新鮮な アロエベラ ジェル抽出物の培養ベース非検出成長評価および抗酸化プロファイリング

サマリー

本プロトコルは、新鮮な アロエベラ 内ゲル抽出物の無菌調製、ポテンシオメトリックpH測定、自動ABTS比色測定による総抗酸化能力評価、定められた培養条件下での検出不可能な増殖評価、70:30(v/v)ア ロエベラの抗菌予備スクリーニングを記述しています。/N-アセチル-L-システイン試験混合物は、ディスク拡散および定性的二重管希釈によるものです。

要約

アロエベラ (Aloe barbadensis Miller)は、外用薬や補完薬製品に広く使われています。しかし、総抗酸化能力(TAC)、pH挙動、培養ベースの検出不可能な成長状態、および抗菌剤の予備スクリーニングを同時に評価する標準化された実験室ワークフローは限られています。新鮮なインナージェルの アロエベラ 抽出物は無菌で調製され、5%、10%、15%、20%(w/v)で配合されました。pHはポテンショメトリック測定を行い、TACは自動ABTSラジカルカチオン比色測定法で測定されました。培養ベースの検出性なし増殖評価を用い、抽出物を血液寒天、エオシンメチレンブルー寒天、サブローデキストロース寒天に接種し、その後24時間、48時間、72時間で好気培養および目視検査を行いました。70:30(v/v)ア ロエベラ/N-アセチル-L-システイン試験混合物の抗菌スクリーニングを、標準的な参照株に対してディスク拡散および定性的二重チューブ希釈アッセイで実施しました。TACはグループ間で有意に異なり(Kruskal-Wallis, p = 0.014)、20%の定式化で最も高い値が観察されました。72時間の観察期間中、試験された培養条件下では目に見える細菌や真菌の増殖は観察されませんでした。 アロエベラ/N-アセチルL-システイン試験混合物は、阻害ゾーンが11mmから17mmの範囲を生み出し、最大のゾーンは 緑膿菌 に対して観察されました。このワークフローは、新鮮な アロエベラを調製し、予備的に特徴付けするための実践的な実験室アプローチを提供します。初期段階の補完医療研究のための基底製剤。

概要

アロエベラは、伝統医学での長年の利用と、製薬、生物医学、化粧品、食品研究における重要性の拡大により、科学的注目を集め続けています(^1,2,3)。この薬用植物は、多糖類、フェノール化合物、アントラキノン、ビタミン、ミネラル、酵素、その他の低分子量代謝物など多様な生物活性成分を含み、治療的および機能的特性に寄与する可能性があります。^1,2,3。これらの成分の中で、アセマンナンはその生体材料の可能性や組織修復、免疫調節、^{再生応用における}役割が報告されていることから強調^{されています。}並行して、フェノール系およびその他の抗酸化作用化合物は、アロエベラの活性化、保護、生物学的支援効果と関連しています。製剤^2,3。

近年、アロエベラの高度な製剤システムやバイオアクティブ素材への導入への関心が高まっています。アロエベラ系ハイドロゲル、生体材料インク、ナノコンポジット、三次元プリント足場は、高い水和能力、生体適合性、多機能生物学的特性により、創傷治癒や組織支持の応用として研究されています(4,6,8,9,10,11)。実験研究により、アロエベラ含有材料は湿潤な環境の維持、製剤の物理化学的特性の改善、および選択されたin vitro、in vivo、製剤依存条件4,7,8,9,10,11において抗酸化または抗菌支援を提供することで創傷管理を支援する可能性があることが示されています。さらに、アロエベラは食品保存や製剤の応用にも研究されており、ジェルベースのコーティングや関連システムが酸化安定性の向上、感覚質の向上、微生物学的性能の向上と関連しています(^12,13)。これらの発展は、アロエベラが伝統的なハーブ製品であるだけでなく、幅広い製剤志向^の潜在力を持つ多機能な天然素材としてもますます認識されていること^{を示しています。}

