべきです。特に、細菌がアッセイ中に曝露される最終的なDMSO濃度は2.5%であり、細菌懸濁液を加えた後の体積は2倍になります(セクション2.3、ステップ2.3.8参照)。
      注:当研究所で使用されている細菌株(結核菌 H37Ra、H37Rvおよび臨床分離株)ではDMSO 2.5%が耐容性があります。他の株や他の細菌種を扱う場合は、DMSOを試験化合物として用いて、増殖抑制を促進しない最高DMSO濃度を決定するための予備的なMIC実験を行いましょう。
    5. レサズリン溶液の調合
      1. 10mLの超純水に溶かして、0.01%のレサズリン溶液を準備します。
      2. 0.22μmフィルターを使って溶液を滅菌します。
        注:フィルター滅菌済みのレサズリンは4°Cで1週間14保存可能です。ただし、標準的な慣行として使用直前にこの溶液を準備してください。
  3. マイコバクテリアの製剤
    1. M . tuberculosis の単一コロニーを、10mLの7H9ブロスを10mLの遠心分離機チューブに接種し、10%OADC、0.2%グリセロール、0.05%Tween-80を補足します。
    2. 37°Cで100rpmの振動を続けて培養し、培養が600 nm(OD600)で0.6から0.8の光学密度に達するまで(約3〜4週間)培養します。
      注意: M. tuberculosis H37Rvはリスクグループ3病原体に分類されており、空気感染やヒトに致死的な病気を引き起こす可能性があります。すべての操作は、適切な個人用防護具(PPE)を用いて、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所内の認定バイオセーフティキャビネット内で実施してください。
    3. 細菌培養を均質化し、滅菌ガラスビーズ(1mm)で3分間渦巻く。
    4. サスペンションを15分間休ませて塊を定着させます。
    5. 上清液のOD600 を測定し、アリコートを−80°Cで保存します。
      注意:実験では、細菌懸濁液を理論上のOD600 (0.006)に希釈し、10%のADCを補った7H9スープにしてください。アッセイ中は1ウェルあたり100μLを96ウェルプレートに分散します。
  4. 96井板の準備
    1. 100μLの7H9ブロスに10%のADCを補足します。
    2. 100μLの7H9ブロスを10%ADC(5% DMSOを含む)を11および9から1のカラムに追加します。
    3. 化合物溶液200μL(最高濃度の2倍で調製)を10列に加えます(各化合物に1行割り当て)。
    4. 12列に化合物溶液100μLを加えます。2回の連続希釈を行います。10号柱から9号柱に100μLを移し、ピペッティングでよく混合します。
    5. 連続希釈を9列から1列まで続けます。1列の最後の100μLを廃棄します。
    6. 11列から1列1に細菌懸濁液(理論上OD600 /0.006)を100μL加えます。
    7. プレートを覆い、パラフィルムで密封し、37°Cで7日間培養します。
      注: 図2 はMICプレートの代表的なレイアウトです。この図を参照して、ステップ2.3.1から2.3.9までの解釈を参考にしてください。
  5. レサズリンの追加とデータ分析
    1. 各プレートウェルに0.01%レサズリン溶液60 μLを加えます。プレートを覆い、パラフィルムで密封し、37°Cで48時間培養します。
    2. 青(成長抑制)からピンク(細菌増殖)への色の変化を観察してください。
      注:一部の実験では、色が不完全に変わると紫色の井戸ができます。これは細菌の増殖と解釈してください。

figure-protocol-2
図2。 最小阻害濃度(MIC)を決定するために用いられるブロス微量希釈プレートの概略図。検査化合物の2回連続希釈は1列から10列に分散され、その後の希釈は10列から1列まで順次行われ、化合物濃度は10列に最も高くなっています。A行とB行は、それぞれ参照薬イソニアジドとリファンピシンを含む陽性対照群に対応しています。C〜H行は試験対象の化合物に対応します。11列は生存抑制(2.5%のDMSOおよび細菌接種を含む培地)を示し、12列は無菌制御(細菌接種物がない場合に化合物を含む培地)に対応します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. 哺乳類細胞株における細胞毒性評価

