エンドツーサイド吻合技術を用いた子宮頸部ヘテロトピオマウス心臓移植による移植免疫学の研究

サマリー

このプロトコルは、マウス頸部心臓移植のための簡略化された端側縫合吻合技術を提示し、移植免疫学の研究において堅牢かつ再現性の高いモデルを提供します。

要約

マウスヘテロトピア心臓移植は移植研究における重要な前臨床モデルです。マウスにおける頸部異位性心臓移植は、移植片の生存率を直接的に目視かつ触覚でモニタリングできること、手術外傷の軽減、術後の回復速度など、明確な利点を提供します。そのため、移植免疫学の研究においてますます価値あるプラットフォームとなっており、特に遺伝子組み換えや薬物誘導による生理的条件が悪化した動物にとって、また二次または複合臓器移植を必要とする実験においては、頸部領域が唯一の現実的な部位となることが多いです。従来の頸部移植技術は、端から端までの縫合法でもカフ法でも、受容者の総頸動脈および外頸静脈の永久結紮が必要であり、これにより脳灌流が妨げられ、異物や血行動態の乱が生じる可能性があります。これらの制限に対処するため、本論文では端側血管吻合を用いた洗練された頸椎心臓移植技術を詳述します。この方法は、受容者の総頸動脈と外頸静脈を保存し、正常な脳灌流を維持し、永久的な血管結紮に伴う合併症を回避します。このプロトコルは、ドナー心臓採取からレシピンの吻合、術後ケアまでの手順を詳細に説明しています。代表的な結果は、高い手術成功率(96.7%)と同種移植片拒絶反応の研究におけるモデルの有効性を示しています。この技術は、移植免疫学の研究者にとって生理学的に関連性があり技術的にアクセスしやすいモデルを提供します。

概要

過去半世紀にわたり、移植免疫学は免疫学者や移植専門医の中心的な焦点であり続けています。現在、固形臓器移植は広く行われており、末期臓器疾患の最も効果的な治療法となっています。しかし、移植片拒絶反応は根本的に解決されておらず、移植における主要な障害の一つであり、移植片喪失の主な原因の一つとなっています^。したがって、全身免疫抑制を軽減または回避しながら拒絶反応を克服または緩和することは、依然として大きな課題であり、この分野における重要な研究目標です。

血管化動物臓器移植モデル、特にマウスモデルは移植免疫学の進展に重要な役割を果たし、臨床翻訳の重要な科学的基盤を提供してきました^。例えば、今日臨床で用いられている多くの免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシンは、マウス^{移植モデルで}初めて成功裏に検証^{されました。}

マウスヘテロトピ心臓移植(HT)モデルは、豊富な遺伝株や研究用試薬があること、比較的簡単な手順と術後のモニタリングが容易であることから、最も広く使われている前臨床モデルの一つです。そのため、急性拒絶反応の研究、免疫寛容の誘導、新しい免疫抑制剤のin vivo評価の重要なプラットフォーム^{となっています。}

最初のマウスヘテロトピアHTモデルは1973^年にCorryらによって確立されました。このモデルでは、ドナー心臓を受容者の腹腔内に置き、移植片大動脈と肺動脈(PA)をそれぞれ受容者の腹部大動脈と下腔静脈(IVC)に両端対横に吻合します。この方法は数十年にわたり腹部HTの標準的な技術として使われ続けました。耐性研究において第三者同種移植を受け入れる必要性から、HTの第二の研究拠点が検討されました。これによりマウスにおける子宮頸部HTモデルが開発され、移植片の生存可能性を直接目視で評価できること、手術外傷の減少、術後感染リスクの低減など、他の利点も提供されています(^5,8,9)。1991年にChenら8^{はマウスにおける}頸部異所性HTモデルを初めて記載し、ドナー大動脈とPAをそれぞれ受給者の総頸動脈(CCA)および外頸静脈(EJV)に端から端まで手縫合するものでした。しかし、このモデルは、ドナー大動脈と受給者のCCA間の深刻な不一致による大きな技術的課題により、血管吻合が非常に困難だったため、広く採用されることはありませんでした。