アロエベラの生物学的関連性は、抗菌および微生物学的な応用にも及びます。最近の研究では、アロエベラまたはアロエベラ含有製剤が、プロピオニバクテリウム・アクネス、腸球菌、カンジダ属、創傷感染から分離された臨床分離株など、臨床的に重要な微生物に対して抑制効果を示すことが報告^{されています。}過去のin vitro証拠では、ヘリコバクター・ピロリリ系のリファレンス株および臨床分離株に対するインナーゲルアロエベラの活性も示されています¹⁸。さらに、ハイブリッドアロエベラ含有システムは抗菌、抗酸化、創傷治癒の複合能力を示し、この植物由来の多機能性をさらに支持しています¹⁹。しかし、アロエベラの生物学的性能は、使用される植物の比率、抽出手順、濃度、取り扱い条件、ゲルの鮮度、そして試験された調製物に内側のゲルのみを含むかラテックス^{関連成分を含む}かなど、いくつかの方法論的変数によって影響^{を受けます。}これらの要因は特に重要であり、内側のゲルと外側の葉の分画は組成や^毒性学的プロファイルの両方で異なるためです。

文献が増えているにもかかわらず、重要な方法論的ギャップは依然として存在します。多くの発表された研究では、抗酸化作用、物理化学的特性、微生物学的評価、抗菌性能が単一の統合ワークフロー内で評価されるのではなく、個別に評価されることが多いです。しかし、製剤に焦点を当てた研究では、これらのパラメータは密接に関連しています。製剤は抗酸化活性が良好であっても、さらなる実験開発に適したとみなされる前に、慎重な微生物学的評価と物理化学的特徴付けが必要です。したがって、酸化還元関連評価、pH評価、培養ベースの検出不可能な増殖試験、および抗菌素の予備スクリーニングを組み合わせた実験室のワークフローは、新鮮 なアロエベラ 製剤の初期段階の特徴付けにおいて、より実践的かつ有益な基盤を提供する可能性があります。

したがって、本研究は、pH特性、総抗酸化物質容量、定義された実験室条件下での培養による検出不可能な増殖状態、ディスク拡散および定性的二重チューブ希釈による予備的抗菌スクリーニングの観点から、異なる濃度で調製された新鮮な内ゲルア ロエベラ 抽出剤の配合を評価することを目的とした。これらの評価を単一の実験ワークフローに統合することで、 アロエベラの予備的特徴付けのための実践的なベースラインアプローチを提供するよう設計されました。補完医療研究を目的としたベースの製剤。

プロトコル

1. アロエベラ 抽出および希釈系列の調製

1. 室温で育てたアロエベラの成熟した葉を収穫し、流水でしっかりすすいで残留物を取り除きましょう。
2. バイオセーフティレベル2(BSL-2)キャビネット内で、滅菌手袋を用いて70%エタノールで葉面を消毒します。70%エタノールを塗布した後、葉の表面を完全に自然乾燥させてから、無菌切開を行います。
3. 滅菌メスを使い、葉の遠位端と縁を除去し、黄色いラテックスの滲出液を約 30分間完全に排出させた後、葉を縦方向に切ります。透明な内側のジェルだけを慎重に分離し、外皮や残留ラテックス層は避けてください。
4. アロエベラの内側ゲルを慎重に滅菌容器に移し、約5〜10分間、約 2,500rpm (または同等の中高渦設定)で間欠的渦を均質化します。 特定の機器に温度管理が必要な場合を除き、室温で手順を行ってください。
5. 無菌条件下で、新鮮な アロエベラ を無菌蒸留水で5%、10%、15%、20%(w/v)のインナージェル抽出剤を準備します。例えば、5%(W/V)を5gゲルとして最終体積100 mLに準備し、残りの濃度も同様に調整します。

2. pH測定

1. 各測定シリーズの前に、標準pH 4.01、7.00、10.01バッファー溶液とNISTトレーサビリティを用いて3点pHメーターの校正を行います。
2. 室温(20–25°C)で各濃度のpHを測定します。各濃度ごとに少なくとも3回の技術的再現を記録してください。