注意:すべての細胞培養操作は、認証済みクラスIIの生物安全キャビネット内で無菌条件下で実施してください。

  1. 哺乳類細胞株の調製
    1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)でヒト肝癌(HepG2)およびアフリカグリーンモンキー腎臓(Vero)細胞株を培養する。
    2. 培地に1.8g/Lの炭酸水素ナトリウム、10%胎児用牛血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1%アンフォテリシンB(完全培地と呼ばれる)を補足します。
    3. 細胞培養は37°Cで、CO2含有5%の加湿大気で培養します。
    4. サブコンフルエント細胞(70%–80%)を0.25%のトリプシン-EDTA溶液で5〜10分間処理して収穫します。
    5. 同じ量の完全な培地を加えてトリプシンを中和します。細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機で200 x g で5分間投与します。
    6. 上清液を廃棄し、細胞ペレットを10mLの新鮮な完全培地に再懸濁させます。
    7. 自動細胞計またはトリパンブルー排除ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度と生存率を測定します。
      注:トリパンブルー除去のため、細胞懸濁液10 μLと0.4%トリパンブルー溶液10 μLを混ぜてヘモサイトメーター(またはカウントスライド)に載せます。死んだ細胞や膜が損なわれた細胞は青色に見えますが、生存可能な細胞は染色されていません。生存率は% 生存率 = (染色されていない細胞数 ÷ 総細胞数)×100 × 100として計算します。存続率が90%≥時のみシーディングを進めてください。
    8. 細胞懸濁液を目標のシーディング密度まで希釈します。96ウェルの平底板の2から12列の各井戸に100μLの細胞懸濁液をまき。
      シーディング密度:Veroセルは4,000セル/ウェル;HepG2細胞は5,000細胞/ウェルで。
      注意:細胞が対数成長相にとどまり、48時間のアッセイ終点までに100%のコンフルエンスに達しないように、これらの密度を最適化してください。
    9. 吸光測定用の空白として、1カラム1に細胞なしの100μLの完全な培地を充填します。
    10. 各細胞株ごとに同じプレートを4枚準備します。MTTアッセイ用に2枚、NRUアッセイ用に2枚です。
    11. プレートを37°C、CO25 %で24時間インキュベートし、細胞の付着を促します。
  2. 化合物希釈と細胞処理
    1. 各試験化合物ごとに、Dulbeccoのリン酸塩緩衝生塩水(DPBS)または適切な溶媒(例:ジメチル硫酸)にストック溶液を準備します。DMSO)を担当します。
      注意:アッセイ前に、化合物が細胞培養培地に可溶性であること、および溶媒濃度が無毒であること(例:DMSOの<0.1% v/v)であることを必ず確認してください。
    2. プレートレイアウトにはブランク、適切なコントロール、技術的なレプリケートを含めるように設計してください。8つの濃度で最大9種類の化合物を検査するための代表的なレイアウトは 図3に示されています。
    3. 試験化合物を完全な培地で連続希釈し、目標濃度範囲をカバーします。すべてのレプリケートプレートに十分な容量が用意されていることを確認してください。
      注意:溶媒(例:DMSO)を使用する場合は、希釈媒質を補給し、最終溶媒濃度が連続希釈系列全体で一定に保たれるようにしてください。
      注:溶媒処理井戸(車両制御)は機能的な負のコントロールとして機能し、100%の細胞生存率を定義し、それに対して化合物処理済みの井戸が正規化されます。アッセイ検証には、細胞毒性の基準化合物(例:0.1%トリトンX-100または1 mMのドデシル硫酸ナトリウム)を、完全細胞死を引き起こすことが知られている濃度(生存率0%)を含めてください。これらの正逆対照井戸の吸収度値はブランク井と有意に変わらないはずで、生存可能性は0%であることが確認されます。
    4. 24時間の細胞付着期間終了後、逆立顕微鏡でプレートを目視で検査し、細胞が付着し、広がり、ウェル表面の約70%〜80%を均質に融合していることを確認します。汚染または不十分な接着を示す廃棄プレート。