同じく1991年には、松浦ら9が頸部HTモデルにおける血管吻合のための非縫合カフ^{技術を導入}しました。この方法は技術的に難しい手動の血管縫合を省き、手順を簡素化し、習得しやすくします。その後、カフ技術の多くの技術的改良^{が報告されています。}現在、カフ法は特に微小血管縫合の経験のない研究者の間で頸椎移植で広く使用されています。しかし、カフ技術は人工的な材料を導入し、局所的な炎症を引き起こし免疫学的評価を妨げる可能性があり、小口径血管^5,6においても技術的課題をもたらします。最近、Liaoら¹²は頸部HTにおいてカフフリースリーブ技術を提案し、ドナーと受容者の血管をスリーブ法で直接吻合する方法を提案しました。人工的な材料を避け、小さな血管を収容することで、このアプローチは二次心臓移植のための生理学的かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。

それにもかかわらず、エンドツーエンドの縫合および非縫合カフ技術の両方で、受け手の片側のCCAおよびEJVの永久的な結紮が必要です。これにより片側の脳中枢神経系への血流が妨げられ、方向性障害や片麻痺などの神経学的合併症を引き起こす^{可能性があります。}さらに、これらの端から端へのアプローチは、高速動脈ジェットなどの血行動態の変化を引き起こし、血栓症や狭窄症のリスクを高め、長期的な移植片生存に悪影響を及ぼします。さらに、カフ技術にはカフの存在により血栓症のリスクも伴います。

これらの制約に対処するため、ドナーの上行大動脈とPAをそれぞれ受給者のCCAとEJVに吻合する、洗練された両側の手縫合技術を採用しました。この方法は、受容者の主要な頸血管の完全性と連続性を保ち、正常な脳灌流を維持し、動物研究の3Rs(置換・縮小・精製)原則を遵守します。この技術を用いて、手術成功率は約96.7%(29/30、出血による死亡は1件のみ)に達しました。術後の受容マウスでは脳虚血関連合併症は認められませんでした。この方法は標準的な腹部モデルに非常に似ており、血管縫合の経験を持つ外科医が頸部HTモデルを確立するのに特に適しています。

プロトコル

動物ケアは国際ガイドラインに準拠し、すべての処置は中国華中科技大学同済病院同済医学院臓器移植研究所で行われました。本研究の倫理承認は同済病院動物倫理委員会(承認番号:TJH-202310010)から取得されました。研究に使用される適切な機器は 材料表に記載されています。

1. 術前準備

1. 手術室を紫外線ランプで30分間消毒してください。手術台を70%エタノールで消毒し、すべての手術器具を121°Cで20分間オートクレーブ消毒してください。
2. 成体のオスのC57BL/6およびBALB/cマウス(体重20–25g、生後8〜10週)を使用してください。合成移植には、C57BL/6マウスをドナーおよび受容者の両方として使用します。異種移植の場合は、BALB/cマウスをドナー、C57BL/6マウスを受容体として使用します。
3. 手術の1時間前に、投与マウスにブプレノルフィン(0.05 mg/kg)を皮下注射して術前鎮痛を投与します。
   注意:ドナーマウスには術前鎮痛は行われず、ドナーは心臓摘出手術直後に安楽死されます。
4. ケタミン(20 mg/mL)とキシラジン(2 mg/mL)を含む麻酔液を準備します。マウスを5μL/gの用量で腹腔内注射し、準備済みのケタミン麻酔で麻酔します。呼吸が遅く規則的であること、矯正反射の喪失、足反射の欠如を観察して麻酔の効果を確認しましょう。
5. 胸と腹部の毛を剃りましょう。ネズミを温熱パッドの上で仰向けに固定し、体温を保ちます。手術部位をポビドンヨウ素と70%エタノールを交互に3サイクル消毒します。6-0シルク糸で上切歯を引っ込めて、露出を最適化するために受け手の首を伸ばします。
6. 滅菌手術用手袋を着用してください。無菌のドレープに切開部より少し大きめの楕円形の開口部を作ります。そして、受け取るマウスを覆うために使います。