3. 総抗酸化能力(TAC)測定

1. TAC測定にはステップ1で調製された アロエベラ 抽出剤(5%、10%、15%、20%)を使用します。
2. 分析前にすべての試薬と試料を室温(20〜25°C)に持ち込み、分析の一貫性を確保してください。
3. アッセイ開始前に、メーカーの標準作業手順に従って自動生化学分析装置(Rel Assay, Turkey)を校正してください。
4. Erel法に基づく総抗酸化能力(TAC)試薬を分析装置の試薬区画に搭載します。
5. ア ロエベラ をピペットで抽出し、校正済みのマイクロピペットを使って適切なサンプルカップまたは反応井にサンプルを移します。(サンプル容量:5 μL)
6. ABTSラジカルカチオン法の分析プロトコルを用いて、製造者が指定した試薬体積と培養設定に従い、分析装置のプログラムプロトコルを用いてTACアッセイを実行します。
7. 反応を自動進行させ、その間、試料中の抗酸化物質が着色されたABTSラジカルカチオンを還元し、吸収率を低下させます。
8. TAC法で定義された波長で吸収光度の変化を分光光度測定で測定します。(波長:660 nm)
9. 分析装置のソフトウェアを使って、試料の吸収変化とTrolox等価校正曲線を比較して総抗酸化容量値を計算します。
10. TAC結果は、抽出物の単位体積あたりのmmolトロロックス換算値/Lとして表します。
11. 分析の信頼性を確保するために、すべての測定を二重に行ってください。

4. 培養に基づくア ロエベラ の検出性なし増殖評価。内側ゲル

1. 各抽出物10μLを、より正好のループ(10μL)(コロニーカウント法)を用いて血液寒天、エオシンメチレンブルーガー、サブローデキストロース寒天に接種します。
2. 培養ベースの検出不能増殖評価では、校正済みマイクロピペットを用いて標準化された50μLアリコートを無菌的に血液寒天、エオシンメチレンブルーガー、サブローデキストロース寒天プレートに投与し、無菌使い捨てループ(10μL)で優しく広げます(培養による直接点滴法による増殖評価)。
3. 血液寒天とエオシンメチレンブルー寒天板を37°Cで好気的に、Sabouraudデキストロース寒天板を25〜28°Cで好気的に培養し、24時間、48分、72時間で肉眼で増殖を検査します。各培地の無接種プレートを1枚並行して培養し、陰性対照群として行います。