    5. 培養培地をピペットチップで慎重に吸引し、細胞単分子層を乱さないようにピペットチップを各ウェルの側面に傾けて誘導します。乾燥を防ぐために区画ごとに処理板を設置します。
    6. 直ちに適切な試験化合物の希釈またはコントロール培地100 μLを対応するウェルに加えます。
    7. 処理済みプレートを37°C、CO25%で48時間インキュベートします。
  3. MTTアッセイプロトコル
    1. 血清フリーDMEMで0.5 mg/mLのMTT溶液を準備します。0.22μmのシリンジフィルターでろ過し、光から守ります。
    2. 48時間の治療後、細胞を目視で検査し、予想される治療効果を確認してください。
    3. MTTプレートから培地を慎重に吸引してください。各ウェルに0.5 mg/mLのMTT作業液を50 μL加えます。
    4. 光から保護された状態で37°C、CO25%で3時間孵育します。
      注:2〜4時間が一般的ですが、VeroおよびHepG2細胞の場合、通常3時間の培養で十分です。必要なら最適化してください。
    5. 各ウェルに100μLの100% DMSOを加え、フォルマザンの結晶を溶解させます。プレートを100rpmの軌道シェーカーに15分間置き、光から保護します。制御井戸を点検し、結晶が完全に溶解していることを確認します。マイクロプレートリーダーを使って570 nmの吸収率を読み取ります。利用可能な場合は、基準波長を630〜690 nmに設定してください。
  4. 中性赤色取り込み(NRU)アッセイプロトコル
    1. 血清フリーのDMEMとフィルターで40 μg/mLの中性赤(NR)溶液を準備します。NR脱着溶液を準備します:1%(v/v)氷河酢酸、49%(v/v)エタノール、50%(v/v)超純水。
      注意:氷河の酢酸は腐食性があります。フームフードのハンドル。
    2. 48時間の治療後、細胞を目視で確認してください。NRUプレートから培地を慎重に吸引してください。
    3. 各ウェルに40 μg/mL NR作業液100 μLを加えます。37°C、CO2 5%で2時間培養します。
      注:これらの細胞株では最大限の染料取り込みには2時間の培養が十分です。
    4. NRの動作液を吸引してください。各ウェルを150μLの滅菌PBSで優しく一度だけ洗い流します。
    5. 各ウェルにNR脱着溶液150 μLを加えます。150rpmの軌道シェーカーに置いて15分間、染料を抽出します。
    6. 完全な染料抽出を確保するために制御の井戸を点検してください。マイクロプレートリーダーを使って540nmの吸収率を読み取ります。
  5. データ分析
    1. バックグラウンドで、ブランクカラムの平均吸収を計算し、この値をすべての井戸から差し引くことで行います。
    2. 溶媒制御井戸と未処理対照井戸を比較して溶媒毒性の検査を行います。生存率が定義された閾値(例:80%)未満の場合は、溶媒細胞毒性を考慮します。
    3. 溶媒制御井戸に対する生存率のパーセンテージを計算する:
      %生存率=(処理井戸の吸水率/溶媒制御の平均吸収度)×100。
    4. 化合物濃度のlog10 に対して生存率%(y軸)をプロットします。CC50を決定するには非線形回帰モデル(シグモイダル線量応答、可変傾き)を用いてください。
    5. 選択指数(SI)はCC50 をMICで割って算出します。

figure-protocol-3
図3。 MTT/NRU細胞生存率アッセイのプレート設計例:最大9種類の化合物の細胞毒性を検査するための早期スクリーニングセットアップ。(A) プレート設計スキーム。第1列はセルなしの「空白」として割り当てられ、DPBSまたは完全な培地で満たされます。カラム2と12には細胞がシードされ、完全な培地(「未処理対照」)または完全な培地で処理されます(「溶媒制御」)。3番から11番目のカラムには細胞がシードされ、試験対象化合物の連続希釈処理が行われます。最大9種類の化合物を、1化合物あたり1濃度ごとに1つの複製が検査されます。(B) 48時間処理および最終アッセイステップ後のVero NRUプレート(上)とVero MTTプレート(下)の代表写真。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