2. ドナー心臓収穫

1. 腹部の正中線に切開し、その後横(十字形)切開を行い、腹膜腔を完全に露出させます。
2. 生息水で湿らせた滅菌綿棒で小腸を左に優しく引き戻し、腹部大動脈と下腔内括りを露出させます。
3. IVCに0.3 mLのヘパリン化生理食塩水(300 IU/mL)を注射し、全身ヘパリン化を1分間待ちます。腹部大動脈と下腔内腔を切断してドナーを失血させてください。
4. 横隔膜と前胸壁を切開し、胸腔を露出させるためにハサミを使って肋骨にU字型の切開をします。
5. 胸腔内IVCから2mLの冷水生理食塩水(4°C)を心臓に注入し、残留血液を洗い流します。
   注:このステップの主な目的は低体温症を誘発し、心臓の速い鼓動を停止させることです。第二の目的は、特に冠動脈からの血液を心臓から徹底的に排出することです。
6. 心臓を冷たい生理食塩水(4°C)に浸した滅菌ガーゼで覆います。このガーゼを優しく下向きに引っ張ることで、大動脈とPAの最適な露出が可能になります。さらに、冷たい生理食塩水浸しガーゼは、その後の剥離時に移植片の低体温状態を維持する役割を果たします。
7. 胸腔内静脈を特定し、分離してください。6-0シルク縫合糸で結紮し、結紮部位の遠位を顕微ハサミで横断します。
8. 胸腺を特定し、大動脈弓とPAを露出させます。上大静脈を特定し、隔離してください。6-0シルク縫合糸で結紮してください。結紮部の遠位まで横断してください。
9. 昇行大動脈を特定し、隔離してください。無名動脈の近位動脈を切断し、血管長を最大化します。
10. PAを特定し、隔離してください。分岐点のすぐ近くを横断してください。心臓の後方にあるすべての血管(肺静脈)を6-0シルクで結紮します。心臓を慎重にマイクロハサミで切除してください。
11. 心臓を優しく動かし、冷たい生理食塩水(4°C)に浸して氷に置き、移植まで保存します。

3. 受領者操作

1. 受容者血管の分離
   1. 右首の右側に縦に1cmの切開を入れ、右鎖骨の上縁から下顎の下縁まで伸びます。
   2. 下顎下腺の右葉を切除してください。右胸鎖乳突筋を切断し、ドナー心臓の移植に十分なポケットを作ります。
   3. 正しいEJVとCCAを特定し、分離してください。EJVを支部を焼き止めて動員しろ。その後、CCAを周囲の組織から分離します。CCAを解離する際に伴う迷走神経を傷つけないようにしてください。
2. 動脈吻合
   1. 両側の血管末端に1本のクランプを、もう1本を尾端に装着し、同時にEJVとCCAを閉塞します。まず頭蓋クランプを装着し、その後尾部クランプを装着します。
      注意:マイクロ血管クランプは、マウスの右側から左側にかけて導入し、クランプハンドルは右側に設置するのが望ましいです。この向きはその後の血管吻合を容易にし、気管の圧迫を減らすのに役立ちます。
   2. マウスを時計回りに90°回転させます。CCAに縦方向の切開を行い、長さがドナー昇行大動脈の直径と一致するようにしてください。残留血塊を徹底的に除去するために、ヘパリン化生理食塩水で腔内を洗浄してください。
   3. 吻合窓を作るには、11-0縫合糸を使います。針をドナーの血管の直径とほぼ同じ距離で血管壁を通して通し、縫合糸で血管壁を優しく持ち上げ、マイクロハサミで少量を切除します。
   4. ドナー心臓を子宮頸ポケットに入れます。ドナーの上行大動脈を受領側のCCAに固定し、近位端と遠位端に針付きの11-0縫合糸を2本挿入します。ドナー心臓を受領者の右側に位置させ、湿った滅菌ガーゼで覆います。
   5. 遠位縫合を用いて、後壁に遠位から近位方向に6〜8針の連続走行縫合を行います。
   6. 後壁の縫合が終わったら、マウスを180°回転させます。ドナーの心臓を受給者の左側に反射させ、湿った滅菌ガーゼで覆います。吻合を完成させ、前方血管壁を近位から遠位方向に6〜8針縫合します。最後の結び目を結んで気泡を取り除く前に、ルーメンを生理食塩水で洗い流してください。
3. 静脈吻合
   1. EJVに縦方向の切開を入れ、ドナーPAの直径に合わせて行います。残留血塊を徹底的に除去するために、ヘパリン化生理食塩水で腔内を洗浄してください。
   2. ドナーPAを受領側のEJVに固定し、近位端と遠位端に針付きの11-0縫合糸を2本挿入します。
   3. 近位縫合線を用いて、後壁を近位から遠位方向に5〜7針連続で縫合します。
   4. 同じ縫合糸で外側から遠位から近位方向にかけて前壁を5〜7針縫い閉じます。縫合糸は近位先端で結びます。最後の結び目を結んで気泡を取り除く前に、ルーメンを生理食塩水で洗い流してください。
4. 再灌流
   1. まず遠位クランプを外し、続いて近位クランプを外して再灌流を開始します。再灌流後、心臓移植片はすぐに赤くなっているはずです。正常なリズムと収縮は通常1〜2分以内に回復します。
   2. 止血が確認されたら、心臓移植片を皮下ポケット内に慎重に配置し、血管のねじれがないことを確認します。皮膚切開部を5-0縫合糸で閉じます。
5. 術後ケア
   1. ネズミを清潔なケージに入れ、34°Cに設定した乳児インキュベーターに入れて回復を促します。ネズミが自然に目覚めるまで1〜2時間ごとに観察し、その後ケージに戻します。
      注意:再温は低体温による呼吸抑制を防ぎ、麻酔からの回復を促進するために必要です。
   2. 術後48時間は、術後12時間ごとにブプレノルフィン(0.05 mg/kg)皮下注射による術後鎮痛を投与します。
   3. 心臓移植片の脈動を毎日監視し、移植片の生存状況を記録してください。