5. アロエベラ検査混合物の抗菌活性評価

1. 無菌条件下で、滅菌アロエベラインナーゲル抽出物70%とN-アセチルL-システイン溶液(滅菌水中で10% w/v)を混ぜて均質試験液を準備します。
   注:この混合物は葉から剥がすり取ったゲルの高粘度を抑え、より流動的な粘度をもたらします。この複合処方を予備的なスクリーニング混合物と考えてください。したがって、抗菌薬の所見は両成分の複合的な活性を反映したものと解釈してください。
2. 均質化混合物を徹底的にボルテックスし、均一な溶液が得られるまで繰り返します。
3. 以前に冷凍保存されていた標準細菌株の Enterococcus faecalis ATCC 29212、 Staphylococcus aureus ATCC 29213、 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853、および 大腸菌 のサブカルチャー。ATCC 25922は-80°Cで保存し、グラム陽性菌の標準的な血液寒天とグラム陰性菌の標準的なエオシンメチレンブルー寒天に保存し、37°Cで18〜24時間培養します。
4. 培養終了時には、培養コロニーから無菌生理食塩水を用いて0.5マクファーランド濁度に調整した細菌懸濁液を準備し、抗菌感受性試験の標準接種調製推奨に従い³⁸。
5. Mueller-Hinton寒天プレートに、各標準化された細菌懸濁液を均一に接種し、無菌綿棒を用います。
6. 校正済みマイクロピペットを用いて、各滅菌6mm抗菌ディスクに標準化された15μLのアロエベラ/NAC検査混合物を塗布します。同じロードボリューム、吸収時間(少なくとも2分)、自然乾燥時間(約5分)がすべての複製に適用され、手順の整合性を確保しました。この体積は、植物抽出物ベースのディスク拡散スクリーニングにおける6mmディスクの実用的な負荷量として選ばれ、すべての実験で一定に保たれました。
7. エキス含浸したディスクを接種した寒天プレートの表面に無菌鉗子を使って置きます。
8. プレートは37°Cで好気条件下で18〜24時間孵育します。
9. 培養後、各阻害ゾーンの直径(ディスク径を含む)を定規を使って最も近いミリ単位で手動で測定します。実験を単一の記述的測定として実施し、記録されたゾーン直径を個別に観測値として報告します。標準ディスク拡散測定推奨に従い、プレートを目視で検査して測定^{を行います。}
10. 70:30(v/v)のアロエベラ/NAC試験混合物をミューラー・ヒントンブロスに2倍の連続希釈(1/2、1/4、1/8、1/16)で準備します。
11. 各チューブに対応する0.5マクファーランド標準化細菌懸濁液を無菌生理食塩水で調製した 500μL を接種します。各参照株ごとに別々の希釈系列を準備し、以下の条件下で接種チューブを培養します。
12. 接種チューブは37°Cで18〜24時間培養します。
13. スープ対照群に対する濁度から微生物の成長を視覚的に評価すること;アッセイを正式なMIC決定としてではなく、定性的に解釈してください。
14. アロエベラ/NAC含浸ディスクと並行して、シプロフロキサシンディスク(5μg)を陽性コントロールとして使用してください。同じ陽性コントロールディスクをEnterococcus faecalis ATCC 29212、Staphylococcus aureus ATCC 29213、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853、Escherichia coli ATCC 25922に適用し、椎間板拡散条件下での感受性を確認します。
    注意:すべての微生物学的手順はBSL-2条件下で実施し、培養直後にゾーン径および濁度の観察結果を記録し、その後の記述分析のために行ってください。このプロトコルはA. veraの無菌製剤を組み合わせています。外用および補完薬用植物由来の製剤開発を支援するための補完的な生化学的および微生物学的アッセイを用いた抽出物。ワークフローは日常的な実験室向けに実用的に設計されており、pHおよび酸化還元スクリーニング(TAC)は無菌培養および一般的に使われる2つの抗菌アッセイ(ディスク拡散法とチューブ希釈法)と併用して実施可能です。

結果

異なる濃度での アロエベラ 抽出物のpH値

pHプロファイルは濃度間で非単調パターンを示しました。平均pH値は、それぞれ5%、10%、15%、20%の処方で6.47、6.60、6.26、6.28でした。全体のグループ差は有意であった(p = 0.024)。5%および10%の配合は比較的高いpH値を示したのに対し、15%および20%の配合はより低いpH値に集中していました(p < 0.05)(表1 および 表2)。

総抗酸化能力(TAC)

総抗酸化能力(TAC)は4つの A. vera 抽出物濃度で有意に異なっていました。Kruskal-Wallis解析では、グループ間でTAC値に統計的に有意な差(p = 0.014)が示されました。平均...

ディスカッション

本研究は、pH測定、総抗酸化能力(TAC)分析、培養ベースの検出不可能な増殖評価、記述的抗菌スクリーニングを組み合わせることで、新鮮なインナーゲルア ロエベラ 抽出剤製剤の予備的特徴づけのための統合的な実験室ワークフローを提供します。新鮮な内ゲルア ロエベラ の濃度が増加するとTAC値が上昇し、定められた実験室条件下での短期培養モニタリングでは目に見える細菌や真菌の増殖は観察されませんでした。これらの結果は、検証済みの不稔性、長期的な微生物学的安定性、臨床適性の証明ではなく、測定可能な抗酸化活性および培養による検出不可能な増殖の証拠として解釈されるべきです。

抗酸化物質の発見は、アロエベラジェルがフェノール化合物、多糖類、その他の酸化還元活性成分を含む抗酸化物質の自然な供給源であると記述した以前の報告と一致しています(21,23,27)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(-)80 C ディープフリーザー	Thermofisher/USA	サンプル保管	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	サンプル準備	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	培養接種	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	培養接種	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	培養接種	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	培養接種	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	培養希釈	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	サンプル準備	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	サンプル分析	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	サンプルTAC分析	M201 (Smart Model)
TACキット	Rel Assay(Turkey)	キット	RL0017