合成により、標的化合物6は淡い緑色の固体(0.53g、収率67%)として得られました。化合物の融点は227〜229°Cで、UHPLC純度は99%(tR = 14.11分)(図4)です。化学構造は核磁気共鳴(NMR)分光法および高分解能質量分析法(HRMS)によって確認されました。1HNMRスペクトル(図5)では、ピペリジン部分に対応するシグナルが1.50から3.13 ppmの範囲で示されました。2位のメチル基は典型的な2.38 ppmのシングレットとして現れました。3段階の水素は6.56 ppmのシングレットとして現れました。フェニルリングは6.97 ppmと7.17 ppmの2つのダブレットを示し、結合定数は8.9 Hzでした。7位および8位の水素は7.63〜7.75 ppmの多重項を生成し、キノリンコアの5位の水素は8.59 ppm(J = 2.0 Hz)の二重項を生成しました。アミン水素は8.66 ppmのシングレットとして観察されました。13C NMRスペクトル(図6)では、2位置のメチル基に帰属する23.81 ppmの信号を示し、24.85から49.70 ppmの信号はピペリジン部分に対応しました。3ポジションの炭素は100.52 ppmでした。残存するダウンフィールド信号はキノリンコアとフェニルリング炭素に起因するとされました。HRMSは化合物6の分子式を確認し、m/z 396.1063(計算Cの21H23BrN3: 396.1070)に[M+H]+イオンを示しました。

figure-results-1
図4。 化合物 6のHPLCクロマトグラムおよび紫外線スペクトル。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2
図5. 1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)スペクトル 6。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-3
図6. 化合物6の13C NMR(101 MHz、DMSO-d6)スペクトル。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

M . tuberculosis に対する化合物の阻害活性は、目に見える細菌の増殖を完全に抑制する化合物の最低濃度であるMICを測定することで評価されました。REMAアッセイでは、色の変化が見られない(青色が残っている)は増殖抑制を示し、ピンク色に変わった場合は細菌の増殖を示します。イソニアジド(INH)とリファンピシン(RIF)が薬剤の管理薬として使われました。結果は 図7に示されています。各プレートには増殖対照(薬剤なしの11列)と無菌性対照(12列、ミコバクテリアなし)が含まれていました。化合物は10列(最高濃度)から1列(最低濃度)まで連続的に希釈されました。 図7に示すように、A行の化合物(イソニアジド)のMIC値は4列目に、B行(リファンピシン)およびC行(合成化合物)のMIC値は5列に観察されています。私たちの手元では、INHのMIC値はH37Rv株で0.31 μg/mL、H37Raで0.16 μg/mLであり、RIFではH37Rvで0.08 μg/mL、H37Ra株で0.01 μg/mLを得ています。

figure-results-4
図7。 レサズリンマイクロプレートアッセイ(REMA)を用いた 結核菌 における最小阻害濃度(MIC)の決定。A–C行、1〜10列:イソニアジド(A行)、リファンピシン(B行)、合成化合物(C行)の2回連続希釈。第11列:生存性管理(2.5% DMSO + 細菌を含む培地)。第12列:無菌管理(メディウム+コンパウンド)。青色は細菌の増殖抑制を示し、ピンク色はレサズリンがレソルフィンに還元されることによる細菌の生存性を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