結果

この改良モデルを用いて30件のケースが実施されました。手術成功率は96.7%(29/30)でした。術中出血による死亡は1例のみでした。残りの29例は手術時間および移植片アウトカムの分析のために含まれました。術後のいかなる受容者にも脳虚血関連合併症は認められませんでした。ドナー心臓採取は6.4分±0.7分で完了し、受領者手術は28.7分±1.2分で完了しました。具体的には、血管準備、動脈吻合、静脈吻合はそれぞれ6.1分±1.4分、8.4分±1.2分、6.1分±1.0分で完了しました(図1)。

29件の成功した移植のうち、16件は同遺伝子(C57BL/6からC57BL/6)、13件が異種移植(BALB/cからC57BL/6)でした。生存分析のために、心臓移植片の脈動を観察して10名の同種受容者と10名の異種受容者を毎日モニタリングしました。 図2に示されているように、合成移植片は正常な収縮リズムと強度...

ディスカッション

エンドツーサイド吻合技術を用いた頸椎HTモデルにはいくつかの利点があります。端から端までの縫合やカフ法と比較して、この方法はCCAとEJVの連続性を完全に維持し、正常な脳血行動態を維持し、脳虚血関連合併症を効果的に回避します。端から側への吻合は、ドナーとレシピエントの血管の直径の不一致による技術的な問題も回避します。腹部型HTと比較して、この方法はマウスへの外傷が少なく、術後の回復も早くなります。したがって、このモデルは遺伝子改変や薬物誘導による生理的条件が悪い実験動物に特に適しています。さらに、二次的なHTや複合臓器移植を必要とする実験では、頸部領域が唯一の可能な部位となります。

腹部のHTと技術的に類似しているものの、頸椎の端から側への吻合には特有の課題があります。腹部移植では手術視野が広く、腹部大動脈と下大静脈が近接しています。頸椎HTでは手術視野が限られており、EJVとCCAは遠く離れているだけでなく、異なる平面上に位置しています。CCAの立場ははるかに深いものです。これらの問題に対処するために、二重クラン...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mLシリンジ	ベクトン・ディッキンソン・メディカル・デバイス株式会社	B309628
11-0縫合針	金環医薬品株式会社	H1101	血管吻合用
3mLシリンジ	ベクトン・ディッキンソン・メディカル・デバイス株式会社	B309657
5-0縫合針	金環医薬品株式会社	CR537	皮膚縫合用
6-0シルクスレッド	金環医薬品株式会社	2650182
止血鉗子	寧波順業医薬品株式会社	BDD-YE-DT-1
ブプレノルフィン	天津製薬研究所医薬品株式会社	H12020275	鎮痛剤
綿棒	福清健康・総合医療	20230R
湾曲マイクロ鉗子	RWDライフサイエンス株式会社	F11031-11	手術用具
湾曲マイクロはさみ	66ビジョンテック株式会社	54108B	手術用具
ガーゼ綿棒	優北医薬品材料株式会社	21080274
ヘパリンナトリウム注射液	北中国製薬株式会社	2101131-2
マイクロ針ホルダー	ワールドプレシジョンインスツルメンツ株式会社	555408NT	手術用具
マイクロ血管クリップ	ロボズ外科器械株式会社	RS-5481T
マイクロ血管クリップアプリケーター	ロボズ外科器械株式会社	RS-5480
針ホルダー	RWDライフサイエンス株式会社	F31025-13	腹部縫合用
生理食塩水	浙江天瑞製薬株式会社	716092103
直マイクロ鉗子	RWDライフサイエンス株式会社	F11029-11	手術用具
外科用顕微鏡	ライカ	M650
手術台			カスタム、磁気
組織鉗子	RWDライフサイエンス株式会社	F12002-12	手術用具
組織はさみ	RWDライフサイエンス株式会社	S12003-09	手術用具

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