NRU(Vero、上)およびMTT(Vero、下)アッセイの代表的な96ウェルプレートは 図3Bに示されています。MTTプレートでは、高濃度で半透明(生存細胞なし)から低濃度では深い紫色(細胞生存率が高い)へと、明確な色の勾配が見られます。同様に、NRUプレートは半透明から濃いピンク色までの勾配を示し、中性赤色染料が生存可能な細胞のリソソームに取り込まれていることを示しています。

顕微鏡は48時間の潜伏後のアッセイ状態を視覚的に確認します(図8)。 図8A は、健康で未処理の対照細胞(VeroおよびHepG2)と、細胞毒性濃度のこの化合物を処理した細胞を比較しています。処理された細胞は丸みを帯び、剥離しており、生存能力がありません。 図8B は最終溶解工程前の重要な視覚チェックポイントを提供します。生存細胞内での濃紫色のフォルマザン結晶の形成が期待される様子(MTTアッセイ)と、リソソーム内で赤色染料の蓄積(NRUアッセイ)の両方の細胞型で示されています。

生の吸収度データは車両制御に正規化され、非線形回帰によってプロトコルステップ3.5に詳述された線量応答曲線を生成しました。ターゲット化合物 6 (LABIO-17由来)では、NRUアッセイでCC50 が12.2 μM(Vero)および18.3 μM(HepG2)で、MTTアッセイでは両細胞株でCC50 >20 μMが検出されました。その結果、選択指数(SI)は30.5から>50の範囲となり、以前報告された10となりました。

figure-results-5
図8。 VeroおよびHepG2細胞における細胞毒性アッセイの代表的な顕微鏡画像。すべての画像は100倍倍で撮影されました。(A) 48時間後の細胞形態の比較。Vero(上)およびHepG2(下)細胞の未処理対照ウェルでは、健康で合流した単一層が示されています。対照的に、細胞毒性濃度の化合物で処理された細胞は、丸みを帯び、縮み、プレート表面から剥離したように見えます。(B) 試薬添加後および溶解化前の重要な視覚チェックポイント。MTTアッセイ(各細胞株の左パネル)では、生存可能な細胞に目に見える濃紫色のフォルマザン結晶が含まれています。NRUアッセイ(各細胞株の右側パネル)では、生存可能な細胞は完全なリソソーム内に赤色染料の蓄積を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

単離酵素ではなく全細胞活性に基づく表現型スクリーニングアプローチは、 結核菌に対する有効成分を特定する効果的な戦略です。ここでは、候補化合物の化学合成、最小阻害濃度(MIC)測定による阻害活性の評価、そしてMTTおよびNRUアッセイを用いた哺乳類細胞(VeroおよびHepG2)における細胞毒性の評価を含むこのアプローチの初期段階を説明しました。

合成経路は主に3つのステップ(図1)で構成され、運用上単純な変換を用いて高純度の標的化合物を提供します。再現性と効率性を決定づけるいくつかの重要なステップが特定されました。初期の凝縮には、完全な中間形成を保証するために、正確な化学量論的制御と持続的な逆流が必要です。熱循環前の溶媒除去が不完全であると、環閉効率に悪影響を及ぼす可能性があります。環化段階自体は厳密な温度管理を要求します。なぜなら、十分な加熱が不足すると芳香化が不完全になる一方で、過剰または長時間の加熱は副産物の生成を促進する可能性があるからです。塩素処理中は、反応温度の慎重な制御とリン酸化物の徐々の添加が推奨されており、副反応を最小限に抑え、4段階での選択的活性化を確実にします。手法最適化の過程で、手続き上の細かな調整により堅牢性が向上しました。環化後の不完全な降水の場合、急速な焼入れではなく徐々の冷却が固体回復を促進しました。求核置換段階で収率の低下が観察された場合、反応時間を延長したりアミン純度の検証を行ったりすることが有益であることが証明されました。

この方法の主な制約は、高温の環化やホスホリルクロリドのような腐食性塩素試薬が必要であり、特定の実験施設と安全性を必要とします。置換電子効果は異なるアニリンやアミンの再最適化を必要とし、適応なしの広範なスキャフォールドの多様化を制限することがあります。しかし、コンラッド–リンパッハ手法は、Skraup型合成(過激な酸化剤)や遷移金属触媒プロトコル(特殊な触媒/不活性大気)よりも運用上単純です。この金属を使わない戦略は、医薬品化学用の官能基質キノリン中間体を効率的に生成します。

MICを決定するプロトコルは、目視検査に基づく比色アッセイです。この方法の潜在的な課題は、色の変化が不完全で、明確な青(抑制)やピンク(成長)ではなく紫色の井戸が現れることです。もしこれが起こるなら、それはマイコバクテリアの増殖を抑制できなかったと解釈すべきです。さらに、化合物が連続希釈によって評価されるため、最大試験可能な濃度は化合物の溶解度によって決まります。その結果、最大溶解濃度で阻害が認められない場合、結果が決定的でない場合もあります。さらに、他の検査機関がプロトコルの特定の手順をそれぞれの条件に合わせて調整することがあり、その結果にばらつきが生じることも考慮すべきです。スループットを向上させるために、このプロトコルは自動化に適応可能です。96ウェルプレート準備のための液体取り扱いシステムを導入することで、ピペッティング誤差を減らし、精度と再現性が向上します。

細胞毒性評価プロトコルは、2つの異なる哺乳類細胞株(VeroおよびHepG2)と2つの補完的な生存可能性アッセイ(MTTおよびNRU)を用います。このプロトコル内のいくつかのステップはデータの再現性と正確性を確保するために重要であり、各検査室は独自の検証を行うべきです。例えば、初期の細胞シーディング密度は慎重に最適化される必要があり、過剰なコンフルレンスは接触阻害や代謝状態の変化を引き起こし、結果を混乱させる可能性があり、またアンダーシーディングは細胞を軽微な損傷にさらしやすくし、毒性を過大評価する可能性があります15。さらに、最高濃度は化合物の溶解度によって制限されることが多く、降水によって不正確な結果が出ることもあります。また、提案されたプレートレイアウト(図3A)は一次スクリーニングを目的としており、技術的複製を避けて端面効果を無視して独立した生物学的複製による検証を優先することで、試験化合物の数を最大化します。

このプロトコルの大きな強みは、MTTおよびNRUアッセイの両方を並列に実装できることです。両者とも確立されていますが、測定する細胞パラメータは異なります。MTTアッセイはミトコンドリア脱水素酵素の代謝活性を定量化し、一般的に細胞の生存率と相関します。しかし、このアッセイは還元性や酸化性を持つ化合物、またはミトコンドリア呼吸を妨げる化合物の干渉を受けやすく、誤った結果の可能性が生じる可能性があります15。NRUアッセイを並行して実行することで、こうしたアーティファクトのトラブルシューティングに役立ちます。NRUアッセイは、生存可能な細胞がリソソームの完全性を維持する能力と染料取り込みに必要なpH勾配を測定します。17。MTTとNRUの結果の不一致は、ミトコンドリア機能障害など特定の毒性メカニズムを明らかにし、さらなる調査が必要です。

まとめると、このプロトコルは潜在的な抗結核薬候補を特定するための基本的なステップを示しています。選択性と効力が有望な化合物は、その後、 in vivo 研究などより複雑な感染モデルへと進化させることができます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者から利益相反の可能性は報告されていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、国立科学技術研究所(NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TUTCULOSIS、MCTI/CNPq/sectics/ms/capes/fapergs、助成金番号404838/2024-0)、CNPq/MCTI N° 44/2024 – ユニバーサル(助成金N° 420934/2025-1)、およびFAPERGS 06/2025 – PqG(助成金番号 25/2551-00002734-9)によって支援されました。C.V.B(CNPq、助成金番号311949/2019-3)、L.A.B.(CNPq、助成金番号303499/2021-4)、およびP.M.(CNPq、助成金番号310888/2022-0)はCNPqの研究キャリア賞受賞者です。この研究は、ブラジル・ニーベル・スペリオル・オアメント・デ・ペッソアル・デ・アペルデナツァン・デ・アペルフェイオアメント(CAPES、財務コード001)によって一部資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞株
HepG2 (ヒト肝細胞癌)ATCCHB-8065ヒト肝臓がん細胞株
Mycobacterium tuberculosis H37RaATCC25177
Mycobacterium tuberculosis H37RvATCC27294
Vero (アフリカザイール猿腎臓)ATCCCCL-81霊長類腎臓上皮細胞株
化学物質 – 合成
4-(Piperidin-1-yl)anilineSigma-AldrichTCI: P0887化合物5/6のアミン前駆体
4-BromoanilineSigma-Aldrich108-67-8キノリン合成の開始物質
酢酸（氷酢酸）Sigma-Aldrich695092合成と移動相調製における試薬
アセトニトリル（HPLCグレード）Sigma-Aldrich34967HPLC移動相成分とNMR溶媒
クロロホルムSigma-AldrichC2432製品抽出用の溶媒
DMSO-d6（重水素化）Sigma-Aldrich175641NMR溶媒
Dowtherm A（熱伝達流体）Sigma-Aldrich / SolutiaTBD熱サイクリング用の高沸点溶媒（230–250 °C）; 以前はDowtherm® Aとしてリストされていました
エタノール（絶対エタノール）Sigma-Aldrich459836コンラッド-リンパッハステップの反応溶媒
エチル酢酸（HPLCグレード）Sigma-Aldrich270989カラム溶出成分
エチルアセト酢酸Sigma-AldrichE12806キノリン環形成用β-ケトエステル試薬
ホルム酸（HPLCグレード）Sigma-AldrichF0507HPLCおよびHRMS用移動相の0.1%添加物
ガラスビーズ（1 mm、滅菌済み）Sigma-AldrichG8772M. tuberculosis培養の均質化用
HCl（塩酸、37%）Sigma-Aldrich320331求核置換反応における酸触媒
ヘキサン（HPLCグレード）Sigma-Aldrich34859カラムクロマトグラフィー用の非極性溶出物
イソプロパノールSigma-Aldrich278475化合物6の合成反応溶媒
硫酸マグネシウム（MgSO4、無水）Sigma-AldrichM7506乾燥剤と反応触媒
メタノール（HPLCグレード）Sigma-Aldrich34860HPLC移動相とNMR溶媒成分
リン酸オキシ塩化物（POCl3）Sigma-Aldrich201170中間体4の塩素化試薬
ピリジンSigma-Aldrich270970求核置換反応における塩基触媒
フラッシュクロマトグラフィー用シリカゲル（35–70メッシュ）Macherey-Nagel815349フラッシュクロマトグラフィーステップの固定相
カラムクロマトグラフィー用シリカゲル60 Å（70–230メッシュ）Macherey-Nagel815381カラムクロマトグラフィーの固定相
硫酸ナトリウム（Na2SO4、無水）Sigma-Aldrich239313有機相の乾燥剤
TLC シリカゲル60 F254プレートMerck1.05554薄層クロマトグラフィーモニタリング
トルエンSigma-Aldrich244511塩素化ステップの溶媒
超純水Millipore / 同等品N/A移動相調製に使用; 以前はテキスト中でMilli-Q水として参照されていました
機器 & 器具
0.22 µm シリンジフィルターMillipore / 任意SLGP033RSレザズリン溶液の滅菌（2.1.4）; MTT作業溶液のろ過（3.3）; ニュートラルレッド作業溶液のろ過（3.4）
0.45 µm シリンジフィルターMillipore / 任意SLHA033SS移動相溶液のろ過
15 mL コニカルチューブ（滅菌済み）Falcon / 任意352097または同等品トリプシン処理後の細胞懸濁液の回収と遠心
96ウェルプレート（フラットボトム、組織培養処理済み）Corning / 任意3596細胞毒性とMICアッセイ用
アルミ箔任意—MTTおよびNRUインキュベーションおよび振とうステップ中のプレートの光保護
オートクレーブ任意—培地の滅菌（121 °C、98.07 kPa、10分）
バイオセーフティキャビネット（クラスII、認証済み）任意（BSL-3認証）—M. tuberculosis操作に必要（BSL-3）
セルカウンター（自動）またはヘモサイトメーター例：Bio-Rad TC20 / NeubauerTBD細胞濃度と生存率測定用
遠心分離機（200 × g可能）任意—細胞ペレティングステップ
CO2インキュベーター（37 °C、5% CO2、加湿）任意—細胞培養と処理インキュベーション
加熱マントルFisotom 12MDowtherm® Aを使用した温度制御加熱マントル
HPLCシステム（Dionex UltiMate 3000）Thermo Fisher Scientific5035.9200デュアルポンプ、自動インジェクター、UV検出器; 化合物6の純度分析用
倒立顕微鏡（または同等品）任意—細胞の接着（3.2）、処理チェックポイント（3.3、3.4）での視覚検査、およびアッセイステータスの検証
マグネティックスターラー / ホットプレート任意—溶液調製と反応混合
マススペクトロメーター（LTQ Orbitrap Discovery）Thermo Fisher Scientific—

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pai, M. Tuberculosis. Nat Rev Dis Primers. 2, 16076(2016).
  2. Salgame, P., Geadas, C., Collins, L., Jones-López, E., Ellner, J. J. Latent tuberculosis infection – Revisiting and revising concepts. Tuberculosis. 95 (4), 373-384 (2015).
  3. Lyon, S. M., Rossman, M. D. Pulmonary tuberculosis. Microbiol Spectr. 5 (1), (2017).
  4. Houben, R. M., Dodd, P. J. The global burden of latent tuberculosis infection: a re-estimation using mathematical modelling. PLoS Med. 13 (10), e1002152(2016).
  5. Global tuberculosis report 2025. , World Health Organization. (2025).
  6. Larkins-Ford, J., et al. Systematic measurement of combination-drug landscapes to predict in vivo treatment outcomes for tuberculosis. Cell Syst. 12 (11), 1046-1063.e7 (2021).
  7. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug resistant Tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 24 (6), 101574(2021).
  8. Alsayed, S. S. R., Gunosewoyo, H. Tuberculosis: Pathogenesis, Current Treatment Regimens and New Drug Targets. Int J Mol Sci. 24 (6), 5202(2023).
  9. Pauli, I. Discovery of new inhibitors of Mycobacterium tuberculosis InhA enzyme using virtual screening and a 3D-pharmacophore-based approach. J Chem Inf Model. 53 (9), 2390-2401 (2013).
  10. Paz, J. D., et al. Novel 4-aminoquinolines: Synthesis, inhibition of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-acyl carrier protein reductase, antitubercular activity, SAR, and preclinical evaluation. J Med Chem. 245 (Pt 1), 114908(2023).
  11. Quemard, A., et al. Enzymatic characterization of the target for isoniazid in tuberculosis. Biochemistry. 34, 8235-8241 (1995).
  12. Parish,, Tanya,, Roberts,, David, M. Mycobacteria Protocols. , Third edition, Humana Press. New York. (2015).
  13. Franzblau, S. G., DeGroote, M. A., Cho, S. H., Andries, K., Nuermberger, E., Orme, I. M., Mdluli, K., Angulo-Barturen, I., Dick, T., Dartois, V., Lenaerts, A. J. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland). 92 (6), 453-488 (2012).
  14. Palomino, J. C., Martin, A., Camacho, M., Guerra, H., Swings, J., Portaels, F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  15. Riss, T. L. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2016).
  16. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  17. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nat Protoc. 3 (7), 1125-1131 (2008).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

4MTTMycobacterium tuberculosis

関連記事